Diagnostic et méthodes de détection de Xylella fastidiosa - Séminaire Xylella fastidiosa - Anses - Maisons-Alfort - 10 mars 2016
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Diagnostic
et méthodes de détection
de Xylella fastidiosa
Photo Anses LSV Photo Anses LSV
Séminaire Xylella fastidiosa – Anses – Maisons-Alfort - 10 mars 2016
Anses - Laboratoire de la santé des végétaux
Laboratoires
Unité
de référence
Nématologie Unité
Rennes Mycologie
Siège Nancy
et
Unité Bactériologie,
virologie, OGM
Angers
Unité
Quarantaine
Clermont-
Ferrand
Unité
Entomologie et
plantes
invasives
Montpellier Unité Ravageurs et
agents pathogènes
tropicaux
La Réunion
1
Xylella fastidiosa : activités de référence
Laboratoire de la santé des végétaux
Unité Bactériologie, Virologie, OGM (UBVO)
Depuis 2002: analyses pour l’unité de quarantaine post-
entrée LSV Clermont-Ferrand, par sérologie (IF, ELISA) sur
matériel de multiplication (importation à titre dérogatoire)
2010 - 2012:
• travaux bibliographiques sur les méthodes de détection,
l’épidémiologie
• Constitution d’une collection de souches
• Production d’un antisérum IF (INRA Nantes)
2
Xylella fastidiosa : activités de référence
2012:
• 1ère détection sur caféiers interceptés
en France
• Etude de risque Anses (Saisine N° 2012-SA-0121)
2012-2013: Optimisation, évaluation et validation de
méthodes de détection moléculaires sur plantes hôtes
Octobre 2013: Foyer en Italie sur olivier
2014: Essai inter-laboratoires de validation avec 7
laboratoires: Italie, Pays-Bas, Nouvelle-Zélande, Royaume-
Uni, France
2015: Publication de la méthode de référence française
pour la détection de Xylella fastidiosa par PCR en temps
réel sur plantes hôtes
3
Xylella fastidiosa : activités de référence
Juillet 2015: Première détection en Corse
Octobre 2015: Première détection en région PACA
Sept-novembre 2015: Formation de 5 laboratoires agréés
et délégation des analyses de routine après essais inter-
laboratoires d’aptitude conformes
2016: Travaux en cours sur les méthodes de détection sur
insectes vecteurs
2016: Participation du LSV à la rédaction du protocole
OEPP de détection de X. fastidiosa.
4
Méthode de référence MA039 version 1
Détection de X. fastidiosa sur plantes hôtes par PCR en
temps réel : Méthode évaluée et validée
Méthode disponible sur : www.anses.fr
Extraction d’ADN automatisée avec le kit QuickPick™ Plant
DNA (Bio-Nobile) et l’automate KingFisher™ mL
PCR en temps réel Harper et al., 2010, Erratum 2013
5
Méthode de référence MA039 version 1
Xylella fastidiosa: bactérie du xylème
Analyse réalisée sur tissus fortement vascularisés de
plantes en végétation: pétioles et/ou nervures centrales
0,5 à 1 g par
échantillon:
1 échantillon soit 5 à 100 pétioles
2 prélèvements pour
extraction d’ADN
4 amplifications géniques
6
Perfomance de la méthode ( MA039 ver01)
Extraction ADN: QuickPick™ + KingFisherTM mL
Critères de performance
Amplification Harper et al., 2010 (Erratum 2013)
Sur souches pures
100% (23 souches cibles testées;
Inclusivité
4 principales sous-espèces.)
