FRET ("Förster / fluorescence resonance energy transfer")
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FRET (“Förster / fluorescence resonance energy transfer”)
I - Théorie
II - Méthodes de mesure
III - Applications à des études biologiques
IV - Un exemple de l’utilisation du FRET : étude de l’interaction CXCR4 / PKCα
V - Perspectives et limites du FRET ; autres techniques complémentaires
Marion PETER
marion.peter@igmm.cnrs.fr
FRET (“Förster / fluorescence resonance energy transfer”) I - Théorie II - Méthodes de mesure III - Applications à des études biologiques IV - Un exemple de l’utilisation du FRET : étude de l’interaction CXCR4 / PKCα V - Perspectives et limites du FRET ; autres techniques complémentaires
Rappels sur la fluorescence Le phénomène de fluorescence est la propriété d’une molécule d’émettre, lorsqu’elle est excitée par un rayonnement de longueur d’onde λ1, un rayonnement d’une longueur d’onde λ2, telle que λ2 est supérieure à λ1. La fluorescence peut : - être naturelle : autofluorescence - résulter de l’adjonction d’un fluorophore sur un constituant cellulaire - résulter du couplage d’un fluorophore à un anticorps, permettant la détection d’une protéine particulière dans la cellule - résulter de l’ajout d’un ADNc codant pour un fluorophore à l’ADNc codant pour la protéine d’intérêt considérée
FRET (“Förster / fluorescence resonance energy transfer”) Définition : Processus non radiatif par lequel de l’énergie d’un fluorophore donneur à l’état excité est transmis à un fluorophore accepteur à proximité immédiate (distance < 10 nm).
FRET (“Förster / fluorescence resonance energy transfer”)
Conditions :
- excitation du donneur
- chevauchement
du spectre d’émission du donneur
et du spectre d’absorption de l’accepteur
- orientation donneur / accepteur favorable
et distance donneur / accepteur < 10 nm
détection d’interactions moléculaires
(D’après Bastiaens and Pepperkok, 2000)
FRET (“Förster / fluorescence resonance energy transfer”)
Conséquences :
- diminution de l’intensité de fluorescence du donneur
et augmentation de l’intensité de fluorescence de l’accepteur
- diminution de la durée de vie de fluorescence du donneur
définition de la durée de vie de fluorescence : durée moyenne pendant laquelle un fluorophore
reste à l’état excité après absorption d’un photon (de l’ordre de ps à ns).
intensité d’émission
donneur seul
donneur en présence d’accepteur
et lorsqu’il y a FRET
τDA τD
temps
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Méthodes de mesures du FRET
Mesures d’intensités de fluorescence
- mesures de ratios donneur / accepteur
la stœchiométrie donneur / accepteur doit être constante au cours de
l’expérience
ex. biosenseur
- mesures de l’augmentation de l’intensité de l’accepteur
corrections à apporter concernant la fluorescence détectée dans le
canal de l’accepteur due au donneur
- mesures de l’intensité du donneur après photobleaching de l’accepteur
débris
Mesures de durées de vie de fluorescence
Choix de la technique de FLIM
(“fluorescence lifetime imaging microscopy”)
pour mesurer le FRET
Avantages :
- la durée de vie de fluorescence est indépendante de la concentration
de fluorophore et du chemin de la lumière
- si l’accepteur est en excès, le FRET mesuré par FLIM est indépendant
de la distribution subcellulaire des concentrations protéiques
- cette technique permet de déterminer la proportion de molécules en
interaction dans chaque voxel d’une cellule
- les images présentent un bon rapport signal / bruit
Choix de la technique de FLIM
(“fluorescence lifetime imaging microscopy”)
pour mesurer le FRET
Inconvénients :
- les temps d’acquisition sont souvent longs
- l’équipement est coûteuxMéthodes de mesure de durées de vie de fluorescence
intensité
τDA τD
temps
(D’après Bastiaens and Squire, 1999)TCSPC (“time-correlated single photon counting”)
Pulse d’excitation
Intensité
Forme d’onde de fluorescence
Temps
Δt Δt
Référence
Intensité
Evénements
TempsFRET (“Förster / fluorescence resonance energy transfer”) I - Théorie II - Méthodes de mesure III - Applications à des études biologiques IV - Un exemple de l’utilisation du FRET : étude de l’interaction CXCR4 / PKCα V - Perspectives et limites du FRET ; autres techniques complémentaires
Applications
Etude d’interactions intramoléculaires :
- changements conformationnels de protéines
- dimérisation de protéines
- caractérisation de complexes macromoléculaires
- biosenseurs : applications à l’étude d’activités enzymatiques, à la détermination
de concentration d’ions (Ca2+) ou de métabolites (AMPc)
(D’après Zhang et al, 2002)Applications
Etude d’interactions intermoléculaires :
- protéine / protéine
- protéine / ADN
(D’après Zhang et al, 2002)Pourquoi le FRET ? Il est souhaitable de savoir où et quand, dans une cellule, des molécules d’intérêt interagissent. La majorité des autres approches expérimentales ne permettent pas d’obtenir ces informations, que ce soit : - la microscopie à fluorescence “classique”, la microscopie confocale ou la microscopie électronique - les approches biochimiques : immunoprécipitation et “western blot”, “pull-down”, fractionnement cellulaire, tests d’activité enzymatique...
