FormaPure RNA: Mode d'emploi - Beckman Coulter
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Mode d’emploi
FormaPure RNA:
Protocole détaillé d’isolation
de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
PN C21005AC
Mars 2019
Beckman Coulter, Inc.
250 S. Kraemer Blvd.
Brea, CA 92821 U.S.A.FormaPure RNA :
Protocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un
échantillon FFPE
PN C21005AC (Mars 2019)
© 2019 Beckman Coulter, Inc.
Tous droits réservés.
Nous contacter
Pour toute question, veuillez contacter notre Centre
d’assistance client.
• Pour toute question concernant ce protocole, appelez
le support technique de Beckman Coulter au
1-800-369-0333.
• Pour toute information supplémentaire, ou en cas de
réception d’un produit endommagé, contacter le
Service clientèle de Beckman Coulter au
800-742-2345 (Canada ou États-Unis) ou un
représentant Beckman Coulter local.
• Référer à www.beckman.com/techdocs pour les
protocoles mis à jour.
Un glossaire des symboles est disponible sur
www.beckman.com/techdocs (Réf. C05838).
Disponibilité du produit
C19157 — FormaPure RNA, 50 kits de préparation
C19158 — FormaPure RNA, 96 kits de préparation
Retrouvez-nous sur le Web à l’adresse suivante :
www.beckman.com
Beckman Coulter Eurocenter S.A.
22, rue Juste-Olivier
Case Postale 1044
CH - 1260 Nyon 1, Switzerland
Tel: +41 (0) 22 365 36 11
Imprimé aux USAProtocole détaillé d’isolation de l’ARN à
partir d’un échantillon FFPE
Contenu
• Introduction
• Spécifications du kit
• Avertissements et précautions
• Éléments fournis
• Éléments nécessaires mais non fournis
• Aperçu du processus
• Protocole d’isolement de l’ARN
• Guide de dépannage
• Historique des révisions
Introduction
Le kit d’extraction et de purification FormaPure RNA utilise la technologie brevetée
Beckman Coulter SPRI basée sur des billes paramagnétiques pour isoler l’ARN à partir de tissus fixés
au formol et inclus dans la paraffine (FFPE) sans utiliser de xylène. Ce kit a été optimisé pour
l’utilisation des tests de séquençage et des tests PCR en aval. Notamment, l’ARN isolé au moyen du
kit FormaPure RNA est compatible avec les applications en aval suivantes :
• Séquençage ARN
• Extrémité ou qRT-PCR
FormaPure RNA isole l’ARN à partir de sections de tissus totalisant une épaisseur allant jusqu’à
3 × 10 μm. Le protocole peut être réalisé à la fois dans des microplaques de 96 puits (manuellement
et automatiquement) et dans des tubes de 1,5 mL (manuellement uniquement). L’extraction d’acide
nucléique commence avec la solubilisation de la paraffine des coupes de tissus dans des tubes. Une
phase de lyse enzymatique digère le tissu et relâche les acides nucléiques, et effectue délicatement
une déréticulation de l’ARN. La suite du protocole peut être faite dans les microplaques ou les tubes.
Une solution de liaison est ajoutée pour immobiliser les acides nucléiques à la surface des billes
SPRI. Les contaminants sont rincés au moyen d’une simple procédure de nettoyage, l’ADN est
prélevé hors de l’échantillon et l’ARN est à nouveau immobilisé à la surface des billes SPRI avant
l’élution à l’eau.
PN C21005AC 3Protocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Spécifications du kit
Spécifications du kit
Nombre de
Type du kit Numéro de pièce
préparations
Moyen C19158 96
Petit C19157 50
Avertissements et précautions
Lisez et observez les précautions et informations de sécurité suivantes.
IMPORTANT Le symbole indique un risque de sécurité potentiel lié au matériel, aux actions ou à
l’équipement requis pour la réalisation d’une action liée à la procédure ; lorsque vous remarquez le
symbole , revenez à cette section afin de consulter les informations de sécurité pertinentes.
DANGER
Protéinase K
H315 Provoque une irritation cutanée.
H319 Provoque une sévère irritation des yeux.
Peut provoquer des symptômes allergiques ou d’asthme ou des difficultés
H334
respiratoires par inhalation.
H335 Peut irriter les voies respiratoires.
P261 Éviter de respirer les vapeurs.
