SimplexaTM Dengue REF MOL3100
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SimplexaTM Dengue
REF MOL3100
Rev. C
Un test de RT-PCR en temps réel conçu pour la détection
in vitro et l'identification des sérotypes 1, 2, 3 et 4 du virus
de la dengue.
Pour diagnostic in vitro
APPLICATION
TM
Le test Simplexa Dengue de Focus Diagnostics par réaction en chaîne par polymérase en temps réel après transcription
inverse (RT-PCR) est conçu pour fonctionner sur l'appareil « Integrated Cycler » de 3M pour la détection in vitro et l'identification
des sérotypes 1, 2, 3 et 4 du virus de la dengue dans le sérum humain.
RÉSUMÉ EXPLICATIF
La dengue (DF) est une maladie virale aiguë spontanément résolutive caractérisée par de la fièvre, des céphalées, des douleurs,
une éruption cutanée, une lymphadénopathie et une prostration. Les patients atteints de la forme la plus sévère, la dengue
hémorragique (DH), souffrent d'une forte fièvre et d'une insuffisance rénale entraînant le syndrome de choc de la dengue (DDS),
1
souvent mortel . On estime qu'environ 2 milliards de personnes dans le mode ont un risque de contracter la dengue,et que
2,3
jusqu'à 100 millions sont infectés chaque année. En considérant en outre les centaines de milliers de cas de DSS, cela fait de
4
la dengue la plus importante maladie dans le monde causée par des arbovirus.
La dengue hémorragique a été reconnue pour la première fois dans les années 1950 au cours d'épidémies de dengue aux
Philippines et en Thaïlande. En 1970, neuf pays avaient déjà subi une épidémie de dengue hémorragique ; à l'heure actuelle ce
nombre a non seulement plus que quadruplé, mails il continue à croître. Aujourd'hui, les nouveaux cas de dengue hémorragique
provoquent des épidémies de dengue dans les Amériques, et la dengue hémorragique est une cause majeure d'hospitalisation et
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de décès chez les enfants dans plusieurs pays d'Asie, où les quatre virus de la dengue sont désormais endémiques.
Le virus de la dengue (DV) est un virus à ARN simple brin de la famille des flavivirus, étroitement apparenté au virus de la fièvre
jaune, au virus de l'encéphalite japonaise et à d'autres Arbovirus de groupe B. Il existe quatre souches du virus de la dengue,
chacune étant distincte du point de vue sérologique. L'infection par une souche ne protège pas l'hôte contre l'infection par les
autres souches. En fait, un rapport indique que la dengue hémorragique et le syndrome de choc dû à la dengue surviendraient
6
plus souvent chez des individus préalablement infectés par une autre souche. La présence dans la circulation d'anticorps anti-
6
DV non neutralisants à réaction croisée pourrait agir comme un facteur immunitaire facilitateur de l'infection. Cependant, les
anticorps non neutralisants à réaction croisée contre d'autres flavivirus que le DV ne sont pas associés à une potentialisation
6
immunitaire de l'infection.
Le virus de la dengue peut être transmis partout où les moustiques vecteurs Aedes aegypti et Aedes albopictus sont présents. A.
4
aegypti se trouve principalement en Amérique tropicale et subtropicale, et est indigène dans le sud des États-Unis. Le vecteur
principal de la dengue en Asie est A. albopictus. Des infections contractées localement ont récemment été observées à Key West
7
et dans le comté de Miami-Dade en Floride
Des cas de dengue présumés sur la base de l'anamnèse ont été diagnostiqués à l'aide de méthodes sérologiques. Des anticorps
de type immunoglobuline G (IgG) et M (IgM) sont habituellement tous deux détectés dans le sérum des patients présentant des
infections primaires aiguës, tandis que dans les cas de dengue secondaire la réponse des IgM tend à être faible ou même
8
absente . En outre, une réaction croisée importante existe parmi les membres de la famille des flavivirus. Par conséquent, la
réponse des anticorps à une dengue aiguë peut être difficile à interpréter si les infections par d'autres flavivirus ne peuvent pas
être éliminées par des moyens cliniques, épidémiologiques ou biologiques. Des méthodes de détection du virus de la dengue par
RT-PCR en temps réel dans le sang des patients ont été récemment développées. La détection de l'ARN du virus de la dengue
par réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse (RT-PCR) dans des échantillons de sérum humain est
9
fortement révélatrice d'une dengue aiguë. Le virus de la dengue peut être détecté dans le sang (sérum) des patients au cours
10
des cinq premiers jours de symptômes, environ.
PRINCIPES DE LA PROCÉDURE
Le test consiste en une RT-PCR en temps réel qui différencie les sérotypes 1 et 4 dans une réaction (un puits) et les sérotypes 2
et 3 dans une autre réaction (un autre puits). Le test comporte deux étapes principales : (1) extraction de l'ARN des échantillons
et (2) amplification de l'ARN extrait à l'aide de sondes-amorces fluorescentes bifonctionnelles et d'amorces inverses. Le test
amplifie quatre régions spécifiques du sérotype : dengue 1 (gène NS5), dengue 2 (gène NS3), dengue 3 (gène NS5) et dengue 4
Simplexa™ Dengue Page 2
(gène de capside). Un contrôle interne de type ARN est utilisé pour contrôler le processus d'extraction et pour détecter une
inhibition de la PCR.
MATÉRIELS FOURNIS
Le kit Simplexa Dengue contient suffisamment de réactifs pour déterminer le sérotype de 100 échantillons.