Démarche expérimentale Ex. pour une étude d’interaction protéine / protéine in vivo - choix de la stratégie : soit 2 protéines exprimées en fusion avec des protéines fluorescentes soit 1 protéine exprimée en fusion avec une protéine fluorescente et 1 autre protéine détectée par un anticorps fluorescent (ou protéines recombinantes marquées avec des fluorophores) - choix de la place de l’étiquette fluorescente : d’après les caractéristiques connues des protéines d’intérêt (ex. propriétés biologiques, données structurales) - test de l’effet de l’ajout de l’étiquette fluorescente sur les propriétés des protéines d’intérêt, par rapport aux protéines endogènes (ex. localisation subcellulaire, propriétés enzymatiques le cas échéant) - étude de la colocalisation des protéines d’intérêt, en microscopie confocale - étude de leur interaction éventuelle par FRET
Démarche expérimentale Ex. pour une étude d’interaction protéine / protéine in vivo - étude de leur interaction éventuelle par FRET microinjecter ou transfecter des vecteurs codant pour le donneur et l’accepteur en fusion avec des protéines fluorescentes pour des mesures de FRET par mesures de durée de vie de fluorescence du donneur, mesurer : la durée de vie de fluorescence du donneur seul la durée de vie de fluorescence du donneur en présence d’accepteur utiliser éventuellement des mutants permettant d’abolir l’interaction (contrôle négatif) ou de rendre l’interaction constitutive (contrôle positif)
FRET (“Förster / fluorescence resonance energy transfer”) I - Théorie II - Méthodes de mesure III - Applications à des études biologiques IV - Un exemple de l’utilisation du FRET : étude de l’interaction CXCR4 / PKCα V - Perspectives et limites du FRET ; autres techniques complémentaires
Choix du couple de fluorophores EGFP / mRFP1
pour des expériences de FRET / FLIM
Figure 1 A
1.0
0.8 CFP
Normalised Intensity
YFP
eGFP
0.6
mRFP1
0.4
0.2
0.0
500 550 600 650 700
Wavelength (nm)
(D’après Peter et al., 2005)Choix du couple de fluorophores EGFP / mRFP1
pour des expériences de FRET / FLIM
Figure 1 B
(D’après Peter et al., 2005)Choix du couple de fluorophores EGFP / mRFP1
pour des expériences de FRET / FLIM
Figure 2
5000 A 10000 B 10000 C
4000 8000 8000
Photon Counts
Photon Counts
Photon Counts
3000 6000 6000
raw data
raw data
1-! "2= 6.72 raw data
2000 4000 4000 1-! "2= 4.27
2-! "2= 1.25 1-! "2= 1.09
2
2-! " = 1.13
1000 2000 2000
0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
Weighted Residuals
12 12 12
Time (ns) Time (ns) Time (ns)
8 1-! 8 8 1-!
4 4 1-! 4
Weighted Residuals
Weighted Residuals
0 0 0
-4 -4 -4
-8 -8 -8
-12 -12 -12
12 0 1 2 3 4 5 6 12
8 Time (ns) 8
2-! 2-!