Porter des gants de protection, des vêtements de protection et un équipement de
P280
protection des yeux/du visage.
Lorsque la ventilation du local est insuffisante, porter un équipement de
P284
protection respiratoire.
EN CAS D’INHALATION : Transporter la personne à l’extérieur et la maintenir dans
P304 + P340
une position où elle peut confortablement respirer.
En cas de symptômes respiratoires : Appeler un CENTRE ANTIPOISON/un
P342 + P311
médecin.
Une fiche technique de sécurité est disponible à www.beckman.com/techdocs.
4 PN C21005ACProtocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Éléments fournis
ATTENTION
Risque de blessures chimiques par la protéinase K. Pour éviter tout contact avec
la protéinase K, porter l’équipement de protection personnel approprié,
comprenant des lunettes de protection, des gants, et les vêtements de laboratoire
appropriés. Avant d’utiliser des produits chimiques, reportez-vous à la fiche
technique santé-sécurité pour plus d’informations sur l’exposition aux produits
chimiques.
ATTENTION
Risque de brûlures par éclaboussures de liquide chaud dans les yeux ou sur la
peau. Porter l’équipement de protection personnel (PPE) approprié lors de
l’intubation les échantillons. Placer les bouchons de fermeture des tubes sur les
tubes pour éviter que ceux-ci ne s’ouvrent pendant l’incubation.
Éléments fournis
Les réactifs suivants sont fournis dans le kit FormaPure RNA. L’icône de chaque réactif est incluse
dans les instructions en tant qu’aide visuelle permettant de garantir l’utilisation du réactif correct.
REMARQUE Se référer aux étiquettes du produit pour les dates de péremption.
Conditions de
Réactif Icône
stockage
Huile minérale 15 à 30 °C
Lyse 15 à 30 °C
Liaison 15 à 30 °C
Nouvelle liaison 15 à 30 °C
Protéinase K - 15 à 30 °C
PN C21005AC 5Protocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Éléments nécessaires mais non fournis
Éléments nécessaires mais non fournis
Les échantillons FormaPure peuvent être traités dans un format microplaque de 96 puits ou un
format tube. Se référer aux tableaux ci-dessous pour connaître les articles nécessaires pour cette
procédure :
• Matériel et accessoires
• Consommables
• Réactifs
Matériel et accessoires
Élément Type
• Thermo-mélangeur avec adaptateur pour tubes 1,5 mL et plaques, et
couvercle chauffé
Source de chauffage Ou
ajustable • Hybex avec adaptateur pour tubes 1,5 mL et plaques
Deux sources de chauffage de tout type sont recommandées pour ce
protocole.
Vortex Non spécifié.
Microfuge 16 de Beckman Coulter
Microcentrifugeuse
ou équivalent.
• Support magnétique pour 6 tubes à essai Agencourt SPRIStand (pour tubes
de 1,5, 1,7, ou 2,0 mL) (Beckman Coulter), Réf. A29182
Aimant de séparation
Ou
des billes
• Aimant à 7 barres V&P Scientific, Réf. VP 771MWZM-1ALT (pour plaque
96 puits)
Consommables
Élément Type
Tubes pour Microfuge 1,5 mL
Bouchons de fermeture des tubes de Microfuge
1,2 mL, ThermoFisher Scientific, Réf. AB1127
Plaque 96 puits
ou équivalent.
Plaque de conservation 200 μL
96 puits
Joints adhésifs de PCR pour plaque 96 puits
6 PN C21005ACProtocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Aperçu du processus
Réactifs
Référence
Élément Fournisseur Nom dans le catalogue
catalogue
Éthanol à 100 %
Éthanol, alcool absolu, 200 proof,
(qualité biologie AmericanBio AB00138
anhydre
moléculaire)a
ThermoFisher
DNase I Ambion DNase I (exempte de RNAse) AM2222 ou AM2224
Scientific
ThermoFisher Eau sans nucléase
Eau sans nucléasea AM9932
Scientific (non traitée au DEPC)
a. Le fournisseur, le nom dans le catalogue et la référence catalogue sont fournis pour cet élément ; si nécessaire, le
produit cité peut être remplacé par un produit équivalent.