Libellé du kit
Nom du composant RÉF. SYMBOLE CE Nom abrégé Couleur Nombre Réactions Volume
SUR du de par par
L'ÉTIQUETTE bouchon flacons flacon/kit flacon
Simplexa Dengue 1 & 4 Primer Mix MOL3101 REAG A PM Brun 2 50/100 30 µl
Simplexa Dengue 2 & 3 Primer Mix MOL3102 REAG B PM Violet 2 50/100 30 µl
HS Master Mix MOL9060 REAG C MM Vert 4 50/200 200 µl
RT Mix MOL9103 REAG D RT Jaune 2 100/200 50 µl
Simplexa RNA Internal Control MOL2004 CONTROL IC IC Bleu 2 50/100 250 µl
Simplexa Dengue Molecular Control MOL3103 CONTROL + MC Rouge 2 4/8 800 µl
Description du composant
Composant du kit Description
Amorces fluorescentes marquées spécifiques pour la détection de l'ARN de dengue de sérotype 1, de
l'ARN de dengue de sérotype 4 et du contrôle interne.
Fluorophore
Cible de la sonde Excitation Émission Gène ciblé
Marqueur (colorant)
Simplexa Dengue 1 & 4 Primer Mix Dengue 1
FAM 495 nm 520 nm Gène NS5
(PM) (Mélange d'amorces Simplexa (DV1)
Dengue 1 & 4
Dengue 4 gène de
CFR610 590 nm 610 nm
(DV4) capside
Contrôle interne
Q670 644 nm 670 nm S/O
(ARN IC)
Amorces fluorescentes marquées spécifiques pour la détection de l'ARN de dengue de sérotype 2, de
l'ARN de dengue de sérotype 3 et du contrôle interne.
Fluorophore
Cible de la sonde Excitation Émission Gène ciblé
Marqueur (colorant)
Dengue 3
Simplexa Dengue 2 & 3 Primer Mix FAM 495 nm 520 nm Gène NS5
(DV3)
(PM) (Mélange d'amorces Simplexa
Dengue 2 & 3
Dengue 2
CFR610 590 nm 610 nm Gène NS3
(DV2)
Contrôle interne
Q670 644 nm 670 nm S/O
(ARN IC)
HS Master Mix (MM) (Mélange
ADN polymérase, tampon et dNTP
maître HS
Simplexa™ RNA Internal Control
(RNA IC) (Contrôle interne de type Matrice d'ARN encapsulé.
ARN Simplexa
Simplexa™ Dengue Molecular
Control (MC) (Contrôle moléculaire Virus de la dengue inactivé de sérotypes 1, 2, 3 et 4.
Simplexa Dengue
RT Mix (RT) (Mélange RT Transcriptase inverse, tampon.
MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI
1. Integrated Cycler de 3M avec le logiciel Integrated Cycler Studio version 4.2 ou plus récente
2. Universal Discs utilisables sur l'Integrated Cycler
3. Sceau pour Universal Discs
4. Eau sans nucléase (recommandée comme Contrôle sans matrice [NTC])
5. Micropipette(s) monocanal, multicanaux et/ou à répétition ayant une plage de précision de 1 à 10 µl, 10 à 100 µl et 100 à
1 000 µl
6. Système Roche MagNA Pure LC et consommables associés.
7. Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche, num. cat. 3038505001)
Simplexa™ Dengue Page 3
8. Bloc de chargement pour Universal Disc
9. Congélateur (dégivrage manuel) entre -10 °C et -30 °C (pour stockage des composants congelés du kit)
10. Congélateur (dégivrage manuel) entre -10 °C et -30 °C (pour stockage des échantillons congelés, si nécessaire)
11. Réfrigérateur à 2-8 °C (pour composants du kit décongelés)
12. Enceinte de sécurité (hotte à flux laminaire) pour les extractions
13. Microcentrifugeuse
14. Vortex
15. Embouts antiaérosols, stériles, jetables, sans ARNase/ADNase de micropipetteur.
16. Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml en polypropylène et portoirs (des tubes sans ARNase/ADNase sont recommandés
mais non exigés).
17. Gants à usage unique, non poudrés
18. Portoirs de glacière pour tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml
DURÉE DE CONSERVATION ET MANIPULATION
1. Conservez les réactifs à une température comprise entre -10 et -30 °C (ne pas utiliser de congélateur sans givre).
2. Ne pas utiliser les kits ou les réactifs au-delà de leur date limite d'utilisation.
3. Laissez les Mélanges d'amorces, le Mélange maître HS, le Contrôle moléculaire et le Contrôle interne de type ARN
décongeler à température ambiante (à une température comprise approximativement entre 18 °C et 25 °C) avant utilisation.
4. Après addition du Mélange RT, utilisez les mélanges réactifs dans l'heure qui suit.
5. Si un délai est nécessaire entre la préparation des mélanges réactifs et la mise en place de la PCR, conservez les mélanges
réactifs entre 2 et 8 °C jusqu'au moment de la mise en place (dans l'heure qui suit).
6. Remettez le Mélange RT au congélateur (-10 à -30 °C) après chaque utilisation jusqu'à la date limite d'utilisation.
7. Une fois décongelés, conservez les Mélanges d'amorces, le Mélange maître HS, le Contrôle moléculaire et le Contrôle
interne à une température de 2 °C à 8 °C pendant un maximum de 30 jours.
8. Ne recongelez pas les Mélanges d'amorces, le Mélange maître HS, le Contrôle interne de type ARN ou le Contrôle
moléculaire.
9. Ne combinez pas les réactifs provenant de différents lots de kits.
MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS
1. Respectez les précautions habituelles. Tous les échantillons à tester et les Contrôles moléculaires doivent être considérés
comme potentiellement infectieux et manipulés en conséquence.
2. Portez un équipement individuel de protection comme (mais non limité à) des gants et une blouse de laboratoire lors de la
manipulation des réactifs du kit. Lavez-vous soigneusement les mains quand vous avez fini le test.
3. Ne pas pipeter à la bouche.
4. Ne pas fumer, boire, manger, manipuler des lentilles de contact ou se maquiller dans les zones où des réactifs de kits et/ou
des échantillons d'origine humaine sont utilisés.
5. Éliminez les réactifs de kits non utilisés ainsi que les échantillons à tester conformément aux règlements locaux, nationaux et
fédéraux.
