COMMENT L'ANALYSE D'IMAGES PEUT-ELLE ASSISTER LE CONTROLE AUTOMATIQUE D'UN MICROSCOPE ELECTRONIQUE À TRANSMISSION?
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COMMENT L’ANALYSE D’IMAGES PEUT-ELLE ASSISTER LE CONTROLE
AUTOMATIQUE D’UN MICROSCOPE ELECTRONIQUE À TRANSMISSION?
Nicolas Coudray, Jean-Luc Buessler, Argyro Karathanou, Gilles Hermann, Hubert Kihl, Jean-Philippe Urban
Laboratoire MIPS, Université de Haute Alsace
4, rue des Frères Lumière, 68093 Mulhouse, France
Téléphone: +(33)389-33-64-32, email: nicolas.coudray@uha.fr
ABSTRACT Dans notre étude, nous verrons de quelle manière des
outils de traitement d’images peuvent assister les outils de
contrôle des Microscopes Electroniques à Transmission
Ce papier présente une méthode automatique d’analyse
(MET) actuellement existants, ceci dans le cadre biologique
d’images acquises au microscope électronique à transmis-
des protéines membranaires. Les protéines membranaires
sion. Les algorithmes simulent les décisions d’un microsco-
font partie de tous les organismes vivants et comprendre leur
piste lors de l’évaluation de protéines cristallisées en deux
fonctionnement est un défi important. Plusieurs techniques
dimensions dans des membranes. L’objectif est d’évaluer le
ont été mises au point afin de mettre en forme ces protéines
succès de la cristallisation à travers un processus d’analyse
et faciliter leur étude [6]. Parmi ces techniques, la cristallisa-
de régions d’intérêt. L’approche est décomposée en trois
tion 2D consiste à arranger les protéines membranaires dans
étapes correspondant aux niveaux de grossissement du mi-
des couches bi-lipidiques (les membranes) selon un proces-
croscope. Lors de la première étape à faible grossissement,
sus expérimental complexe [7]. Trouver les conditions adap-
l’algorithme évalue la qualité de la grille sur laquelle le
tées à la cristallisation d’une protéine donnée est un proces-
spécimen est placé. Lors de la deuxième étape à moyen
sus long et difficile qui nécessite la préparation d’une grande
grossissement, les membranes dans lesquelles les protéines
quantité d’expériences. Toutes ces expériences doivent en-
ont été cristallisées sont analysées. Les images sont classi-
suite être analysées au MET afin d’identifier si la présence
fiées selon une méthode basée sur l’analyse d’histogramme
éventuelle de membranes cristallines. Ceci doit ainsi permet-
pour rejeter les images les moins significatives. Les images
tre de valider les conditions requises pour la cristallisation
restantes sont étudiées par un algorithme basé sur
des différentes protéines. Dans ce contexte, il est important
l’extraction et l’analyse de contours pour identifier les
de développer des outils qui permettent d’automatiser
membranes et sélectionner les régions potentiellement cris-
l’analyse du spécimen biologique.
tallines. Lors de la dernière étape à fort grossissement, un
De nombreux efforts ont d’ores et déjà été mis en œuvre
algorithme extrait automatiquement les pics de diffraction
pour le contrôle automatique du microscope et l’acquisition
des régions sélectionnées à moyen grossissement. Les tests
des images par balayage de l’échantillon [3, 4]. En ce qui
montrent des résultats encourageants.
concerne l’analyse de ces images, si certains outils sont étu-
diés depuis peu pour quelques applications [10, 13], l’analyse
1. INTRODUCTION
automatique de ces images n’en est encore qu’à son tout dé-
but, particulièrement pour les cristaux 2D.
