Multiplexage avec le microscope confocal FV3000
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Online Version Notes d'application juil. 21 2022 Multiplexage avec le microscope confocal FV3000 Caractérisation morphologique du cortex préfrontal interne de la souris Pour pouvoir étudier les mécanismes de déficience cognitive, il faut être en mesure dʼassocier des modifications morphologiques à des réponses physiologiques. De plus, pour comprendre les effets des différents stades de la maladie et des traitements sur la morphologie cérébrale, il est important de pouvoir identifier les différentes structures morphologiques présentes dans un échantillon. Dans cette étude, un microscope confocal FV3000 muni de détecteurs TruSpectral a été utilisé avec succès pour observer six structures distinctes dans le cortex préfrontal interne de souris : les astrocytes, les neurones pyramidaux, les neurones inhibiteurs, les membranes neuronales, les segments initiaux des axones et les noyaux. Copyright 2022 EVIDENT, All rights reserved. Page 1 / 7
Figure 1 : Spectres dʼémission des six fluorophores utilisés pour marquer les coupes de cortex préfrontal interne de souris. Identification distincte de six structures grâce à la technologie TruSpectral Lors de cette expérience, une coupe fixée de cortex préfrontal interne de souris de 30 µm dʼépaisseur a été marquée au moyen de six fluorophores différents. Des images 3D fluorescentes du tissu cérébral multiplexé ont été acquises au moyen dʼun microscope confocal FV3000 dʼOlympus équipé dʼun objectif UPLSAPO20X. À lʼaide de la détection TruSpectral, les paramètres dʼacquisition et de détection ont été définis individuellement pour chaque fluorophore afin dʼoptimiser la détection des signaux et dʼéviter le risque dʼinterférences entre les spectres. Sur lʼimage obtenue, les signaux pour chaque fluorophore sont intenses avec des profils dʼémission distincts, ce qui a permis la détection précise de plusieurs structures au sein du même échantillon. Copyright 2022 EVIDENT, All rights reserved. Page 2 / 7
Figure 2 : Cortex préfrontal interne de souris avec marquage de GFAP (glial fibrillary acidic protein, marqueur dʼastrocytes, jaune), CaMKII (calmodulin-dependent protein kinase II, marqueur de neurones pyramidaux, rouge), AMIGO-1 (amphoterin-induced protein 1 precursor, marqueur de membranes neuronales, cyan), PV (parvalbumine, marqueur de neurones inhibiteurs, violet), AnkG (ankyrine-G, marqueur de segments initiaux des axones, vert) et le colorant Nuclear Yellow (marqueur nucléaire, bleu). Conditions dʼimagerie Microscope : Microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW FV3000 Objectif : Objectif sans immersion 20x (UPLSAPO20X) Lasers : 405 nm (BV421, Nuclear Yellow), 445 nm (BV480), 488 nm (AF488), 561 nm (AF555) et 640 nm (AF647) Copyright 2022 EVIDENT, All rights reserved. Page 3 / 7
Imagerie haute résolution de structures morphologiques distinctes avec lʼobjectif 100x à immersion Afin dʼobtenir des images de résolution supérieure, une région du cortex préfrontal interne de souris exprimant les six marqueurs a été visualisée avec lʼobjectif 100x à immersion dans lʼhuile de silicone associé aux détecteurs à haute sensibilité TruSpectral. Les images obtenues présentent des signaux intenses et détaillés. La superposition des signaux a permis aux chercheurs dʼobserver clairement la morphologie des différentes populations de neurones au sein du cortex préfrontal interne. (A) (B) Figure 3 : Cortex préfrontal interne de souris avec marquage de GFAP (glial fibrillary acidic protein, marqueur dʼastrocytes, jaune), CaMKII (calmodulin-dependent protein kinase II, marqueur de neurones pyramidaux, rouge), AMIGO-1 (amphoterin-induced protein 1 precursor, marqueur de membranes neuronales, cyan), PV (parvalbumine, marqueur de neurones inhibiteurs, violet), AnkG (ankyrine-G, marqueur de segments initiaux des axones, vert) et le colorant Nuclear Yellow (marqueur nucléaire, bleu). (A) Canaux individuels pour chacun des six fluorophores. (B) Images superposées. Conditions dʼimagerie Microscope : Microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW FV3000 Objectif : Objectif à immersion dans lʼhuile de silicone 100x (UPLSAPO20X) Lasers : 405 nm (BV421, Nuclear Yellow), 445 nm (BV480), 488 nm (AF488), 561 nm (AF555) et 640 nm (AF647) Copyright 2022 EVIDENT, All rights reserved. Page 4 / 7