6. Dans le laboratoire, le flux de travail doit progresser dans une seule direction en commençant dans les zones de
préamplification et en allant vers la zone d'amplification/détection. Vous trouverez ci-dessous la séquence des événements
qui se déroulent depuis l'extraction de l'échantillon jusqu'à l'amplification par PCR en temps réel :
• Commencez par l'extraction de l'échantillon, suivie par le réglage de l'appareil de PCR en temps réel, la préparation des
réactifs et, finalement, l'amplification par PCR en temps réel.
• N’utilisez pas de fournitures et d'équipement indifféremment dans les zones dédiées à l'extraction des échantillons et à leur
préparation. Il n'est pas recommandé de faire des déplacements croisés entre les différentes zones.
• Les fournitures et l'équipement utilisés pour la préparation de l'échantillon ne doivent pas servir aux activités de préparation
du réactif, ni au traitement de l'ADN amplifié ou d'autres sources d'acides nucléiques cibles.
• Toutes les fournitures et l'équipement d'amplification doivent être conservés en permanence dans la zone de l'appareil de
PCR en temps réel.
• L'équipement individuel de protection, comme les blouses de laboratoire et les gants jetables, doit être réservé à la zone
de travail.
7. La contamination des échantillons à tester ou des réactifs peut aboutir à des résultats erronés. Utilisez des techniques
respectant les règles d'asepsie.
8. Pipetez et manipulez les réactifs avec prudence pour éviter de mélanger les échantillons de puits contigus.
9. Utilisez des techniques de pipetage correctes et conservez le même schéma de pipetage tout au long de la procédure pour
garantir l'obtention de valeurs optimales et reproductibles.
10. Ne substituez pas ou ne mélangez pas des réactifs de différents lots de kits ou avec des réactifs d'autres fabricants.
11. N'intervertissez pas les bouchons des tubes de réactifs. Cela pourrait provoquer une contamination et compromettre les
résultats des tests.
12. Des écarts par rapport au présent protocole ou l'utilisation de temps et de températures autres que ceux indiqués pourraient
aboutir à des résultats erronés.
13. L’organisation d’un test doit être effectuée à température ambiante (entre 18 °C et 25 °C, environ). Pendant le mélange des
réactifs, maintenez les enzymes au froid en utilisant un bloc réfrigérant.
14. Ne réutilisez pas des Universal Discs qui ont été déjà exposés à des échantillons à tester ou à des réactifs.Simplexa™ Dengue Page 4
15. Éliminez le disque utilisé sans détacher ou enlever l'adhésif qui le recouvre.
16. Si différents kits ou lots Simplexa sont installés sur un même disque, il est recommandé de tester les Contrôles moléculaires
de chaque kit.
17. Le Mélange maître HS et le Mélange RT contiennent plus de 1 % de glycérol, ce qui pourrait produire des irritations après
inhalation ou contact avec la peau. Les mesures de premiers secours doivent être prises en cas d'inhalation ou de contact
avec la peau.
18. Il n’est pas recommandé de conserver pendant une période prolongée des échantillons à une température comprise entre 2
et 8 °C ; la performance du test n’a pas été déterminée dans ces conditions.
MODE D'EMPLOI
A. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS
Le type d'échantillon acceptable est le sérum. Les échantillons sanguins doivent être prélevés de manière aseptique par du
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personnel qualifié, utilisant des techniques approuvées de ponction veineuse. Laissez les échantillons sanguins coaguler à
température ambiante avant de les centrifuger pour séparer le sérum. Pour la conservation, transférez le sérum dans un
récipient étanche stérile de manière aseptique.
Le sérum séparé ne doit pas être gardé à température ambiante pendant plus de 8 heures. Si le test n'est pas programmé
dans les 8 heures, réfrigérez l'échantillon entre 2 et 8 °C. Si le test n'est pas programmé dans les 24 heures, ou pour
l'expédition des échantillons, congelez à une température inférieure ou égale à –20 °C. Évitez de congeler/décongeler
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plusieurs fois les échantillons. Décongelez et mélangez soigneusement les échantillons avant l'utilisation
B. EXTRACTION DES ÉCHANTILLONS
Extraction selon la méthode Roche MagNA Pure LC
1. Les acides nucléiques sont extraits des échantillons du patient et des contrôles du test grâce au kit d'acide nucléique
total Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid et de l'appareil d'extraction automatisé Roche MagNA Pure LC Automated
Nucleic Acid Extractor. Reportez-vous au mode d’emploi du fabricant pour l'extraction des acides nucléiques au moyen
de ce kit.
2. Dans le menu déroulant « Protocol » (Protocole) du système MagNA Pure LC, sélectionnez dans la liste « Total NA »
(acides nucléiques totaux), puis « Total NA Variable_elution_volume.blk ». Cela chargera les réglages appropriés pour le
test.
3. Le protocole de l’échantillon doit être : « Total NA Variable_elution_volume ».
4. Le volume de l’échantillon doit être réglé à 200 µl et le volume d’élution doit être réglé à 50 µl.
5. Le volume de dilution doit être réglé à zéro pour tous les échantillons.
6. Assurez-vous que le protocole post élution est réglé sur « None » (aucun).
7. Assurez-vous que les échantillons et les contrôles sont dans le bon emplacement de la cartouche d'échantillons.
8. Passez chaque échantillon et le Contrôle moléculaire au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour
recueillir le contenu dans le fond des tubes.
9. Pipetez 200 µl de chaque échantillon, Contrôle moléculaire (MC) ou Contrôle sans matrice dans l'emplacement
correspondant de la cartouche d'échantillons.
10. Vérifiez visuellement le niveau des échantillons et des contrôles dans la cartouche d'échantillons afin de s'assurer que
les échantillons ont été ajoutés.
11. Passez 2 fois au Vortex à pulsations le contrôle interne de type ARN et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu
dans le fond du tube.