Exclusivité 100% (29 souches non-cibles testées)
Sur matrices végétales (conc. bact. 10² à 105 bact./mL )
Matrice Oranger Vigne Olivier
+ X. f. subsp. pauca + X. f. subsp. fastidiosa + X. f. subsp. multiplex
Sensibilité 100% 94% 67%
Specificité 100% 100% 100%
Répétabilité 100% 96% 100%
Reproductibilité 98%
Limite de détection
(avec probabilité de détection ≈ 10² bact./mL ≈ 103 bact./mL ≈ 105 bact./mL
de100%)
Méthode performante mais inhibition sur certaines matrices
(ex : olivier, chênes) : travaux en cours… 7
Schéma de détection
Prélèvements
DRAAF/SRAL ou délégataires (FREDON)
Analyse de 1ère intention
Réseau de 5 laboratoires agréés
PCR en temps réel Harper et al., 2010, err. 2013
Résultat de type indéterminé Rapport d’analyse
ou résultat positif pour nouvelle positif ou négatif
plante hôte et/ou nouveau foyer
Plus de 6700
Confirmation analyses de 1ère
intention du
Laboratoire de référence LSV 22/07/2015 (début
de foyer) au
29/02/2016
8
Schéma de détection
Confirmation
Laboratoire de référence LSV
PCR en temps réel Identification de Isolement
la sous-espèce de
et typage la souche
Rapport d’analyse Rapport d’analyse avec Séquençage complet
positif, négatif ou mention de la sous- du génome
indéterminé espèce si demande
Si résultat indéterminé
Demande de nouveau
prélèvement
9Schéma de détection
Identification de la sous-espèce et typage
PCR conventionnelles : Amplification 7 gènes de ménage
- Hernandez-Martinez et al., 2006 (Scally et al., 2005 / Yuan et al., 2010)
subsp. fastidiosa, multiplex, MLSA/MLST
sandyi Identification subspécifique
- Pooler et Hartung., 1995 Positionnement phylogénique
subsp. pauca Détermination du sequence-type
Rapport d’analyse positif
avec mention de la sous-espèce
10Identification des souches X. fastidiosa
2 profils différents de Xylella fastidiosa,
présents à la fois en Corse ST7
et en région PACA:
X. fastidiosa subsp. multiplex
profil A (ST7)
profil B (ST6)
Distinctes de la
souche CoDiRO
X. f. subsp. pauca ST6
présente en Italie
MLSA/MLST
(Scally et al., 2005 / Yuan et al., 2010)
11Isolement sur milieu
• Prélèvement : segment de pétiole (≈ 1 cm)
• Désinfection : alcool / flambage
• Dilacération / macération
• Etalement sur milieu de culture PWG modifié
• Incubation : 28°C
• Lecture: colonies visibles après 1 à 3 semaines (diam. < 1,5 mm)
X.f. subsp. fastidiosa isolée de Coffea X.f. subsp. pauca isolée de Coffea
canephora sur milieu B-CYE arabica sur milieu PWG modifié
12Isolats de X. fastidiosa en collection
17 isolats de Corse (les 2 profils multiplex, diversité de plantes hôtes)
Ref. Subsp. Host plant Year
LSV4677 multiplex 1 ST7 Polygala myrtifolia 2015
LSV4678 multiplex 2 ST6 Spartium junceum 2015
LSV4679 multiplex 2 ST6 Spartium junceum 2015
LSV4706 multiplex 1 ST7 Polygala myrtifolia 2015
LSV4707 multiplex 2 ST6 Polygala myrtifolia 2015
LSV4708 multiplex 1 ST7 Polygala myrtifolia 2015
LSV4710 multiplex 2 ST6 Lavandula sp. 2015
LSV4713 multiplex 2 ST6 Prunus cerasifera 2015
LSV4714 multiplex 2 ST6 Lavandula angustifolia 2015
LSV4716 multiplex 1 ST7 Polygala myrtifolia 2015
LSV4717 multiplex 2 ST6 Polygala myrtifolia 2015
LSV4718 multiplex 1 ST7 Polygala myrtifolia 2015
LSV4719 multiplex 1 ST7 Polygala myrtifolia 2015
LSV4720 multiplex 1 ST7 Cistus monspeliensis 2015
LSV4721 multiplex 1 ST7 Pelargonium sp. 2015
LSV4722 multiplex 1 ST7 Polygala myrtifolia 2015
LSV4723 multiplex 2 ST6 Coronilla valentina 2015
Caractères gras: génome complet séquencé et analysé (collaboration INRA Angers - Emersys)
13Isolats de X. fastidiosa en collection
3 isolats de région PACA
Ref. Subsp. Host plant Year
LSV4711 multiplex 2 ST6 Polygala myrtifolia 2015
LSV4712 multiplex Polygala myrtifolia 2015
LSV4715 multiplex 1 ST7 Polygala myrtifolia 2015
7 isolats de Coffea sp. interceptés
Ref. Subsp. Host plant Year
LSV4103 pauca Coffea arabica 2012
LSV4209 fastidiosa /sandyi Coffea canephora 2012
sandyi (atypical 6 new
LSV4627 Coffea arabica 2014
alleles/7)
LSV4628 sandyi Coffea arabica 2014
LSV4639 sandyi Coffea arabica 2014
LSV4659 sandyi Coffea sp. 2014
LSV4709 pauca ST53 Coffea arabica 2015
CFBP
Mise en collection en cours au Cirm CFBP Angers
Caractères gras: génome complet séquencé et analysé (collaboration INRA Angers - Emersys) 14Plantes hôtes identifiées en Corse
• Acer pseudoplatanus • Lavandula stoechas
• Artemisia arborescens • Myrtus communis
• Asparagus acutifolius • Hebe sp.
• Cistus monspeliensis • Polygala myrtifolia
• Cistus salviifolius • Prunus cerasifera
• Coronilla valentina • Quercus suber
• Cytisus racemosus • Rosa x floribunda
• Genista ephedroides • Rosmarinus officinalis
• Pelargonium graveolens • Spartium junceum
• Lavandula angustifolia
• Lavandula dentata
En vert: nouvelles plantes hôtes (genre et/ou espèce),
non listées précédemment par l’EFSA (Scientific opinion 2015).