De nombreux efforts ont été placés dans le contrôle automa- Le logiciel GRACE développé par Oostergetel et al. [4]
tique des instruments en y associant des techniques de vision a été un des premiers à s’attacher à ce problème en proposant
ou de traitement d’images. La microscopie en particulier a un outil principalement semi-automatique pour les images de
fait l’objets de nombreux travaux afin d’automatiser cristaux 2D, mais il s’agit d’un outil restreint à l’acquisition
l’acquisition des images [3, 8, 11]. Les travaux effectués sur des images.
la gestion de certains réglages (comme l’autofocus) ainsi Le system LEGINON a principalement été développé
qu’un contrôle des déplacements permet de balayer les spé- pour une autre méthode d’étude des protéines appelé ‘single
cimens observés de manière complètement automatiques. particles’. Une proposition a été faite pour adapter le système
Les quantités élevées d’images qui peuvent être ainsi acqui- à l’analyse de cristaux 2D en effectuant une reconnaissance
ses doivent alors être analysées, ce qui constitue un exercice de larges cristaux rectangulaires et bien contrastés obtenus
d’autant plus long que le nombre d’images est grand. Ces avec des protéines catalase [5]. L’approche est cependant
quantités importantes d’informations à traiter constituent de bien trop limitée à un type de protéines et à un cas rare de
nouveaux défis pour la communauté du traitement d’images types d’images pour pouvoir être adapté à d’autres cas.
qui doivent trouver des méthodes adaptées pour traiter les L’analyse automatique de larges quantités d’images
différents types d’images ainsi acquises. constitue ainsi un champ émergent pour la recherche en trai-
tement d’images. Lorsque cela est possible, il semble impor-
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Ouzou, Algérie, Vol. 2, pp. 257-263, 2007.tant de pouvoir intégrer le système d’analyse au système lors de l’analyse manuel ou semi-automatique de ces échan-
d’acquisition afin que l’analyse puisse être faite en-ligne. tillons [4].
Ainsi, il est non seulement possible d’extraire des rensei-
gnements sur le spécimen, mais il devient aussi possible 2. EVALUATION DE LA QUALITE DE LA GRILLE A
d’avoir un retour sur l’échantillon et ainsi adapter le proces- FAIBLE GROSSISSEMENT
sus d’acquisition des images. Le processus d’acquisition de-
vient ainsi intimement lié au processus d’analyse. Cette dé-
Pour observer des échantillons au MET, ceux-ci sont placés
marche peut permettre de rendre l’ensemble de
sur une grille de cuivre de 3 mm de diamètre sur laquelle est
l’automatisation beaucoup plus efficace, comme expliqué ci-
posé un fin film de carbone. Ce film est fragile et endomma-
après. Le succès d’une expérience de cristallisation 2D peut
gé en de nombreux endroits. Il est important d’identifier ces
être évalué en détectant des pics de diffractions du spectre
régions tôt dans le processus afin de ne plus s’y attarder par
d’une image acquises à fort grossissement (à environ 5 Å
la suite et éviter ainsi de perdre du temps à acquérir des ima-
/pixel). Cependant, à ce grossissement, effectuer un simple
ges aux endroits où il n’y a pas d’information à extraire.
balayage suivi d’une analyse d’image est très inefficace en
Pour évaluer la qualité de la grille en cryo-microscopie,
terme de méthodologie et de temps étant donné la taille de la
Zhang et al. [11] ont développé un processus qui nécessite
grille à balayer (3 mm de diamètre) et le champ de la caméra
une image de référence acquise par l’utilisateur sur la grille
à ce grossissement (environ 500 nm x 500 nm). Cette démar-
étudiée. Le défi auquel notre algorithme a dû répondre était
che est d’autant plus hasardeuse que le spécimen peut être
d’évaluer des grilles en cristallographie électronique sans
rare sur la grille. Il est ainsi plus pertinent de balayer la grille
nécessiter aucune référence de la part de l’utilisateur. Au-
à un grossissement plus faible afin de diriger le spécimen
cune référence ne peut d’ailleurs être incluse dans le pro-
vers les régions les plus intéressantes.
gramme même car la géométrie des orifices de la grille peut
Ainsi, nous avons adopté une approche en 3 étapes, cor-
varier d’une grille à une autre, et les conditions
respondant chacune au balayage partiel de la grille à un gros-
d’éclairement peuvent elles aussi varier.