12. Pipetez 5 µl du Contrôle interne de type ARN dans chaque échantillon et dans tous les puits de contrôle. Changez
d'embout entre les échantillons.
13. Transférez la cartouche d'échantillons contenant les échantillons dans l'extracteur automatisé d'acides nucléiques
MagNA Pure LC et commencez la procédure d'extraction.
14. Lorsque l'extraction de l'acide nucléique est terminée, la cartouche contenant les contrôles et échantillons de patients
extraits peut être retirée de l'appareil MagNA Pure et scellée. Conservez l’ARN extrait à une température de 2 à 8 °C
avant utilisation. Une conservation prolongée des échantillons extraits à cette température n'est pas recommandée.
Gardez les échantillons d'ARN extraits sur glace pendant le chargement du disque.
C. CONFIGURATION DE L'APPAREIL DE PCR EN TEMPS-RÉEL
1. Reportez-vous au Guide de l'utilisateur de l'Integrated Cycler pour plus de détails sur la façon de configurer le logiciel
Integrated Cycler Studio pour ajouter une définition de tests, régler une série de tests et analyser les séries sur
l'Integrated Cycler.
Remarque : Il y a deux code-barres distincts pour ce test, l'un contenant la définition du test pour les
sérotypes 1 et 4 de la dengue et l'autre contenant la définition du test pour les sérotypes 2 et 3 de la
dengue. Deux segments d'exécution sont nécessaires pour obtenir les résultats des quatre sérotypes.Simplexa™ Dengue Page 5
Disposition conseillée du disque – 2 segments sont nécessaires pour ce test
Rayon 1 Rayon 2 Rayon 3 Rayon 4 Rayon 5 Rayon 6 Rayon 7 Rayon 8 Rayon 9 Rayon 10 Rayon 11 Rayon 12
A MC S8 S16 S24 S32 S40 MC S8 S16 S24 S32 S40
B S1 S9 S17 S25 S33 S41 S1 S9 S17 S25 S33 S41
C S2 S10 S18 S26 S34 S42 S2 S10 S18 S26 S34 S42
D S3 S11 S19 S27 S35 S43 S3 S11 S19 S27 S35 S43
E S4 S12 S20 S28 S36 S44 S4 S12 S20 S28 S36 S44
F S5 S13 S21 S29 S37 S45 S5 S13 S21 S29 S37 S45
G S6 S14 S22 S30 S38 S46 S6 S14 S22 S30 S38 S46
H S7 S15 S23 S31 S39 NTC S7 S15 S23 S31 S39 NTC
Légende :
= Mélange réactif pour dengue 1 et 4
= Mélange réactif pour dengue 2 et 3
D. ZONE DE PRÉPARATION DES RÉACTIFS
Zone dédiée à la préparation du mélange réactif du test de la dengue.
1. Décongelez les Mélanges d'amorces et le Mélange maître HS à température ambiante (entre environ 18 °C et 25 °C).
Avant chaque utilisation, mélangez les composants du kit Mélange d'amorces, Mélange maître HS et Mélange RT par
pipetage (6 à 8 fois) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube.
2. Préparez le volume requis de chaque Mélange réactif dans un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de taille
appropriée par pipetage du volume de chaque composant.
Volumes du mélange réactif – Mélange réactif pour dengue 1 et 4
Mélange réactif Mélange réactif
Réactif
Volume / 1 réaction Volume / 10 réactions
Mélange maître HS (Master 4,0 µl
40 µl
Mix)
Mélange d'amorce Simplexa
0,5 µl 5 µl
Dengue 1 & 4 (Primer Mix)
RT 0,5 µl 5 µl
Volume total 5,0 µl 50 µl
Volumes du mélange réactif – Mélange réactif pour dengue 2 et 3
Mélange réactif Mélange réactif
Réactif
Volume / 1 réaction Volume / 10 réactions
Mélange maître HS (Master
4,0 µl 40 µl
Mix)
Mélange d'amorce Simplexa
0,5 µl 5 µl
Dengue 2 & 3 (Primer Mix)
RT 0,5 µl 5 µl
Volume total 5,0 µl 50 µl
3. Mélangez doucement chaque mélange réactif par pipetage (8 à 10 fois).
4. Centrifugez brièvement à petite vitesse pour recueillir le contenu dans le fond du tube.
5. Poursuivez avec le paramétrage de la PCR.
6. Utilisez les mélanges réactifs dans l'heure qui suit leur préparation. Si un délai est nécessaire entre la préparation des
mélanges réactifs et la mise en place de la PCR, conservez les mélanges réactifs entre 2 et 8 °C jusqu'au moment de la
mise en place (dans l'heure qui suit).
E. ZONE D'AMPLIFICATION PAR PCR EN TEMPS RÉEL
Travaillez dans une zone dédiée à la préparation de l'Universal Disc à 96 puits pour le test Dengue. Utilisez le bloc de
chargement pour Universal Disc au cours de la préparation du disque.
Reportez-vous au modèle de disposition du disque, à la section C, tout en effectuant la préparation suivante :
1. Ajoutez 5,0 µl du mélange réactif approprié à chacun des puits.
2. Ajoutez 5,0 µl du Contrôle moléculaire extrait dans chaque puits « MC » du disque.
3. Ajoutez 5,0 µl de l'extrait de l'échantillon à tester dans le puits « S » approprié du disque.
4. Ajoutez 5,0 µl du Contrôle sans matrice extrait dans chaque puits « NTC » du disque.
5. Recouvrez le disque avec l'Universal Disc Cover Tape.
6. Ouvrez le couvercle de l'Integrated Cycler.
7. Placez le disque universel scellé sur la platine.
8. Fermez délicatement le couvercle.
9. Cliquez sur Run (Exécuter).Simplexa™ Dengue Page 6
10. Cliquez sur Start (Démarrer).
F. ANALYSE DES DONNÉES
1. Reportez-vous au Guide de l'utilisateur de l'Integrated Cycler pour plus de détails sur la façon d’analyser les données et
d’exporter les séries de tests, si nécessaire.