Scientific report EFSA 2016 :
359 espèces hôtes / 75 familles botaniques
15Echantillons positifs - Campagne 2015 / 2016
Région Corse (Période 22 juillet 2015 – 29 février 2016)
Espèces hôtes (liste non exhaustive) % positifs Total éch. Positifs
Polygala myrtifolia 34 % 1269 433
Spartium junceum 25 % 60 15
Cistus monspeliensis 20 % 70 14
Région PACA (Période 22 juillet 2015 – 29 février 2016)
Polygala sp. 6% 349 22
National (Année 2015)
Coffea sp. 15 % 143 21
16Faits marquants
Echantillons positifs en Corse en période hivernale:
• Polygala myrtifolia
• Lavandula sp.
• Cistus monspeliensis
• …
Photo: Jean-Pol GRANDMONT:
Source: www.wikipédia.fr
Avec concentration bactérienne parfois élevée
contrairement à ce qui est généralement décrit
pour des climats similaires (Californie)
17Symptomatologie - diagnostic
Un diagnostic difficile
dû à une symptomatologie non caractéristique
Plantes parfois asymptomatiques (ex: caféiers)
Bactérie du xylème
Capable de produire des biofilms obstruant les vaisseaux
X.f. dans les vaisseaux d’une feuille de vigne (Chardonnay).
(ca. x 4,000). Photo E. W. Kitajima (ESALQ/USP/Brazil).
18Brûlures foliaires
Olivier, amandier (ALS), Confusions possibles:
polygala, chênes, laurier-rose, … • Stress hydrique
• Sénescence naturelle
Polygala myrtifolia - Corse
Photo Anses LSV
19Brûlures foliaires
Erable sycomore
(Acer pseudoplatanus)
Corse
Photo Anses LSV Photo Anses LSV
20Brûlures foliaires et dépérissement
Olivier (Olea europaea)- Puglia - Italie
Photo: SRAL Corse
Photo: Donato Boscia
21Chloroses foliaires, réduction de la taille des fruits
Confusions possibles: Oranger (Citrus sinensis)
• Carences nutritionnelles
en oligo-éléments
Caféier commun (Coffea arabica)
M. Scortichini, Istituto Sperimentale per la Frutticoltura,
Photo Anses LSV Photo Maria Lopez
Rome (IT)
22Symptômes sur vigne
Confusions possibles:
• Sénescence en fin de période
végétative
• Nécrose bactérienne sur vigne
(X. ampelinus)
• Maladie fongiques
Photo: Leonardo De La Fuente : (Georgia, Cabernet S)
23Nanisme, port tombant…
Luzerne
(Medicago sativa)
Pêcher (Prunus persica)
Phony peach disease
Photo Joao Roberto Spotti Lopes Photo: Hopkins and Purcel, 2002
24Détection de X. fastidiosa sur insectes vecteurs
Travaux de méthodologie sur cercopes des prés
(Philaenus spumarius) collectés
par l’Unité Entomologie
• Contamination artificielle
• Comparaison de méthodes
d’extraction de l’ADN
(sur tête après ablation des yeux):
QuickPick Plant Blood and Protocole CTAB DNeasy Plant
DNA kit (Bio- Tissue kit mini kit (Qiagen)
Nobile) (Qiagen)
Meilleure sensibilité
avec la PCR temps réel Harper et al., 2010
Prochaine étape: Travaux sur insectes naturellement contaminés
25Conclusion et perspectives
Un diagnostic visuel délicat : symptômes atypiques, plantes
contaminées asymptomatiques, plus de 350 plantes hôtes
connues, flore européenne…
Une méthode de détection performante, mais un seuil de
détection à améliorer sur espèces « difficiles » (olivier,
chênes,…)
Une méthode de détection sur insecte en cours d’évaluation
Projets de recherches nationaux et européens :SapAlien
(INRA Emersys: pouvoir pathogène, Ponte (détection sur
insectes, etc…),…
Photo: Donato Boscia Photo: Françoise Petter
26Merci pour votre attention
Photo Anses LSV
Photo Anses LSVInterprétation des résultats
PCR en temps réel Harper et al., 2010, erratum 2013
Cut-off
Ct = 35
Positif
Ct ≤ 35
Ct>35 : résultat indéterminé
Ligne de seuil
Negatif
9Distribution ST / ST7
Période 21 juillet 2015 – 29 février 2016
National ST6 /ST7Echantillons positifs - Campagne 2015 / 2016
Région Corse (Période 22 juillet 2015 – 29 février 2016)
Espèces hôtes (liste non exhaustive) % positifs Total éch. Positifs
Polygala myrtifolia 34 % 1269 433
Spartium junceum 25 % 60 15
Cistus monspeliensis 20 % 70 14
Pelargonium sp. (dont Pelargonium graveolens) 15 % 117 18
Lavandula sp. 14 % 154 22
Myrtus communis 2% 162 3
Quercus suber 2% 109 2
Rosmarinus officinalis 1% 305 2
Région PACA (Période 22 juillet 2015 – 29 février 2016)
Polygala sp. 6% 349 22
National (Période 22 juillet 2015 – 29 février 2016)
Coffea sp. 15 % 143 21
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