Aperçu du processus
1. Déparaffinage 4. Première liaison 7. Nouvelle liaison
2. Digestion du tissu 5. Solution de nettoyage à l’éthanol 8. Solution de nettoyage à l’éthanol
3. Transfert 6. Traitement avec la DNase I 9. Élution
PN C21005AC 7Protocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Protocole d’isolement de l’ARN
Protocole d’isolement de l’ARN
Avant de commencer
• Préchauffer les sources de chauffage ajustables à 80 °C et 60 °C.
• Préparer de l’éthanol à 80 % à partir du stock à 100 % en utilisant de l’eau dépourvue de
nucléases.
IMPORTANT Ne pas utiliser de solution préparée à l’avance, car celle-ci serait susceptible de contenir
un pourcentage moindre d’éthanol, ce qui réduirait le rendement.
IMPORTANT Ce protocole utilise l’éthanol à plusieurs étapes. Éliminer le surnageant contenant les
déchets d’éthanol conformément aux règlements locaux et aux procédures approuvées dans votre
laboratoire.
• Porter l’équipement de protection personnel (PPE) appropriés lorsque vous manipulez les
échantillons et les réactifs.
Procédure
1 Préparation des échantillons :
Pour chaque échantillon, transférer une à trois sections de tissus FFPE de 10 μm dans un tube
de 1,5 mL.
2 Déparaffinage :
a. Ajouter 450 μL d’huile minérale à chaque échantillon et immerger complètement les
sections avec une pointe de pipette.
REMARQUE S’assurer que l’échantillon est intégralement immergé et ne flotte pas du fait de la
présence de bulles.
b. Incuber à 80 °C pendant 5 minutes.
c. Après incubation, vortexer les tubes deux fois, cinq secondes chaque fois, pour solubiliser
la paraffine et homogénéiser le tissu.
8 PN C21005ACProtocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Protocole d’isolement de l’ARN
3 Digestion du tissu :
a. Ajouter 200 μL de lyse à chaque échantillon.
b. Centrifuger les tubes à 10 000 × g pendant 15 secondes. L’huile minérale forme une phase
supérieure distincte.
REMARQUE Incuber les tubes pendant 3 minutes supplémentaires à 80 °C si la couche
d’huile minérale commence à devenir trouble ou si le tissu est coincé à l’interface entre l’huile
minérale et le tampon de lyse. Après l’incubation, veiller à laisser refroidir les tubes pendant
2 minutes avant d’ajouter la protéinase K.
c. Ajouter 20 μL de protéinase K dans la phase inférieure aqueuse et mélanger 10 fois
sans perturber la phase supérieure.
d. Incuber les tubes à 60 °C pendant 120 minutes.
4 Transfert du lysat :
a. Retirer les tubes de la source chauffante et les centrifuger à 10 000 ×g pendant 5 minutes.
b. Transférer l’intégralité du lysat limpide (phase inférieure) dans une plaque 96 puits ou dans
des tubes de 1,5 mL, sans perturber la phase supérieure (huile minérale) ni le culot.
REMARQUE Si les tissus obstruent l’embout de la pipette, centrifuger les tubes une fois
supplémentaire.
REMARQUE Réduire au maximum la quantité d’huile minérale qui est transférée avec le lysat.
Cependant, une petite contamination d’huile minérale n’affecte pas les applications en aval.
5 Première liaison :
a. Resuspendre complètement la solution de liaison en secouant ou en vortexant.
b. Ajouter 300 μL de solution de liaison à chaque échantillon et mélanger 10 fois par
aspiration avec un set de pipette P1000 à 350 μL. Agiter avec précaution pour minimiser
l’apparition de bulles.
c. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
PN C21005AC 9Protocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Protocole d’isolement de l’ARN
d. Placer les échantillons sur l’aimant pendant 10 minutes, et si la solution n’est pas limpide
au bout de 10 minutes, incuber jusqu’à l’obtention d’une solution limpide. En cas
d’utilisation :
• D’une plaque 96 puits, placer les échantillons sur la barre aimantée (plaque).
• Tubes placer les tubes dans un support magnétique pour 6 tubes à essai Agencourt
SPRIStand.
e. Avec les échantillons sur l’aimant, aspirer le surnageant sans perturber les billes. Jeter le
surnageant.