RECOMMANDATIONS POUR L'EXAMEN DES RÉSULTATS
La création de comptes-rendus des résultats est un processus en trois étapes.
1. Examen des contrôles pour déterminer si le segment est valide. Le logiciel Integrated Cycler Studio supprimera
l'interprétation des résultats des patients si l'un quelconque des échantillons programmés comme contrôles n'est
pas valide.
2. Examen de la validité des résultats des échantillons de patients.
3. Interprétation des résultats des patients. Si les contrôles ne sont pas valides, les résultats des patients ne peuvent
pas être interprétés.
1. Déterminez si le segment est valide en examinant le Contrôle moléculaire Dengue, le Contrôle sans matrice et le
Contrôle interne de type ARN.
Critères pour un contrôle valide (simplifiés)*
Contrôle Segment pour Dengue 1 et 4 Segment pour Dengue 2 et 3
DV1 DV4 Ct int. ARN DV2 DV3 Ct int. ARN
Contrôle sans
0 0 ≤ 40,0, ≠ 0 0 0 ≤ 40,0, ≠ 0
matrice
Contrôle
≤ 40,0, ≠ 0 ≤ 40,0, ≠ 0 Sans objet (S/O) ≤ 40,0, ≠ 0 ≤ 40,0, ≠ 0 Sans objet (S/O)
moléculaire
* Voir les notes ci-dessous pour une description complète.
a. Contrôle sans matrice (NTC) (Segment pour Dengue 1 et 4)
i. Si Ct = 0 pour DV1 et DV4 et Ct ≤ 40 pour le contrôle interne, le contrôle est valide.
b. Contrôle sans matrice (NTC) (Segment pour Dengue 2 et 3)
i. Si Ct = 0 pour DV2 et DV3 et Ct ≤ 40 pour le contrôle interne, le contrôle est valide.
c. Contrôle moléculaire (MC) (Segment pour Dengue 1 et 4)
i. Si le résultat du Contrôle moléculaire indique un Ct = 0 pour DV1 et DV4, le segment est considéré
non valide et inacceptable. Tous les échantillons de patients doivent être testés à nouveau.
ii. Si les valeurs de Ct pour DV1 et DV4 sont ≤ 40 mais ≠ 0 et que le Contrôle sans matrice est valide, le
segment est considéré valide et acceptable.
d. Contrôle moléculaire (MC) (Segment pour Dengue 2 et 3)
i. Si le résultat du Contrôle moléculaire indique un Ct = 0 pour DV2 et DV3, le segment est considéré
non valide et inacceptable. Tous les échantillons de patients doivent être testés à nouveau.
ii. Si les valeurs de Ct pour DV2 et DV3 sont ≤ 40 mais ≠ 0 et que le Contrôle sans matrice est valide, le
segment est considéré valide et acceptable.
2. Examen des résultats des échantillons de patients
L'examen des résultats des échantillons cliniques doit être effectué après que les Contrôles moléculaires et sans matrice
ont été examinés et jugés valides et acceptables. Les résultats pour DV1, DV4 et ARN IC ainsi que pour DV2, DV3 et
ARN IC doivent être examinés pour chaque segment pour chaque échantillon de patient.
a. Les courbes d'amplification devront être analysées pour chaque résultat, en particulier quand un message « Data
Quality » (Qualité des données) est transmis. Une courbe d'amplification valide présente une augmentation lisse
et exponentielle. Se reporter au Guide de l’utilisateur pour les actions recommandées.Simplexa™ Dengue Page 7
Courbe d'amplification valide Courbe d'amplification valide Courbe d'amplification non valide
b. Si la courbe d'amplification est valide pour la cible, la détection de l'ARN IC n'est pas requise pour communiquer
un résultat positif.
3. Interprétation des résultats
Interprétation des résultats
Segment pour Dengue 1 et 4 Segment pour Dengue 2 et 3
DV1 ARN Ct Interprétation ARN Ct
DV4 DV2 DV3
Exemple Valeur de interne interne Interprétation
Valeur Ct Valeur Ct Valeur Ct
Ct Valeur Ct* Valeur Ct*
DV1 et DV4 DV2 et DV3
1 0 0 ≤ 40,0, ≠ 0 0 0 ≤ 40,0, ≠ 0
Non détectés Non détectés
DV2 et DV3
2 ≤ 40,0, ≠ 0 0 S/O DV1 détecté 0 0 ≤ 40,0, ≠ 0
Non détectés
DV2 et DV3
3 0 ≤ 40,0, ≠ 0 S/O DV4 détecté 0 0 ≤ 40,0, ≠ 0
Non détectés
DV1 et DV4 DV2 et DV3
4 ≤ 40,0, ≠ 0 ≤ 40,0, ≠ 0 S/O 0 0 ≤ 40,0, ≠ 0
détectés Non détectés
DV1 et DV4 ≤ 40,0,
5 0 0 ≤ 40,0, ≠ 0 0 S/O DV2 détecté
Non détectés ≠0
DV1 et DV4
6 0 0 ≤ 40,0, ≠ 0 0 ≤ 40,0, ≠ 0 S/O DV3 détecté
Non détectés
DV1 et DV4 ≤ 40,0, DV2 et DV3
7 0 0 ≤ 40,0, ≠ 0 ≤ 40,0, ≠ 0 S/O
Non détectés ≠0 détectés
Non valide,
recommencer
8 0 0 0 S/O S/O S/O S/O
l'extraction et le
segment.
Non valide,
recommencer
9 S/O S/O S/O S/O 0 0 0
l'extraction et le
segment.
Ct = seuil du cycle. Détecté : Ct ≤ 40,0, ≠ 0. Non détecté : Ct = 0.
