Edition du génome pour la dystrophie myotonique de type 1 - Ana Buj Bello Colloque Fondation Maladies Rares, 24 juin 2020
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Edition du génome pour la
dystrophie myotonique de type 1
Ana Buj Bello
Colloque Fondation Maladies Rares, 24 juin 2020
Edition du génome
Modification du génome d’une cellule dans une région ciblée
grâce à des nucléases
Méganucléases
Nucléases à doigts
de zinc (ZFN)
Nucléases
effectrices de type
activateur de
transcription
(TALEN)
Le système
CRISPR-Cas
Le système CRISPR/Cas9
Le système CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) – Cas (CRISPR-
associated protein) : réponse immunitaire adaptative chez les bactéries
Modified from Pennisi E, Science 2013
Ø Un RNA guide (sgRNA) reconnait une séquence cible de l’ADN adjacente à
un PAM (protospacer adjacent motif)
Ø La nucléase Cas9 clive la double hélice d’ADN de la région ciblée
(variants nickase, dead Cas9)
Le système CRISPR/Cas9
Non-homologous end-joining Homology-directed repair
Chemello et al.
J Clin Invest, 2020
Petites insertions/délétions (1 coupure)
Grandes délétions (2 coupures)
Induction de perte de fonction
Elimination de mutations dominantes
avec gain de fonction
Le système CRISPR/Cas9
Non-homologous end-joining Homology-directed repair
Chemello et al.
J Clin Invest, 2020
Petites insertions/délétions (1 coupure) Insertions de fragments d’ADN
Grandes délétions (2 coupures)
Induction de perte de fonction Correction de mutations récessives
Elimination de mutations dominantes Locus endogène
avec gain de fonction Locus AAVS1 ou autre
Autres outils CRISPR
Régulation expression Édition de bases (base editing)
Modification d’une base
Inhibition gène (SNP, inactivation gène)
Prime editing
Activation gène Insertion, délétion,
modification ponctuelle
Doudna JA. Nature, 2020
Edition du génome
Prakash et al. Mol Ther 2016
Potentiellement nombreuses maladies génétiques
Difficultés: Efficacité (mosaïsme)
Spécificité (mutations hors cible, tissulaire)
Vectorisation (nanoparticules, vecteurs AAV)
Réponse immunitaire
Difficulté prévoir effets indésirables
CRISPR dans le muscle Preuve de concept: DMD
CRISPR dans le muscle 3-90% dystrophine
Dystrophie myotonique type 1 La plus fréquente myopathie héréditaire chez l’adulte (maladie de Steinert) Prévalence: 1:8,000 (~1:600 Québec) Autosomique dominante (19q13-3 locus) Expansion répétition CTG dans 3’UTR du gène DMPK Phénomène d’anticipation
Dystrophie myotonique type 1
Manifestations cliniques hétérogènes : taille du triplet
(formes congénitale à adulte)
Maladie multi-systémique
Gomes-Pereira et al.