6 Solution de nettoyage à l’éthanol :
a. Retirer les échantillons de l’aimant.
b. Ajouter 750 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à chaque échantillon.
c. À l’aide d’un set de pipette P1000 à 600 μL, mélanger 20 fois par aspiration, ou jusqu’à ce que
les billes soient totalement remises en suspension dans la solution.
d. Placer les échantillons sur l’aimant pendant 3 minutes, et si la solution n’est pas limpide au
bout de 3 minutes, incuber jusqu’à l’obtention d’une solution limpide.
e. Avec les échantillons sur l’aimant, aspirer le surnageant sans perturber les billes. Jeter le
surnageant.
f. Laisser sécher à l’air libre les échantillons sur l’aimant pendant 10 minutes.
7 Traitement avec la DNase I :
a. Retirer les échantillons de l’aimant.
b. Ajouter 80 μL d’eau sans nucléase à chaque échantillon.
c. Ajouter 10 μL de tampon 10× DNase I et 10 μL de DNase I à chaque échantillon.
d. Mélanger 5 fois par aspiration avec un set de pipette P200 à 80 μL afin de répartir
soigneusement le tampon et l’enzyme. Agiter avec précaution pour minimiser l’apparition
de bulles.
e. Couvrir la plaque avec un joint adhésif, ou fermer les tubes, et incuber à 37 °C pendant
20 minutes.
10 PN C21005ACProtocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Protocole d’isolement de l’ARN
8 Nouvelle liaison :
a. Ajouter 150 μL de solution de nouvelle liaison à chaque échantillon et mélanger
10 fois par aspiration avec un set de pipette P200 à 150 μL. Agiter avec précaution pour
minimiser l’apparition de bulles.
b. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
c. Placer les échantillons sur l’aimant pendant 10 minutes, et si la solution n’est pas limpide
au bout de 10 minutes, incuber jusqu’à l’obtention d’une solution limpide.
d. Avec les échantillons sur l’aimant, aspirer le surnageant sans perturber les billes. Jeter le
surnageant.
9 Solution de nettoyage à l’éthanol :
a. Retirer les échantillons de l’aimant.
b. Ajouter 750 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à chaque échantillon.
c. À l’aide d’un set de pipette P1000 à 600 μL, mélanger 20 fois par aspiration, ou jusqu’à ce que
les billes soient totalement remises en suspension dans la solution.
d. Placer les échantillons sur l’aimant pendant 3 minutes, et si la solution n’est pas limpide au
bout de 3 minutes, incuber jusqu’à l’obtention d’une solution limpide.
e. Avec les échantillons sur l’aimant, aspirer le surnageant sans perturber les billes. Jeter le
surnageant.
f. Laisser sécher à l’air libre les échantillons sur l’aimant pendant 10 minutes.
10 Élution :
a. Retirer les échantillons de l’aimant.
b. Ajouter au minimum 40 μL d’eau sans nucléase à chaque échantillon et mélanger 10 fois par
aspiration à l’aide d’un set de pipette P200 à 30 μL ou jusqu’à ce que les billes soient
totalement remises en suspension dans la solution.
c. Fermer les tubes ou couvrir la plaque avec un joint adhésif de PCR et incuber à 60 °C
pendant une minute.
d. Placer les échantillons sur l’aimant pendant 1 minute, et si la solution n’est pas limpide au
bout de 1 minute, incuber jusqu’à l’obtention d’une solution limpide.
e. Avec les échantillons sur l’aimant, transférer le plus possible de surnageant dans la
microplaque de conservation de 96 puits, ou dans un nouveau tube, sans perturber les billes
magnétiques.
f. Stocker à -20 °C, ou à -80 °C pour une conservation à long terme.
PN C21005AC 11Protocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Guide de dépannage
Guide de dépannage
Ce guide de dépannage peut être utile pour optimiser le rendement, l’intégrité et la pureté des
acides nucléiques provenant de tissus FFPE, ou afin de résoudre les problèmes susceptibles de
survenir. L’équipe scientifique de Beckman Coulter est à votre disposition pour répondre à vos
éventuelles questions concernant les informations présentées dans ce guide de dépannage et dans
les protocoles de ce manuel (reportez-vous à Nous contacter à la page 2 pour les coordonnées).
REMARQUE Rendez-vous sur www.Formapure.com pour les vidéos d'instruction et les informations mises
à jour.