*La détection du Contrôle ARN interne Simplexa n'est pas nécessaire pour communiquer un résultat positif.
LIMITES
1. Pour diagnostic in vitro.
2. Exclusivement destiné à l’exportation
3. Ce test est conçu pour l'analyse d'échantillons de sérum ; il n'a pas été évalué avec d'autres types d'échantillons.
4. La détection de l'acide nucléique viral dépend des bonnes conditions de recueil, manipulation, transport, conservation et
préparation (y compris l'extraction) de l'échantillon. Le non respect des procédures appropriées au cours de n'importe
laquelle de ces étapes peut aboutir à des résultats inexacts.
5. Les techniciens doivent être formés et avoir l'habitude des procédures de tests et de l'interprétation des résultats avant
d'effectuer le test.
6. Tous les résultats de ce test et des autres tests doivent être corrélés aux antécédents cliniques, aux données
épidémiologiques et aux autres données à la disposition du clinicien évaluant le patient.Simplexa™ Dengue Page 8
7. La prévalence de l’infection aura un impact sur la valeur prédictive du test.
8. Comme pour d'autres tests, des résultats négatifs n'éliminent pas la possibilité d'une infection par le virus de la dengue.
9. Il peut y avoir des résultats faux négatifs lorsque l'organisme infectant présente des mutations, des insertions, des délétions
ou des réarrangements de son génome ou lorsque le test est réalisé très tôt au cours de la maladie.
10. Des résultats faux négatifs peuvent survenir si la quantité d'organismes présents dans l'échantillon est insuffisante en raison
d'un prélèvement, transport ou manipulation inadéquats.
11. Comme avec d'autres tests, des résultats faux positifs peuvent survenir. Dans certains cas, une répétition du test ou le
renouvellement du test avec un autre appareil peut être indiqué.
12. Ce test est un test qualitatif et ne fournit pas de valeur quantitative pour l'organisme détecté.
13. Ce test ne peut pas exclure la présence d’infections provoquées par d'autres agents pathogènes viraux ou bactériens.
CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES
COMPARAISON DES MÉTHODES
Un panel de 179 échantillons ayant été préalablement caractérisés par PCR pour la dengue a été obtenu auprès des CDC
(Centres de contrôle et de prévention des maladies) des États-Unis. Les échantillons ont été testés à l'aide du test Simplexa™
Dengue et comparé aux résultats historiques indiqués par les CDC.
Tableau 1 : Comparaison aux résultats historiques – Virus de la dengue 1
Résultat historique CDC Simplexa™ Dengue, DV1
% concordance (Observé/attendu)
n Détectés Non détectés
IC à 95 %
PCP : 100,0 % (32/32)
Détectés 32 32 0
IC À 95 % : 89,3 à 100,0 %
a PCN : 92,5 % (136/147)
Non détectés 147 11 136
IC À 95 % : 87,1 à 95,8 %
PCP = Pourcentage de concordance positive, PCN = Pourcentage de concordance négative
a
Lors de la répétition du test, 5 échantillons sur 11 ont été détectés par le test Simplexa Dengue et par un test interne basé sur des publications
CDC. Les autres 6 échantillons n'ont pas été détectés par le test interne basé sur des publications CDC.
Tableau 2 : Comparaison aux résultats historiques – Virus de la dengue 2
Résultat historique CDC Simplexa™ Dengue, DV2
% concordance (Observé/attendu)
N Détectés Non détectés
IC à 95 %
b 96,7 % (29/30)
Détectés 30 29 1
IC À 95 % : 83,3 à 99,4 %
b 99,3 % (148/149)
Non détectés 149 1 148
IC À 95 % : 96,3 à 99,9 %
PCP = Pourcentage de concordance positive, PCN = Pourcentage de concordance négative
b
Les résultats n'ont pas changé après répétition des tests.
Tableau 3 : Comparaison aux résultats historiques – Virus de la dengue 3
Résultat historique CDC Simplexa™ Dengue, DV3
% concordance (Observé/attendu)
N Détectés Non détectés
IC à 95 %
100,0 % (29/29)
Détectés 29 29 0
IC À 95 % : 88,3 à 100,0 %
100,0 % (150/150)
Non détectés 150 0 150
IC À 95 % : 97,5 à 100,0 %
PCP = Pourcentage de concordance positive, PCN = Pourcentage de concordance négativeSimplexa™ Dengue Page 9
Tableau 4 : Comparaison aux résultats historiques – Virus de la dengue 4
Résultat historique CDC Simplexa™ Dengue, DV4
% concordance (Observé/attendu)
N Détectés Non détectés
IC à 95 %
c 97,4 % (37/38)
Détectés 38 37 1
IC À 95 % : 86,5 à 99,5 %
d 94,3 % (133/141)
Non détectés 141 8 133
IC À 95 % : 89,2 à 97,1 %
PCP = Pourcentage de concordance positive, PCN = Pourcentage de concordance négative
c
Les résultats n'ont pas changé après répétition des tests.
d
Lors de la répétition du test, 2 échantillons sur 8 ont été détectés comme positifs pour DV4 par le test Simplexa Dengue et par un test interne
basé sur des publications CDC. Un échantillon a été détecté comme positif pour DV1 et un comme positif pour DV2 dans les deux tests. Les
deux échantillons restants n'ont pas été détectés lors de la répétition du test pour les deux tests.
REPRODUCTIBILITÉ
La reproductibilité du test Simplexa Dengue a été évaluée à l'aide de trois appareils différents. Un panel d'échantillons et le
contrôle moléculaire ont été testés en trois réplicats sur chaque appareil, deux fois par jour au cours de cinq jours au total. Le
contrôle négatif a été testé une fois par série. Chaque appareil a été testé par un technicien qui a testé le panel entier
d'échantillons deux fois par jour, pour un total de deux séries de données par jour. La reproductibilité de la réponse qualitative
des appareils et une évaluation des divers constituants des valeurs Ct sont indiquées dans les tableaux ci-dessous.