4 4
0 0
-4 -4
-8 -8
-12 -12
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
Time(ns) Time(ns)
(D’après Peter et al., 2005)Choix du couple de fluorophores EGFP / mRFP1
pour des expériences de FRET / FLIM
Figure 3
τ = 2.05 ± 0.1 ns
(D’après Peter et al., 2005)Choix du couple de fluorophores EGFP / mRFP1
pour des expériences de FRET / FLIM
Figure 4
GFP Emission
50000
mRFP1 absorbance
1.0
40000
Absorbance (cm M )
Intensity (arb. units)
0.8
-1
-1
30000
0.6
20000
0.4
0.2 10000
0.0 0
450 500 550 600
Wavelength (nm)
(D’après Peter et al., 2005)Choix du couple de fluorophores EGFP / mRFP1
pour des expériences de FRET / FLIM
Avantages :
- leur expression peut être directement couplée aux protéines d’intérêt
ce qui permet d’éviter d’utiliser des anticorps, qui peuvent créer un
encombrement stérique
- leurs spectres d’émission sont bien séparés
contrairement à CFP / YFP
- ils ne présentent pas de problème de photo-instabilité
contrairement à BFP
- la EGFP seule présente une décroissance de fluorescence de type
mono-exponentiel
contrairement à CFP
- la RFP monomérique 1 présente moins de risques de perturber la fonction de
la protéine d’intérêt, et mature plus rapidement
comparée à DsRed ou HcRedChoix du couple de fluorophores EGFP / mRFP1
pour des expériences de FRET / FLIM
Inconvénient :
- la RFP monomérique 1 a un rendement quantique faibleMicroscopie 1 photon et 2 photons
1
photon
L’ensemble de l’échantillon est excité
2
photons
Brad Amos (LMB.Cambridge)
Seule la région focale est excitée
d’où meilleure résolution spatiale qu’en microscopie classique,
moins de photobleaching et de phototoxicité qu’en confocal,
applications à l’imagerie du vivant, cellules, tissus etcEtude de l’interaction CXCR4 / PKCα par FRET / FLIM
Figure 5
Cellules fixées MDA-MB-231-CXCR4-EGFP
exprimant de façon transitoire PKCα-mRFP1,
traitées ou non au PDBu
Cellule fixée MDA-MB-231-CXCR4-EGFP
exprimant de façon transitoire V1V3-PKCα-mRFP1
(D’après Peter et al., 2005)Etude de l’interaction CXCR4 / PKCα par FRET / FLIM
Figure 5
Cellules fixées MDA-MB-231-CXCR4-EGFP
exprimant de façon transitoire PKCα-DsRed,
traitées ou non au PDBu
(D’après Peter et al., 2005)sur différents plans…
Figures 6 et 7
Cellule fixée MDA-MB-231-CXCR4-EGFP
exprimant V1V3-PKCα-mRFP1
(D’après Peter et al., 2005)au cours du temps…
Figure 8
Cellules vivantes MDA-MB-231-CXCR4-EGFP
contrôle
Cellule vivante MDA-MB-231-CXCR4-EGFP
transfectée avec PKCα-mRFP1
et traitée PDBu
(D’après Peter et al., 2005)Etude de l’interaction ezrine / PKCα par FRET / FLIM
Cellule MCF-7 fixée
exprimant de façon transitoire
V1V3-PKCα-EGFP,
ezrine-VSVG
et marquée avec un anticorps anti-VSVG-Cyan3
(D’après Peter and Ameer-Beg, 2004)Même expérience,
mais avec un système d’imagerie
moins performant
(D’après Parsons et al., 2001)Critères à remplir pour obtenir des informations concluantes
à partir de données de FRET / FLIM
- D’autres approches doivent corroborer les données de FLIM
par ex. immunoprécipitation, “pull-down”, fractionnement par gradient
de sucrose, microscopie électronique...
- Une représentation statistique de résultats cumulés de FLIM
doit être présentée
- Des mutants doivent apporter les contrôles négatifs adéquats
des interactions détectées par FLIM
- La proximité donneur-accepteur peut être régulée physiologiquement
ou pharmacologiquement
montrer que le FRET détecté correspond à un processus régulé
répond en partie à la critique courante selon laquelle
l’interaction détectée est due à la surexpression des protéines
- Les niveaux d’expression de donneur et d’accepteur doivent être contrôlésFRET (“Förster / fluorescence resonance energy transfer”) I - Théorie II - Méthodes de mesure III - Applications à des études biologiques IV - Un exemple de l’utilisation du FRET : étude de l’interaction CXCR4 / PKCα V - Perspectives et limites du FRET ; autres techniques complémentaires
Perspectives de la technique de FRET
Développements
- de nouveaux fluorophores
et de quantum dots
(D’après Shaner et al., 2001)
- de détecteurs plus performants
- de logiciels d’acquisition et d’analyse
Applications du FRET
- à des interactions multiples
(D’après Giepmans et al., 2006)
- à des screens haut débit
- en association avec d’autres techniques de microscopie (ex. TIRF)Limites de la technique de FRET - Des résultats négatifs ne permettent pas d’affirmer que les molécules d’intérêt n’interagissent pas. - Cette technique suppose un niveau d’expression élevé des molécules d’intérêt, ce qui peut perturber leur fonction et / ou la réponse cellulaire.
Autres techniques complémentaires
pour la détection d’interactions moléculaires in vivo
FCS (“fluorescence correlation spectroscopy”)
mesure de la diffusion
par ex. de protéines fluorescentes,
leur diffusion étant plus lente
lorsqu’elles sont en interaction
(D’après Bastiaens and Pepperkok, 2000)
Avantage :
- ne nécessite pas un niveau d’expression élevé des protéines d’intérêt
Inconvénients :
- ne peut être utilisé qu’en cellules vivantes (bien sûr !)
- ne peut être utilisé dans certains compartiments cellulaires où la diffusion
est très lente
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