Ce chapitre comprend les tableaux suivants :
• Tableau 1, Dépannage en cas de faible rendement
• Tableau 2, Dépannage en cas de qualité médiocre des acides nucléiques extraits
Tableau 1 Dépannage en cas de faible rendement
Problème Solution(s) possible(s) et commentaire(s)
Les processus de fixation au formol, d’inclusion et/ou de conservation dans la
paraffine de tissus FFPE peut endommager les acides nucléiques. Bien que les
Qualité médiocre de
produits FormaPure soient conçus pour optimiser le rendement et l’intégrité
l’échantillon initial
même pour les échantillons FFPE difficiles, ces produits ne peuvent pas réparer
des acides nucléiques endommagés.
• Certains échantillons FFPE peuvent contenir de très faibles quantités de
tissus ou de cellules, selon les types de tissus et de pathologies, et la
quantité d’acides nucléiques avant extraction peut être naturellement
Faible quantité initiale faible. Si possible, augmenter la quantité d’échantillons FFPE pour obtenir
de tissus ou qualité de le rendement souhaité.
tissus médiocre • Certains types de tissus sont plus difficiles à digérer que d’autres. Une
incubation prolongée dans une solution de Digestion du tissu peut être
effectuée (pour les isolements d’ADN uniquement) afin de libérer une plus
grande quantité d’acides nucléiques.
12 PN C21005ACProtocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Guide de dépannage
Tableau 1 Dépannage en cas de faible rendement
Problème Solution(s) possible(s) et commentaire(s)
• La perturbation du culot de billes lors du retrait du surnageant peut
entraîner des rendements faibles. L’embout de pipette ne doit pas entrer
en contact avec le culot lors des aspirations. Si une couleur marron est
observée dans l’embout de la pipette lors de l’aspiration, les billes sont
présentes et la solution doit être redistribuée dans le tube ou le puits. Placer
à nouveau les échantillons sur l’aimant jusqu’à ce que la solution soit
totalement claire et laisser les billes aller vers l’aimant avant d’aspirer à
nouveau.
• Une élimination insuffisante des billes lors de la séparation magnétique
Perte de peut entraîner des rendements faibles. Veiller à ce que les billes se soient
billes/d’échantillon complètement déposées en direction de l’aimant et que le surnageant soit
limpide avant de retirer celui-ci.
• Des tissus non digérés peuvent bloquer les billes et empêcher leur liaison
efficace avec les acides nucléiques, ou entraîner une perte de billes ou
d’échantillon. Les tissus doivent être pleinement digérés dans la solution de
Digestion du tissu avant l’ajout des billes. Si des tissus non digérés
subsistent après l’étape de Digestion du tissu, éviter de transférer des
tissus non digérés vers un autre tube ou un autre puits avant de passer à
l’étape de Liaison. Pour plus d’informations, consulter la section Digestion
incomplète du tissu ci-dessous.
Si les tissus n’ont pas été complètement digérés après 3 heures, des
incubations prolongées dans une solution de Digestion du tissu peuvent être
effectuées (pour les isolements d’ADN uniquement). Si un temps de Digestion
du tissu prolongé n’est pas souhaitable, ou lors de la réalisation d’isolement
d’ARN, éviter de transférer des tissus non digérés. Les échantillons peuvent
Digestion incomplète
être centrifugés pendant 5 minutes à 10 000 ×g, et seul le surnageant doit
du tissu
être transféré en vue des étapes suivantes. Les échantillons peuvent être
centrifugés à nouveau pendant 5 minutes à 10 000 × g si les tissus n’ont pas
formé un culot au fond du tube ou du puits. Si la présence de petits morceaux
de tissu est inévitable au cours du transfert, ceux-ci seront éliminés avec les
autres contaminants au cours des étapes de Nettoyage du protocole.
• L’application de températures supérieures à celles recommandées
pendant les étapes de Digestion du tissu et de Déréticulation peut
provoquer la dégradation des acides nucléiques, en particulier de l’ARN.
Vérifier que la température de la source chauffante est exacte et ne fluctue
pas de manière significative.
• Il est important de veiller à la précision des températures d’incubation tout
au long de ce protocole afin d’obtenir des performances chimiques
optimales. Vérifier que les sources chauffantes soient calibrées et
Températures
fonctionnent correctement, et régler les paramètres des sources
d’incubation imprécises
chauffantes de manière à maintenir les températures internes des
puits/tubes spécifiées.