Tableau 5 : Reproductibilité de la réponse qualitative
Mélange réactif 1 et 4 Mélange réactif 2 et 3
DV1 DV4 DV2 DV3
Nom de Nom de
Tous Non Non Tous Non Non
l'échantillon Détectés Détectés l'échantillon Détectés Détectés
détectés détectés détectés détectés
Dengue 1 Dengue 2
90 0 90 90 0 88 0 88 88 0
positif faible positif faible
Dengue 1 Dengue 2
positif 90 0 90 89 1 positif 88 0 88 88 0
modéré modéré
Dengue 4 Dengue 3
90 90 0 1 89 90 90 0 11 79
positif faible positif faible
Dengue 4 Dengue 3
positif 89 89 0 0 89 positif 89 89 0 0 89
modéré modéré
Négatif 90 90 0 90 0 Négatif 88 88 0 88 0
Contrôle Contrôle
30 30 0 30 0 30 30 0 30 0
négatif négatif
Contrôle Contrôle
90 0 90 0 90 90 0 90 0 90
moléculaire moléculaire
Tableau 6 : Reproductibilité de la réponse des appareils (valeurs Ct)
Composante de variance
Moyenn Inter Inter Inter Intra-essai
Cible Échantillon N Total
e Ct appareil / technicien jour Série (Répétabilité)
ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV
Dengue 1
90 35,2 0,44 1,3 0,16 0,4 0,10 0,3 0,46 1,3 0,66 1,9
Positif bas
DV1 Dengue 1
90 33,5 0,54 1,6 0,22 0,7 0,00 0,0 0,29 0,9 0,65 1,9
Positif moyen
Contrôle moléculaire 90 34,3 0,49 1,4 0,26 0,8 0,00 0,0 0,38 1,1 0,67 2,0
Dengue 2
88 33,5 0,33 1,0 0,19 0,6 0,19 0,6 0,37 1,1 0,57 1,7
Positif bas
DV2 Dengue 2
88 31,9 0,45 1,4 0,48 1,5 0,00 0,0 0,23 0,7 0,70 2,2
Positif moyen
Contrôle moléculaire 90 33,2 0,37 1,1 0,59 1,8 0,11 0,3 0,49 1,5 0,86 2,6
Dengue 3
90 38,2 0,51 1,3 0,22 0,6 0,62 1,6 0,87 2,3 1,21 3,2
Positif bas
DV3 Dengue 3
89 33,0 0,58 1,7 0,63 1,9 0,00 0,0 0,26 0,8 0,89 2,7
Positif moyen
Contrôle moléculaire 90 33,4 0,54 1,6 0,42 1,3 0,00 0,0 0,29 0,9 0,75 2,2Simplexa™ Dengue Page 10
Composante de variance
Moyenn Inter Inter Inter Intra-essai
Cible Échantillon N Total
e Ct appareil / technicien jour Série (Répétabilité)
ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV
Dengue 4
90 36,4 0,00 0,0 0,24 0,7 0,00 0,0 0,79 2,2 0,82 2,3
Positif bas
DV4 Dengue 4
89 32,0 0,27 0,8 0,10 0,3 0,00 0,0 0,17 0,5 0,33 1,0
Positif moyen
Contrôle moléculaire 90 34,4 0,37 1,1 0,29 0,8 0,00 0,0 0,38 1,1 0,60 1,7
Aux fins d'analyse de reproductibilité, les résultats « Non détectés » reçoivent une valeur Ct de 40,1.
SENSIBILITÉ ANALYTIQUE / LIMITE DE DÉTECTION
La limite de détection (LD) du test Simplexa™ Dengue a été déterminée en utilisant des stocks quantifiés de souches de virus de
la dengue dilués en série dans du sérum humain. La concentration la moins élevée ayant une détection ≥ 95 % (au moins
19 réplicats sur 20) a été définie comme étant la limite de détection pour chaque test.
Tableau 7 : Résumé des limites de détection
Sérotype de la dengue Souche virale Concentration limite de détection (LD, PFU/ml)
Dengue 1 WHO WEST PAC 74 0,16
Dengue 2 WHO-S16803 2,0
Dengue 3 WHO-CH53489 0,2
Dengue 4 TVP-360 0,2
RÉACTIVITÉ ANALYTIQUE
En plus des souches utilisées pour déterminer la LD, une souche supplémentaire de sérotype du virus de la dengue a été utilisée
pour évaluer si la réactivité du test est correcte. Un sérum humain négatif a été enrichi de matériel viral quantifié, à une dilution
unique correspondant à la concentration indiquée dans le tableau ci-dessous, et testé en trois réplicats. Toutes les souches
testées ont été correctement détectées par le Mélange réactif correspondant.
Tableau 8 : Résumé de la réactivité analytique
Détecté / Total
Souche virale Concentration testée Mélange réactif 1 et 4 Mélange réactif 2 et 3
DV1 DV4 DV2 DV3
Dengue 1, Hawaii Inconnu 3/3 0/3 0/3 0/3
4
Dengue 2, New Guinea C 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 3/3 0/3
4
Dengue 3, H87 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 3/3
4
Dengue 4, H241 Sm14 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 3/3 0/3 0/3
RÉACTIVITÉ CROISÉE
La spécificité analytique du test Simplexa a été évaluée en testant sa capacité à identifier de façon exclusive le virus de la dengue
sans aucune réactivité croisée avec des organismes auxquels il est étroitement apparenté, ou provoquant des symptômes
cliniques comparables, ou constituant une flore normale dans les types d'échantillons d'intérêt.