sissement [1]. Pour chaque étape, des outils de traitements
Pour atteindre notre objectif, nous avons développé une
spécifiques doivent être crées pour extraire des informations
méthode originale basée principalement sur une analyse
sur le spécimen. Ces informations permettent non seulement
globale et locale d’histogrammes. Après avoir identifier les
de quantifier le succès de la cristallisation mais ils sont éga-
orifices de la grille, une première évaluation de la qualité est
lement une aide au pilotage du microscope. Ces 3 étapes sont
effectuée pour un premier tri. Les informations recueillies
effectuées à trois niveaux durant lesquels la grille est balayée
durant cette première passe sont utilisées pour effectuer une
à faible, moyen puis fort grossissement. Les renseignements
seconde évaluation de la qualité et préciser la qualité de cha-
extraits aux deux premières étapes permettent d’optimiser le
que orifice. Seuls les coordonnées orifices de qualité accep-
pilotage aux deux dernières étapes :
tables sont conserver pour que des images à plus fort grossis-
(1) A faible grossissement : les images sont acquises pour
sement puissent y être acquises. Les différentes étapes de
visualiser l’ensemble de la grille en cuivre sur laquelle le
l’algorithme sont exposées ci-dessous.
spécimen a été placé. La qualité de la grille est évaluée et les
Lors de la première étape, une étude globale de
régions d’intérêts sont identifiées : il s’agit des orifices de la
l’histogramme de l’image permet d’identifier la position des
grille, les zones occupées par la grille elle-même étant trop
orifices de la grille (Figure 1) : l’opacité de la grille en cuivre
opaques pour que des membranes puissent y être identifiées.
aux électrons engendre un pic étroit dans les niveaux de gris
De plus, comme quasiment toutes les grilles sont localement
sombres de l’histogramme (à droite de l’histogramme de la
abîmées, il s’agit de ne sélectionner que les orifices en bon
Figure 1). Le seuil est placé au premier minimum local après
état. L’algorithme proposé est développé dans la section II de
ce pic afin de séparer la grille des orifices.
ce papier.
Puis, une étude locale de chaque orifice est effectuée.
(2) A moyen grossissement (environ x 5.000) : les images
Nous considérons quatre types d’orifices (Figure 2) :
sont acquises au niveau des orifices sélectionnées à faible
(A) les orifices où la grille est en bon état et où les membra-
grossissement. A cette étape, les membranes sont visibles et
nes sont suffisamment larges et contrastées pour être visibles
analysées pour sélectionner les régions potentiellement cris-
à cette résolution,
tallines et ainsi restreindre le balayage effectué à fort grossis-
(B) les orifices en bon état où les membranes sont trop petites
sement. Cette partie, développée dans la section III, est divi-
ou trop faiblement contrastées pour pouvoir être visibles à ce
sée en deux étapes : une pré-classification basée sur l’analyse
grossissement,
des histogrammes et une analyse de contour d’images pour la
(C) les orifices où le film de carbone est endommagé et par-
localisation des membranes.
tiellement visible,
(3) A fort grossissement (x50.000) : des images des régions
(D) les orifices où le film de carbone est endommagé et
potentiellement cristallines sont acquises et le spectre de
complètement absent.
puissance est analysé pour identifier la présence ou l’absence
Les orifices de type (A) et (C) peuvent être identifiés
de pics de diffractions. Cette étape est traitée dans la section
par une première évaluation de la qualité qui peut être faite
IV.
en-ligne : la méthode proposée est basée sur un seuillage
L’approche générale s’avère être une simulation du
local de l’histogramme de chaque orifice (Figure 2) : pour
comportement du biologiste qui procède de manière similaire
chaque orifice, le dernier pic Plast de l’histogramme est iden-
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l’image. Pour les images de type (A), la surface occupée par
la zone segmentée contient des ‘trous’ dus à la présence des
membranes contrastées dont le niveau de gris est inférieur à
celui du fond. L’enveloppe convexe de cette zone segmentée
occupe la quasi-totalité de l’orifice (lors de
l’implémentation, une erreur de +/- 5% est autorisée entre
l’aire de l’enveloppe convexe du fond et l’aire de l’orifice).
