MISE AU POINT D'UN TEST DE DIAGNOSTIC RAPIDE DU VIRUS EBOLA - Ebola eZYSCREENTM
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TM
Ebola eZYSCREEN
MISE AU POINT D’UN TEST DE DIAGNOSTIC RAPIDE DU
VIRUS EBOLA
Fabrice GALLAIS
Source: Massachusetts Medical Society
Direction des sciences du vivant
Laboratoire d’Innovations technologiques pour la Détection et le Diagnostic
Plan
Rappel sur le virus Ebola
Point sur l’épidémie actuelle
Notion d’anticorps monoclonaux
Développement des anticorps dirigés contre Ebola
Développement du test rapide bandelette
Evaluation du test sur le terrain
Le laboratoire P4
| PAGE 2
Aire de répartition
Agent étiologique de fièvres hémorragiques
Fatales chez l’homme et les primates
Pas de vaccin ni de traitement
Agent pathogène de classe 4
3
| PAGE 3
Réservoir animal
Ebolavirus
Hypsignathus monstrosus Epomops franqueti Myonycteris torquata
| PAGE 4
Cycle de transmission
| PAGE 5
Tableau clinique
Infection
Patient non symptomatique
Virémie indétectable
Patient non infectieux 3 à 21 jours
Première phase clinique
Syndrome pseudo-grippal
Patient symptomatique Douleurs abdominales, nausées, diahrées,
Virémie élevée vomissements, malaises
Asthénie et amaigrissement
Eruptions cutanées
Signes hémorragiques
Défaillance de nombreux
organes
10 jours
Décès
| PAGE 6
Phylogénie
Marburg
EBOV-S Bon
Soudan
EBOV-S Mal
Classification: EBOV-Z Ecr Reston
Ordre: Mononegavirales
EBOV-Z May Bundibugyo
Famille: Filoviridae
Genre: Ebolavirus
Taï Forest
EBOV-Z Kik
5 sous types
EBOV-IC IC1 Zaïre
Reston
(Hensley L. 2010)
| PAGE 7
Virus Ebola
Virus enveloppé
ARN linéaire non segmenté simple brin
7 protéines
18,9 kb
NP VP35 VP40 GP / sGP VP30 VP24 L
5’
3’
VP30
GP
sGP
VIRION NP
VP30
ARN
VP35 Source: education.expasy.org
VP24 VP40 L | PAGE 8
Historique des épidémies
24 701 cas
10 194 morts
| PAGE 9
Point sur l’épidémie actuelle
Source: OMS au 22/10/14
Source: OMS au 18/03/15
Sous type Zaïre variant Guinée
40% de mortalité
| PAGE 10Point sur l’épidémie actuelle
Liberia
Sierra Leone
Guinée
| PAGE 11
Source: OMSCrise sanitaire, quel apport?
Limite de détection classique
d’un test bandelette
JS Towner et al J. Virol. 2004, 78(8):4330
Complémentaire des tests pratiqués
Utilisable sur le terrain
Simple
Rapide
Stable (faible empreinte logistique)
Peu onéreux
Gamme de sensibilité cohérente
Objectif : Isoler rapidement un patient positif
Types d’échantillons
Sang total
Sérum/Plasma
| PAGE 12Les anticorps
Un anticorps est une protéine complexe utilisée par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les
agents pathogènes de manière spécifique. Les anticorps sont sécrétés par des cellules dérivées des
lymphocytes B : les plasmocytes.
13 | PAGE 13Les anticorps monoclonaux
Anticorps polyclonal ?
Mélange d’une multitude d’anticorps sécrétés par toute une population de lymphocytes B.
Anticorps monoclonal ?
Un seul anticorps issue d'un seul lymphocyte (clone)
G. KÖHLER (1946-1995) ET C. MILSTEIN (1927-2002)
Publication en 1975
Les hybridomes
Prix Nobel de médecine en 1984 avec N.K. Jernes
"for theories concerning the specificity in development and control of the immune system and the discovery
PAGE 14
of the principle for production of monoclonal antibodies"Les anticorps monoclonaux
Immunogène Lymphocytes Myélome
FUSION
Croissance - Sélection Croissance +
Anticorps + Anticorps -
Hybridomes
Croissance +
Anticorps +
Criblage Identification des anticorps
spécifiques
Clonage
Population monoclonale
Congélation, Banques cellulaires
| PAGE 15Immunogène?
Protéines recombinantes
pseudovirus GP Ebola Zaïre
Transcriptase inverse
GP Ebola Zaïre
Intégrase
GAG
Enveloppe
• Manipulable en laboratoire classique
• non pathogène, non-réplicatif
• Utilisable pour le criblage des d’anticorps
• Utilisable pour estimer le potentiel neutralisant
| PAGE 16 AFM, (CEA/SBTN, M Odorico)Développement des anticorps monoclonaux
Immunisation de souris
Obtention de 20 anticorps monoclonaux spécifiques de la GP du virus Ebola
Validation sur virus Ebola Zaïre au laboratoire P4
Obtention d’anticorps neutralisants fortement l’infection
1.4
1.2
1
DO à 450 nm blanc déduit
0.8
0.6
0.4
0.2
0
| PAGE 17Test « sandwich » bandelette
Production assurée par
Laboratoire Français, situé en Normandie, spécialisé dans le domaine des tests rapides.