Un sérum humain négatif a été enrichi, à des concentrations cliniquement pertinentes et de façon individuelle, par un panel de
vingt-huit (28) organismes pouvant potentiellement entraîner des réactions croisées. Une matrice non enrichie a été également
testée pour servir de ligne de base. Les échantillons ont été testés à trois reprises pour rechercher une réaction croisée. Si un
signal était détecté dans l’un des canaux (DV1, DV2, DV3, DV4) pour l’un quelconque des trois réplicats, 5 réplicats
supplémentaires étaient testés pour confirmation. Aucune réactivité croisée n'a été détectée.
Tableau 9 : Résumé de la réactivité croisée
Détecté / Total
Agent à réaction croisée potentielle Concentration testée Mélange réactif 1 et 4 Mélange réactif 2 et 3
DV1 DV4 DV2 DV3
5
Liquide de culture d'adénovirus (de type 1) 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Liquide de culture d'adénovirus (de type 7A) 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
Aspergillus Inconnu 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Virus BK 1,00 × 10 copies/ml 0/3 0/3 0/3 0/3Simplexa™ Dengue Page 11
Détecté / Total
Agent à réaction croisée potentielle Concentration testée Mélange réactif 1 et 4 Mélange réactif 2 et 3
DV1 DV4 DV2 DV3
5
Virus chikungunya 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Cytomégalovirus (CMV) 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Entérovirus 71 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Virus d'Epstein Barr (EBV) 1,00 × 10 copies/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
3
Virus de l'hépatite B, contrôle 5,00 × 10 UI/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
4
Virus de l'hépatite C, contrôle 1,00 × 10 UI/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
Virus de l'hépatite D Inconnu 0/3 0/3 0/3 0/3
5
VIH-1 1,00 × 10 copies/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
VIH-2 Inconnu 0/3 0/3 0/3 0/3
5
VHS-1 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
VHS-2 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
HTLV-1 Inconnu 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Virus de l'herpès humain 6 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Virus de l'herpès humain 7 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Virus de l'herpès humain 8 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
-3
ADN de Mycobacterium tuberculosis 1,67 × 10 µg/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Parechovirus 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
7
Parvovirus B19, contrôle 1,00 × 10 UI/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Virus de la rubéole 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Virus de l'encéphalite de Saint Louis 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
6
Toxoplasma gondii 1,00 × 10 tachyzoïtes/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Virus varicelle-zona 1,00 × 10 copies/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
Virus du Nil occidental Inconnu 0/3 0/3 0/3 0/3
5
Virus de la fièvre jaune 1,00 × 10 TCID50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3
INTERFÉRENCE
La performance de ce test n'a pas été évaluée avec des substances potentiellement interférentes. Le processus d'extraction
automatisée de l'acide nucléique élimine efficacement les impuretés des échantillons pendant l'isolement et les lavages des
acides nucléiques au cours de ce processus. Les contrôles internes alertent l’opérateur d'une possible inhibition de la PCR ; si
toutes les cibles et le contrôle interne ne sont pas détectés, le test n'est pas valide.
CONTAMINATION PAR TRANSFERT
La contamination de l'amplification par transfert a été évaluée pour l'appareil et l'Universal Disc à l'aide d'autres tests. Les études
ont recherché la présence de contaminations dans des échantillons négatifs hauts. Chaque étude a été conçue en plaçant l'un à
côté de l'autre, en alternance, un échantillon fortement positif et un échantillon fortement négatif sur chaque disque. L'effet de
contamination par transfert a été évalué en comparant le taux observé de négatifs pour les échantillons négatifs avec le taux
attendu dans les conditions de reproductibilité normale. Aucune contamination par transfert n'a été observée au cours de tests
antérieurs.Simplexa™ Dengue Page 12
CONTRÔLE DE QUALITÉ
Chaque laboratoire doit définir ses propres plages de contrôle de la qualité et la périodicité des tests de CQ en fonction des lois
locales, règlements et bonnes pratiques de laboratoire standards applicables.
RÉFÉRENCES
1 Halstead, SB. 1980. Immunological parameters of togavirus disease syndromes. p.107-173. In RW Schlesinger (ed.), The
Toga Viruses. Academic Press, Inc., New York.
2 OMS, Dengue Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control, New edition (2009) WHO/HTM/NTD/DEN/2009.1
3 CDC http://www.cdc.gov/dengue/epidemiology/index.html
4 Gubler, DJ. 1989. Aedes aegypti and Aedes aegypti-borne disease control in the 1990’s: top down or bottom up. Am. J. Trop.
Med. Hyg. 40:571-578.
5 WHO http://www.who.int/csr/disease/dengue/en/
6 Halstead, SB. 1989. Antibody, Macrophages, Dengue Virus Infection, Shock, and Hemorrhage: A Pathogenic Cascade. Rev.
of Inf. Dis. 11:S830-S839
7 MMWR (Morbidity and Mortality Weekly Report) du 21 mai 2010 / 59(19);577-581
8 Laue T, Emmerich P, Schmitz H. Detection of dengue virus RNA in patients after primary or secondary dengue infection by
using the TaqMan automated amplification system. J Clin Microbiol. 1999 Aug; 37(8):2543–7
9 Chang GJ, Trent DW, Vorndam AV, Vergne E, Kinney RM, Mitchell CJ. An integrated target sequence and signal
amplification assay, reverse transcriptase-PCR-enzyme-linked immunosorbent assay, to detect and characterize flaviviruses.
J. Clin. Microbiol. 1994 Feb; 32(2):477–83
10 Muñoz-Jordán J.L., Collins CS, Vergne E, et al. Highly sensitive detection of dengue virus nucleic acid in samples from
clinically ill patients. J Clin Microbiol 2009; 47:927-931
11 CLSI H18-A4 (Clinical and Laboratory Standards Institute) Mocarski, E. S. (1993) Cytomegalovirus biology and replication, p
173-226 In B. Roizman, R. J. Whitley, and C. Lopez (ed), the Human Herpesviruses. 4th Ed. (2010).
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Téléphone : (800) 838-4548 (États-Unis uniquement) (562) 240-6500 (International) Date de rédaction : 26 avril 2012
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