• Bien que 5 minutes à 80 °C soient censées être suffisantes pour retirer
toute la paraffine lors de l’étape de Déparaffinage, il est possible que des
incubations plus longues soient nécessaires selon l’âge, le processus
d’inclusion et le type de paraffine utilisé. Nous recommandons d’incuber les
échantillons à 80 °C pendant 3 minutes supplémentaires, même si vous
avez déjà ajouté le tampon de lyse, mais avant l’ajout de protéinase K.
PN C21005AC 13Protocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Guide de dépannage
Tableau 1 Dépannage en cas de faible rendement
Problème Solution(s) possible(s) et commentaire(s)
Les périodes d’incubation ont été optimisées de manière à équilibrer le
Périodes d’incubation
meilleur rendement possible et la qualité de l’échantillon extrait. Sauf
inexactes ou
indication contraire mentionnée dans le guide de dépannage, il n’est pas
insuffisantes
recommandé de s’écarter des périodes d’incubation mentionnées.
En fonction de la cause à l’origine de l’éluant trouble, il peut ou non y avoir un
impact sur la fonctionnalité en aval des acides nucléiques extraits.
Causes n’appelant pas à une action :
• Le prélèvement d’une trop grande quantité d’huile minérale lors du
transfert du lysat et des étapes de Nettoyage peut rendre les éluants
troubles. Il convient de minimiser la quantité d’huile minérale transférée au
cours de ces étapes. Cependant, si de l’huile minérale est transférée, elle
peut être retirée lors des étapes de Nettoyage ultérieures. L’huile minérale
restant toujours au-dessus des solutions de nettoyage, l’aspiration du
surnageant à partir du dessus assure le retrait complet de l’huile minérale.
• Certains tissus sont riches en lipides et peuvent provoquer des éluants
Éluants troubles
troubles. Des éluants troubles dus aux lipides n’affectent généralement pas
la fonctionnalité dans la plupart des applications effectuées en aval.
Causes devant être résolues :
• S’assurer que toute la paraffine est solubilisée après l’étape de
Déparaffinage. Un tissu intégralement déparaffiné doit être immergé
complètement dans la couche inférieure du lysat après centrifugation. Voir
Paraffine en excès/déparaffinage insuffisant ci-dessous.
• Veiller à effectuer les étapes de nettoyage de manière correcte et
suffisante. Les éluants troubles n’affectent généralement pas la
fonctionnalité dans la plupart des applications en aval, mais peuvent
entraîner des rendements faibles suite à une digestion inefficace des tissus.
• Voir Billes desséchées ci-dessous.
• Nettoyage et retrait d’impuretés insuffisants. Veiller à effectuer de manière
Agglutination des billes suffisante les étapes de Nettoyage. Visionner le film afin de mieux
comprendre la bonne technique de nettoyage.
• Voir Digestion incomplète du tissu ci-dessus.
L’éthanol est hygroscopique et peut subir une dilution avec le temps ; l’éthanol
Pourcentage erroné à 80 % doit être préparé juste avant son utilisation. Des concentrations
d’éthanol utilisé inférieures d’éthanol peuvent augmenter la solubilisation des acides
nucléiques lors des étapes de Nettoyage.
Après ajout du tampon de lyse et centrifugation ultérieure, vérifier que le tissu
est totalement immergé dans la couche inférieure du lysat. Si la paraffine n’est
Paraffine en
pas complètement dissoute, les tissus peuvent avoir tendance à migrer vers la
excès/déparaffinage
couche d’huile minérale même après centrifugation. Si ce phénomène se
insuffisant
produit, replacer les échantillons à 80 °C pendant 3 minutes supplémentaires
avant d’ajouter la protéinase K.
Veiller à transférer l’intégralité du lysat, y compris le précipité blanc susceptible
Transfert incomplet du
de se former à l’interface. L’inclusion d’une partie de l’huile minérale est
lysat
acceptable, si cela permet de transférer l’intégralité du lysat.
14 PN C21005ACProtocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Guide de dépannage
Tableau 1 Dépannage en cas de faible rendement
Problème Solution(s) possible(s) et commentaire(s)
Veiller à ne pas dessécher les billes suite aux étapes de Nettoyage à l’éthanol.
Billes desséchées Si le culot de billes se craquèle, cela indique un dessèchement excessif et il
convient de procéder à l’étape suivante immédiatement.
S’assurer d’employer le temps et la température recommandés pendant
Élution incomplète l’étape d’Élution afin d’éluer complètement les acides nucléiques hors des
billes.