Pour les orifices de type (C), la zone la plus claire ne repré- Ts
sente pas le film de carbone mais la zone où le film est ab-
sent. En effet, la déchirure permet de laisser passer plus
d’électrons par rapport au film de carbone. Ainsi, la zone
segmentée ne contient pas de ‘trous’ et son aire convexe est Figure 1 Histogramme typique d’une image de la grille
inférieure à celle de l’orifice. Les orifices de types (C) sont acquise à faible grossissement et le seuil Ts utilisé pour
les plus importants à identifier car les morceaux de carbone segmenter les orifices.
repliés aux bords des déchirures ressemblent à des membra-
nes lorsque l’image est acquise à moyenne résolution. Afin
d’éviter cette confusion qui mènerait à de faux positifs lors
des études suivantes, il est important d’identifier ces en-
droits. Pour les orifices de types (B) et (D), l’objet segmenté
est sans ‘trou’ et son aire convexe occupe la totalité de
l’orifice. La seule différence entre ces deux types d’orifices
est leur niveau de gris moyen qui est plus sombre lorsque le
film de carbone est présent. Ce niveau de gris moyen peut
varier d’une acquisition à l’autre et d’un microscope à
l’autre selon les paramètres d’acquisition par exemple. Il
n’est donc pas possible de connaître a priori à quel moment
un niveau de gris est suffisamment clair pour que l’on
puisse considérer que le film est absent. Si l’essentiel est
d’éviter la détection de faux positifs, l’algorithme peut être
conserver tel quel : l’acquisition d’images sur des orifices de
types (D) constitue une perte de temps mais ne constitue
aucun danger pour les étapes suivantes.
Pour pouvoir éviter cette perte de temps sans pour autant
faire appel à une intervention de l’utilisateur, nous avons
introduit une seconde passe d’évaluation de qualité. Celle-ci
est basée sur les informations recueillies lors de la première
passe : après la première passe de l’étude de qualité, les gril- Figure 2 Les différentes classes d’orifices : ligne 1 : type
(A) lorsque le film de carbone est en bon état et les mem-
les de types (A) et (C) ont été identifiées, ce qui permet
d’extraire un niveau de gris de référence du fond lorsque le branes visibles ; ligne 2 : type (C) lorsque le film est dé-
chiré ; ligne 3 : type (B) ou (D): présence éventuelle du
film de carbone est présent et absent. Cette information est
utilisée lors de la seconde passe pour différencier les orifices film de carbone et de membranes trop petites ou trop peu
contrastées pour être visibles, ou bien absence du film de
de types (B) et (D). S’il n’y a aucun orifice de type (A), la
carbone ; colonne 1 : images en niveaux de gris centrées
moyenne GL C et l’écart type STDC de la distribution des sur les orifices ; colonne 2 : histogramme local de chaque
pixels de fond identifiés dans les orifices de classes (C) sont orifice et, entouré de rouge, le dernier pic de
utilisés pour déterminer le seuil de classification type (B) / l’histogramme à segmenter ; colonne 3 : images binaires
type (D) : des orifices après la segmentation du dernier pic de
Tempty = GL C − 2 × STDC , (2) l’histogramme. La taille des orifices est d’environ 60 x 60
A partir de la première passe d’évaluation, des informations µm.
statistiques concernant la taille et la forme des orifices peu-
vent être extraites et utilisées lors de la seconde passe pour
éliminer les orifices dont la géométrie ou la taille est sus-
pecte.
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elle assister le contrôle automatique d’un microscope électronique à transmission ?", 2ème Conférence sur la Vision Artificielle (CVA), Tizi
Ouzou, Algérie, Vol. 2, pp. 257-263, 2007.3. ANALYSE DES IMAGES A MOYEN
GROSSISSEMENT
3.1. Pré-classification des images par analyse de
l’histogramme
La pré-classification des images proposée est une méthode
rapide pour rejeter des images qui ne nécessitent aucune Figure 3 Image (échelle : 1 µm) et histogramme d’intérêt
analyse. Cette étape est effectuée sur l’histogramme de
l’image lissée par un filtre médian de taille 5x5.
Quatre classes d’histogramme sont proposées : les his-
togrammes d’intérêt, les histogrammes d’agrégats, les his-
togrammes de grille et les histogrammes de bruit :
(1) Les histogrammes d’intérêts (Figure 3) constituent ceux
qui valent la peine d’être analysés. Le pic principal est situé
dans la partie droite de l’histogramme, témoignant d’une
partie claire dominante (fond et membranes non empilées).