Trends Mol Med, 2011
Pas de traitement curatifPhysiopathologie
DAPI
FISH (CAG)7
Merge
Klein et al, Current Gene Therapy Rev 2015
Gain de fonction toxique des ARN DMPK avec expansion CUGCRISPR-Cas9 pour DM1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
(CTG)n
Délétion de l’expansion CTG du 3’UTR du gène DMPK par
CRISPR-Cas9
Validation in vitro dans AAV
des cellules dérivées de Cas9/sgRNA Modèle murin DM1
patients DM1
Collaboration avec D. Furling et G. Gourdon, ParisCRISPR-Cas9 pour DM1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
(CTG)n
Délétion de l’expansion CTG du 3’UTR du gène DMPK par
CRISPR-Cas9
sgRNAs Cas9
Vecteurs AAV recombinants
Capacité d’encapsidation limitée (4.7 kb)CRISPR-Cas9 pour DM1
Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9) ~3.2 kb sgRNA
number
%
cutting
by
TIDE
1 47.4
4 42.4
7 43.8
8 42
10 7.8
12A 32.5
12B 28.8
13A 36.5
13B 22.7
15 3.3
17A 1.8
17B 2
19 1.1
22 7.9
Transfection de cellules Hela 23 48.3CRISPR-Cas9 pour DM1
Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9)
Undeleted
Deletions
Transfection de cellules HelaCRISPR-Cas9 pour DM1
Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9)
Undeleted
Deletions
Transfection de cellules HelaCRISPR-Cas9 pour DM1
Vecteurs lentiviraux
Myoblastes immortalisés de patients
DM1 (2600 répétitions CTG)
Délétion de l’expansion CTG dans les myoblastes DM1 en cultureCRISPR-Cas9 pour DM1 Analyse des foci : FISH-RNA DAPI SaCas9-HA sgRNA_GFP (CAG)7 Réduction des foci nucléaires dans les myoblastes DM1 en culture
CRISPR-Cas9 pour DM1
Clones cellulaires dérivés de myoblastes DM1 immortalisés
transduits avec les lentivirus exprimant CRISPR/SaCas9
Isolement de Amplification des clones
cellules GFP +
Sélection de clones FISH
sans fociCRISPR-Cas9 pour DM1
CRISPR-Cas9 pour DM1 Pas d’insertions/délétions (indels) dans des sites off-target potentiels
CRISPR-Cas9 pour DM1
Correction des défauts d’épissage alternatif
Myoblasts Myotubes
Differentiation
mediumCRISPR-Cas9 pour DM1 Correction des défauts d’épissage alternatif Les profils d’épissage de transcrits dans les myotubes DM1- Delta sont en général comparables à ceux des controles
CRISPR-Cas9 pour DM1
• Fragment de 45 Kb du locus DM1 avec
le gène DMPK >1000 CTG répétitions
• Défauts de croissance et réduction de
l’espérance de vie chez les souris
homozygotes
• Accumulation de foci (défauts mineurs
de l’épissage alternatif)
Gomes-Pereira et al, PLoS Genetics 2007CRISPR-Cas9 pour DM1 2 vecteurs AAV9
CRISPR-Cas9 pour DM1
2 vecteurs AAV9
Injection intramusculaire (tibialis anterior)
Souris homozygotes (âge: 5-9 semaines)
1x1011 vg des AAV9-CRISPR-SaCas9
PBS dans le muscle contralatéral
Analyse 1 mois post-injectionCRISPR-Cas9 pour DM1
2 vecteurs AAV9
70% de noyaux sgRNA-GFP positifs
21% de noyaux SaCas9 positifs
18% de noyaux double positifsCRISPR-Cas9 pour DM1
2 vecteurs AAV9
Délétion de l’expansion CTG dans les muscles DMSXLCRISPR-Cas9 pour DM1 Peu d’indels dans la région ciblée du génome des fibres musculaires
CRISPR-Cas9 pour DM1 AAV9-CRISPR-SaCas9 diminue le nombre de foci nucléaires in vivo
Conclusions
DMPK (CTG)n
Sélection d’ARN guides efficaces pour la délétion des
répétitions CTG du gène DMPK par SaCas9
Excision de l’expansion CTG dans des lignées de
myoblastes dérivées de patients DM1 et correction des
signes pathologiques (foci nucléaires, épissage
alternatifs de transcrits)
Preuve-de-concept de la délétion de l’expansion CTG du
gène DMPK dans le muscle des souris DM1 par Lo Scrudato et
al. 2019
administration de vecteurs AAV9-CRISPR-Cas9 et
correction de signes pathologiques
2 demandes de brevetRemerciements
Membres de l’équipe Collaborateurs
Denis FURLING
Mirella LO SCRUDATO Geneviève GOURDON
Karine POULARD & équipe
Célia SOURD Institut de Myologie, Paris
Plateformes de Généthon Mario AMENDOLA Jean-Paul CONCORDET
Développement technologique & équipe Carine GIOVANNANGELI
Imagerie, Bioexpérimentation MNHN, ParisMerci de votre attention
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