• Différents types de plastique peuvent présenter un taux variable de
transfert de chaleur à des températures d’incubation inattendues dans les
puits.
Utilisation de plaques
• Différents types de plastique peuvent provoquer des variations de l’impact
ou de tubes non
du champ magnétique appliqué aux billes paramagnétiques.
recommandés
• Régler les paramètres des sources chauffantes de manière à maintenir les
températures internes des puits/tubes et les temps de sédimentation
spécifiés lors des étapes de séparation des billes.
Le développement des produits FormaPure a été effectué avec les aimants
mentionnés spécifiquement à la section Matériel et accessoires. En cas
Utilisation d’un aimant d’utilisation d’un aimant non recommandé, les temps de sédimentation
non recommandé peuvent varier. Régler les temps de sédimentation lors des étapes de
séparation des billes ; le surnageant doit être limpide et le culot doit être visible
sur la paroi latérale du tube ou du puits.
Tableau 2 Dépannage en cas de qualité médiocre des acides nucléiques extraits
Problème Solution(s) possible(s) et commentaire(s)
• Les processus de fixation au formol, d’inclusion et/ou de conservation dans
la paraffine de tissus FFPE dégrade les acides nucléiques.
• Si les acides nucléiques sont plus dégradés que prévu, utiliser des
Les acides nucléiques
techniques stériles afin de s’assurer que la DNAse et la RNAse ne sont pas
paraissent dégradés
une source de contamination durant les processus d’isolement.
• Stocker les acides nucléiques à -20 °C, ou à -80 °C pour une conservation à
long terme.
• Utiliser des techniques stériles afin de s’assurer que la DNAse et la RNAse
ne sont pas une source de contamination durant les processus d’isolement.
Contamination par • Les embouts de filtres doivent être utilisés pour les flux de travail ARN afin
RNAse et/ou DNAse d’éviter la contamination des sources de tampon.
• Si toutes les sources de contamination ont été écartées, remplacer les
réactifs.
Alors que la RNAse A est active dans les lysats d’échantillons contenant des
débris cellulaires et des composants de tampon de lyse, ces composants
Contamination de l’ADN inhibent l’activité de la DNAse. S’assurer que les nettoyages à l’éthanol sont
par de l’ARN effectués correctement avant les traitements à la DNAse, et retirer tant que
possible l’éthanol car la présence d’éthanol en excès peut prévenir l’activité de
la DNAse.
PN C21005AC 15Protocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Historique des révisions
Tableau 2 Dépannage en cas de qualité médiocre des acides nucléiques extraits
Problème Solution(s) possible(s) et commentaire(s)
Veiller à ce que les températures sont appropriées à une activité totale des
Contamination de l’ARN
nucléases : Les traitements à la RNAse A doivent être réalisés à température
par de l’ADN
ambiante et les traitements à la DNase I doivent être réalisés à 37 °C.
• Veiller à effectuer les étapes de Nettoyage de manière correcte et
suffisante. Visionner le film afin de mieux comprendre la bonne technique
de nettoyage.
• L’éthanol résiduel doit être retiré et/ou séché à l’air avant de procéder aux
étapes suivantes.
• Lors des étapes de retrait du surnageant après la séparation magnétique,
veiller à retirer la quantité maximale de surnageant possible sans perturber
Faibles performances
les billes.
dans les tests en aval
• Certains tissus plus fibreux forment des liaisons croisées plus massives ou
plus resserrées lors de la fixation, et des incubations de Déréticulation
plus longues peuvent accroître la fonctionnalité des acides nucléiques. Pour
les isolements d’ADN, les incubations de Déréticulation peuvent être
effectuées au maximum pendant 3 heures à 80 °C. Nous ne
recommandons pas de prolonger les incubations de Déréticulation pour
les isolements d’ARN car ceci est susceptible de trop dégrader l’ARN.
Historique des révisions
Consultez le site www.beckman.com/techdocs télécharger le manuel le plus récent pour ce produit.
• Première édition AA, 1/2018
• Révision AB, 8/2018
Les sections suivantes ont été mises à jour :
— Aperçu du processus
— Guide de dépannage
— Modifications mineures du formatage.
• Révision AC, 2/2019
Les sections suivantes ont été mises à jour :
— Éléments fournis
16 PN C21005ACProtocole détaillé d’isolation de l’ARN à partir d’un échantillon FFPE
Historique des révisions
PN C21005AC 17www.beckman.com
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