Les images ayant ce type d’histogramme sont sélectionnées
pour être analysées plus en détails. Figure 4 Image (échelle : 1 µm) et histogramme d’agrégats
(2) Les histogrammes d’agrégats (Figure 4) au contraire pos-
sèdent leu pic principal dans la partie gauche de
l’histogramme (zone sombre) et témoignent de la présence
importante d’empilement et d’agrégats. Dans ce cas, l’image
est rejetée et n’est pas analysée plus en détail.
(3) Les histogrammes de grille (Figure 5) sont observés
lorsque l’image acquise est proche de la grille en cuivre.
Celle-ci est opaque aux électrons et on observe dans
l’histogramme un pic aux niveaux de gris quasi-nuls ;
l’histogramme commence par un maximum. La grille est
segmentée en choisissant un seuil au premier minimum local Figure 5 Image (échelle : 1 µm) et histogramme de grille
après le pic. Si plus de la moitié de l’image est occupée par la
grille, alors la zone sur laquelle il est possible d’extraire de
l’information potentiellement utile est considérée comme
trop faible et l’image est rejetée.
(4) Les histogrammes de bruit (Figure 6) peuvent être causés
par différents types de bruits : des restes de détergent (produit
utilisé lors la reconstruction des membranes et qui devrait, à
ce stade, avoir été retiré), des artefacts importants ou petits
trous dans le film de carbone (non observés à faible grossis-
sement ou créés par une surexposition au faisceau
d’électrons), ou bien une autre contamination de Figure 6 Image (échelle: 1 µm) et histogramme de bruit
l’échantillon. Ces types d’histogramme possèdent plusieurs
pics dans la zone droite de l’histogramme (pixels clairs). Au-
cun autre traitement n’est effectué sur ces images.
La segmentation de spécimens biologiques est une
étape difficile, surtout lorsque le contraste, les niveaux de
3.2. Sélection de région d’intérêt (ROI) gris, la forme et la taille des objets peuvent varier de ma-
nière importante. Malgré l’utilisation de la coloration néga-
Seules les images ayant un histogramme d’intérêt sont analy- tive par des métaux lourds, le contraste ainsi rehaussé loca-
sées plus en détails pour identifier des régions d’intérêt po- lement est encore insuffisant pour pouvoir séparer les mem-
tentiellement cristallines. A l’issue de cette étape, branes du fond avec un simple seuillage. Comme les mem-
l’algorithme fournit les coordonnées des régions d’intérêt branes sont identifiables grâce à leur contraste local,
(ROI) sélectionnées pour qu’elles puissent être acquises à un l’approche utilisée repose sur une méthode de détection de
grossissement plus élevé afin de vérifier la présence de cris- contours. La présence d’un contour témoignant avec une
taux. forte probabilité de la présence d’une membrane, les ROI
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4. ANALYSE A FORT GROSSISSEMENT DU
des ROI doit être au moins aussi large que la taille de la
SPECTRE DE PUISSANCE
zone acquise à fort grossissement si l’on veut éviter les ac-
quisitions redondantes. Ainsi, si la taille de l’image à un Les images acquises à fort grossissement (environ 5 Å/pixel)
moyen grossissement de x5.000 est de NxN pixels, alors, doivent être acquises d’après les coordonnées sélectionnées
pour représenter une région acquise à un fort grossissement dans les images à moyen grossissement. La transformée de
de x50.000 la taille MxM des ROI doit être de : Fourier est utilisée pour détecter la présence éventuelle de
N (1) pics de diffractions qui confirmeraient la présence d’une
M= structure cristalline [4, 12].
10
Les différentes étapes du processus sont les suivantes : La fonction de transfert en contraste (CTF) du micros-
(a) Détection des contours de l’image lissée avec un filtre de cope engendre dans l’espace réciproque un bruit qui peut être
Prewitt ; important. Ce bruit se présente sous forme d’anneaux
(b) Pour chaque objet (groupe de pixels connexes), le rec- concentriques et sont appelés anneaux de Thon [9]. Leur
tangle convexe le plus petit est déterminé (bounding box) ; présence ne permet pas d’identifier les pics par un simple
(c) Chaque rectangle est ensuite divisé en carrés de taille seuillage de l’image. La méthode proposée ne nécessite au-
MxM (Figure 7, gauche). La sous-segmentation des bounding cune connaissance a priori sur l’éventuelle maille de la struc-
box plutôt que de l’image entière permet de mieux position- ture à identifier, sur la CTF ou sur les réglages du microsco-
ner les ROI autour des contours détectés. pes : le fond de l’image réciproque est d’abord évaluer pour
(d) La quantité de ROI est ensuite réduite en éliminant les éliminer les effets des anneaux de Thon (Figure 8), puis il est
moins intéressantes : soustrait à l’image réciproque initiale (Figure 9). L’image
- un seuil est choisi pour s’assurer que la quantité de contours dont le fond est corrigé peut alors être seuillée pour identifier
à l’intérieur d’une ROI est suffisamment importante, les pics.