Capacité de production annuelle de plus de 15 millions de tests.
| PAGE 18Développement du test
Du 18 août au 25 novembre
CEA VEDALAB CEA P4
Anticorps Mise au Evaluation Evaluation
point Types Types
Production Fabrication d’échantillon d’échantillon
Purification Coating Prise Prise d’essai
Conjugués d’essai Sensibilité
Contrôle
Tampons Sensibilité Spécificité
Membranes Spécificité
Types Stabilité Echantillons
d’échantillon sanguins
normaux
Echantillons Utilisation de surchargés
sanguins pseudotypes Ebola
normaux
| PAGE 19Principaux résultats issus du développement
Spécificité Espèce Zaïre et variant Guinée Stabilité, 85 jours à 30°C
Sensibilité, limite de détection analytique
Plasma (150µl) Sérum (150µl) Sang (50µl + 3 gouttes diluant)
| PAGE 20Evaluation des performances sur le terrain
Commande de 3000 tests
Test unitaires, en coffret de 20 unités
Evaluation des performances cliniques (plan d’étude établi en liaison avec l’ANSM)
320 normaux (répartis sur 3 matrices)
50 pathologiques non Ebola
300 positifs Ebola (répartis sur 3 matrices)
21
PAGE 21Evaluation des performances sur le terrain
Centre de traitement Ebola de Forécariah (Guinea)
sous le control de la Croix Rouge française
1000 tests
En attente d’autorisation du commité d’Ethique
Guinéen
Hopital de Coyah, Coyah (Guinée)
800 tests
L’étude a débutée le 07/03/15
Centre de traitement Ebola de Macenta (Guinea) Geographical
sous le control de la Croix Rouge française distribution of new
and total
confirmed cases
1000 tests (WHO, 2015, March 11)
| PAGE 22Conclusion et perspectives
Dans un rapport du 18 November 2014, l’OMS demandait à la communauté scientifique la mise au point d’un test de
diagnostic “IDEAL”
Rapide
Sensible
Sans danger
Simple, adapté pour une utilisation dans les centres de santé périphériques sans infrastructure de laboratoire
en place.
Devrait impliquer moins de trois étapes, produire des résultats en moins de 30 minutes,
Necéssitant aucune exigence en matière de biosécurité au-delà du port des équipements de protection
individuelle.
Conclusions
Le test Ebola eZYSCREEN® remplit tous les critères du test idéal OMS
L’évaluation des performances sur le terrain est un point critique.
Selon les résulats, diffusion “institutionnelle” dès que possible.
Intérêt dans un contexte post-epidemique
Le test Ebola eZYSCREEN® permettra également la surveillance des populations a risque en dehors de la phase
épidémique actuelle. Il permettra d’identifier des cas sporadiques isolés, d’identifier les malades et ainsi éviter une
épidémie locale ou une plus large épidémie.
| PAGE 23Le laboratoire P4
Un laboratoire P4 s’impose pour la manipulation des agents pathogènes
du groupe 4
• essentiellement des virus,
• taux de mortalité élevé,
• pas de traitement vaccinal,
• pas de traitement curatif,
• dangereux pour la population (transmission aisée).
| PAGE 24Le laboratoire P4
PATHOGÈNES DE CLASSE 4 :
SONT TOUS DES VIRUS
POXVIRIDAE
Smallpox
ARENAVIRIDAE
Guanarito, Junin, Lassa, Machupo, Sabia
BUNYAVIRIDAE
CCHF
FILOVIRIDAE
Ebola, Marburg
PARAMYXOVIRIDAE
Nipah, Hendra
Pathogènes émergents (SARS, H5N1, TB…)
| PAGE 25La construction du Laboratoire P4 est la
réalisation d’un projet du Dr. Charles MERIEUX
Il est localisé au sud de Lyon au sein du
technopôle de Gerland
Il est actuellement l’un des meilleurs
équipements pour la manipulation des agents
pathogènes du groupe 4
1998: Début de la construction du laboratoire
1999: Inauguration par M. le Président Jacques CHIRAC
2000: Entrée en activité du Laboratoire.
2004: Le Laboratoire P4 passe sous le contrôle de l’Etat Français
26
| PAGE 26Le confinement
Les locaux sont maintenus en permanence en dépression par un système d’air neuf, avec filtration absolue de l’air entrant
et de l’air extrait.
L’entrée ou la sortie de matériel s’effectue par un sas de décontamination au formol ou par un autoclave à double entrée.
Les déchets décontaminés sont ensuite pris en charge par une entreprise spécialisée dans l’incinération des déchets.
Les effluents liquides sont après décontamination chimique, stérilisés à la vapeur (128°C) dans des cuves spécialement
adaptées à ce type de traitement.
Les agents biologiques sont stockés à l’intérieur des zones protégées et dans des contenants appropriés
(réfrigérateur, congélateurs, cuves d’azote liquide fermées à clé.
| PAGE 27Protection des chercheurs
Les scaphandres sont réalisés sur mesure.
Communication radio permanente avec le PCS (possibilité de
réception d’appels téléphoniques).
Arrivée d’air entre 500 et 1200L/min.
Filtre absolu HEPA (efficacité 99,99994%) au niveau de la
connexion avec l’air respirable.
Systèmes de sécurité redondants pour l’air respirable.
| PAGE 28Ebola eZYSCREEN
Fabrice GALLAIS
Charles MARCHETTI
Yasmina TAYEB
Yves BRIGNON
Karen DUMAS
Karine AVERSENG
Laurent BELLANGER
Source: Reuters / Jean Paul Pelissier
Hervé RAOUL
Caroline CARBONNELLE
Delphine PANNETIER
Stéphane MELY
Anne BOCQUIN
Stéphanie MUNDWEILLER
Frédéric JACQUOT
Raphaël DONATI
Personnel R&D
CNR Fièvres hémorragiques
Sylvain BAIZE
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