Lʼapport du microscope confocal FV3000 pour notre expérience Le système entièrement spectral avec détecteurs GaAsP haute efficacité offre la grande sensibilité nécessaire à lʼimagerie multiplexe Lʼobjectif à immersion dans lʼhuile de silicone UPLSAPO100XS crée des images lumineuses de tissus épais Les objectifs super apochromatiques UPLSAPO compensent à la fois les aberrations sphériques et chromatiques et présentent une transmission élevée sur une plage sʼétendant du visible jusquʼau proche infrarouge. Lʼindice de réfraction de lʼhuile de silicone (n≈1,40) est proche de celui du tissu vivant (n≈1,38), ce qui permet dʼeffectuer des observations haute résolution en profondeur dans un tissu vivant avec une très faible aberration sphérique et une morphologie 3D précise. Grossissement : 100X Ouverture numérique : 1,35 (immersion dans lʼhuile de silicone) Distance de travail : 0,2 mm Niveau de correction de lʼaberration chromatique : super apochromatique (SAPO) Utilisation du microscope FV3000 pour caractériser les mécanismes moléculaires de la douleur neuropathique dans le cerveau Commentaire de Stephanie Shiers Copyright 2022 EVIDENT, All rights reserved. Page 5 / 7
Commentaire de Theodore Price
Lʼun des principaux objectifs de notre recherche est de comprendre comment
la douleur neuropathique affecte les structures cérébrales qui sont intimement
impliquées dans le traitement cognitif. Nous savons que les problèmes cognitifs
constituent une comorbidité importante de la douleur neuropathique, mais nous
en savons peu sur les mécanismes moléculaires sous-jacents. Nos travaux sur
le cortex préfrontal de souris ont révélé des modifications subtiles des
segments initiaux des axones en cas de douleur neuropathique. Les images de
la plus haute qualité de lʼultrastructure du cortex préfrontal obtenues avec le
microscope FV3000 nous ont ouvert de nouvelles voies pour comprendre cet
aspect important de la douleur neuropathique.
Remerciements
Cette note dʼapplication a été rédigée avec lʼaide des chercheurs suivants :
Stephanie Shiers, doctorante, Price Lab, Université du Texas à Dallas
Theodore J. Price, Ph. D., Price Lab, professorat Eugene McDermott, directeur,
Center for Advanced Pain Studies, Department of Neurobiology, School of Behavioral and Brain
Sciences, Université du Texas à Dallas
Microscope confocal à balayage laser
FV3000
Disponible en configuration galvanomètre seul
(FV3000) ou hybride galvanomètre / résonant
(FV3000RS)
Nouvelle détection TruSpectral haute efficacité et
grande précision pour tous les canaux
Optimisé pour la prise dʼimages de cellules vivantes
avec une sensibilité élevée et une faible phototoxicité
Inverted and upright frame options to suit a variety of
applications and sample types
En appendre plus ▸ https://www.olympus-lifescience.com/laser-scanning/fv3000/
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Objectifs super apochromatiques
UPLSAPO
Compensent intégralement les aberrations sphériques
et chromatiques de la région du visible jusquʼà la région
du proche infrarouge.
Permettent lʼacquisition dʼimages en fluorescence/en
fond clair lumineuses et de haute résolution dans de
nombreuses applications cliniques.
En appendre plus ▸ https://www.olympus-lifescience.com/objectives/uplsapo-c/
Objectifs super apochromatiques
UPLSAPO-S/UPLSAPO-W
Compensation des aberrations sphériques et
chromatiques et transmission élevée de la région du
visible jusquʼà la région du proche infrarouge.
Indice de réfraction de lʼeau ou de lʼhuile de silicone
similaire à celui de la cellule vivante et très efficace
pour lʼimagerie de cellules vivantes.
En appendre plus ▸ https://www.olympus-lifescience.com/objectives/uplsapo/
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