- les ROI qui se chevauchent sont limités afin d’éviter les Pour estimer le fond d’une image réciproque, le profil
acquisitions redondantes, radial moyen peut être mesuré (exemple par le programme
- pour chaque ROI, le niveau de gris dans l’image initiale est MRC) ou en estimant la CTF. La valeur Vf du profil radial
étudié pour éliminer les régions trop foncées (agrégats de moyen peut s’exprimer comme suit :
membranes ou artefacts) d’où aucune information ne peut ∑ ( x f ,θ , y f ,θ )
être extraite à fort grossissement. Vf = θ (2)
Les ROI restantes (Figure 7, droite) sont retenues pour être nθ
analysées à fort grossissement et pour identifier la présence où f est la fréquence et nθ le nombre de pixels utilisés de
possible de structure cristalline. coordonnées (xf,θ,yf,θ) ayant la même fréquence f mais diffé-
rents angles θ. Vf est l’estimé du niveau de gris du fond sous-
trait au spectre de puissance initial. L’image résultante est
ensuite seuillée (Figure 8 et Figure 9). Le profil moyen doit
représenter le niveau de gris radial du fond, mais sa valeur
peut être légèrement biaisée aux fréquences où se trouvent
des pics de diffractions. Pour réduire leur effet, les valeurs
extrêmes ne sont pas considérées lors du calcul de Vf.
Pour rendre l’exécution du processus plus efficace, la
fenêtre d’analyse de la FFT a été réduite lors de
l’implémentation. Comme la coloration négative utilisée
limite la résolution à 20 Å, l’analyse a été réduite aux fré-
quences plus basses. Au-delà de 20 Å, il est inutile
d’analyser l’image. La zone d’intérêt est déterminée par le
cercle C20 positionné à 20 Å (Fig. 8) dont le rayon (en
pixels) est donné par :
4Å (3)
Rrc = R fft ×
20Å
avec (2.Rfft) la longueur totale en pixels de la fenêtre de Fou-
rier (1024 pixels dans notre cas lorsque la FFT est faite sur
toute l’image), 4 Å la taille d’un pixel dans le plan réel et 20
Å la résolution limite d’intérêt. De plus, en raison de la sy-
Figure 7 (gauche) MxM ROI sélectionnées d’après les métrie de la FFT, le profil radial moyen peut être calculé sur
contours détectés (étapes (a) à (c)) et (droite) ROI restan- la moitié de la fenêtre avec θ = [0 ; π]. Notons enfin que,
tes après réjection des zones les moins intéressantes comme l’analyse repose sur le profil radial, le microscope
(étape (d)). La taille des images est d’environ 10 x 10 µm. doit être réglé afin de réduire l’astigmatisme.
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elle assister le contrôle automatique d’un microscope électronique à transmission ?", 2ème Conférence sur la Vision Artificielle (CVA), Tizi
Ouzou, Algérie, Vol. 2, pp. 257-263, 2007.A moyen grossissement, l’étape de pré-classification
des images constitue une étape utile en terme de gain de
temps. Elle évite le traitement à moyen et fort grossissement
des images où aucune ou peu d’informations peuvent encore
être extraites. Différentes images acquises avec différents
microscopes (Hitachi H-7000, Hitachi H-8000, Philips
CM200 et FEI Tecnai F30) ont été testées et les résultats ne
montrent aucune erreur significative de cette pré-
classification. Seules certaines images d’agrégats de mem-
branes peuvent mener à discussions quant à savoir si elles
doivent être analysées ou non.
Figure 8 Transformée de Fourier (gauche) d’une image Quant à la sélection des régions d’intérêts, il s’agit
d’un cristal à fort grossissement, avec Rfft la moitié de la d’une étape difficile à évaluer objectivement, mais on peut
taille de l’image, C20 le cercle de rayon Rrc à la résolution cependant affirmer que l’objectif principal est atteint puis-
de 20 Å ; profil radial moyen (droite). que cette étape permet de réduire considérablement le temps
d’acquisition et la quantité d’images acquises à fort grossis-
sement en triant les zone plus ou moins intéressantes. Nous
sommes en train de développer une méthode multi-échelles
pour la segmentation de ces images [2]. Cette approche de-
vrait permettre d’extraire plus d’informations sur
l’échantillon (taille des membranes, forme, degré
d’agrégation) et de mieux positionner les régions d’intérêt
(au milieu des membranes plutôt que sur les bords).
Quant à l’algorithme développé pour les images acqui-
ses à fort grossissement, les résultats obtenus se montrent
satisfaisants et concordent avec les observations. Nous
Figure 9 Image réciproque après correction du fond à avons remarqué que des spots de diffractions pouvaient en-
l’intérieur du cercle C20 (gauche), puis image seuillée core être identifiés lorsque que seulement un quart de
(droite) l’image 1024 x 1024 pixels était occupé par une membrane
cristalline. La mise en place d’un critère de qualité du cristal
5. RESULTATS ET DISCUSSION peut ensuite être basé sur plusieurs critères ; dans
L’algorithme développé pour les images acquises à faible l’implémentation courante, le nombre de pics de diffractions
grossissement a été testé sur deux grilles différentes. La clas- détectés et la résolution de ces pics sont enregistrés pour
sification automatique est très proche de la classification ma- informer l’utilisateur sur la qualité du cristal.
nuelle (Table 1 et Table 2). Les quelques orifices faux néga-
tifs sont principalement dus au seuil exigent quant à la taille
des orifices (la surface d’un orifice doit être au moins 75% 6. CONCLUSION
celle de l’orifice le plus grand). Il n’y a par contre aucun faux Dans ce papier, nous avons présenté un processus automati-
positif ce qui est très bien puisque ce sont ceux qui auraient que permettant d’évaluer la qualité de la cristallisation de
été les plus problématiques. protéines. Cette série d’algorithmes basés sur des principes
simples de traitement d’images montre comment le traite-
Table 1. Comparaison entre une classification manuelle et ment d’image peut intervenir pour non seulement évaluer
automatique d’orifices de grilles une quantité d’images, mais aussi fournir des informations à
A/ Grille 1 différentes étapes du processus d’acquisition afin de rendre
Classification manuelle
Orifices Orifices rejetés cette acquisition plus pertinente. Les algorithmes dévelop-
sélectionnés pés ne requièrent aucune intervention de l’utilisateur. A fai-
Orifices
Classification sélectionnés
166 ble grossissement, l’algorithme développé donne des résul-
automatique Orifices rejetés
2 19
tats très bons pour l’évaluation de la qualité des grilles. Cet
algorithme n’est pas spécifique à notre spécimen car les gril-
les sont les supports habituels utilisés pour l’observation de
B/ Grille 2 spécimens au MET. A moyenne résolution, une méthode est
Classification manuelle
Orifices Orifices rejetés
proposée pour éliminer les images puis les régions sur les-
sélectionnés quels les informations quant aux membranes sont les moins
Orifices
164 intéressantes. Enfin, un algorithme de détection de pics de
Classification sélectionnés
automatique Orifices rejetés diffraction à fort grossissement est proposé pour identifier si
5 125
l’expérience de cristallisation 2D a échoué ou réussie.
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elle assister le contrôle automatique d’un microscope électronique à transmission ?", 2ème Conférence sur la Vision Artificielle (CVA), Tizi
Ouzou, Algérie, Vol. 2, pp. 257-263, 2007.Remerciements. Ce travail est soutenu par EU 6th frame- M. Roseman, F. J. Sigworth, N. Volkmann, and C. S.
work (HT3DEM, LSHG-CT-2005-018811). Les images utili- Potter, "Automatic particle selection: results of a com-
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