DESC d'Allergologie et d'Immunologie Clinique 20-02-2014 - Lorna GARNIER Laboratoire d'Immunologie Pr. BIENVENU, CHLS
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DESC d’Allergologie et d’Immunologie Clinique
20-02-2014
Lorna GARNIER
Laboratoire d’Immunologie Pr. BIENVENU, CHLS
1CLASSIFICATION DE GELL ET COOMBS
EXPLORATION DE L’HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV
Les tests QUANTIFERON® et T-SPOT® TB dans
l’aide au diagnostic de la tuberculose
3Parmi les principales causes
de mortalité infectieuse
dans le monde
1 contamination / seconde
1 décès / 17 secondes
Objectif O.M.S.:
¾ ↓ la prévalence et la mortalité de la tuberculose de moitié en 2015 / 1990
¾ Éliminer la tuberculose en 2050 (cad < 1 nouveau cas / million
d’habitants/an)
Kaufmann SHE. Immunity, 2010 4Infection primaire
Infection 5% des cas
abortive
Tuberculose latente
95% des cas
Persistance de la bactérie
sous forme quiescente
5
Kaufmann SHE, Nature Review – Immunology 2001` Inhalation de gouttelettes
contenant quelques bacilles
` Au niveau alvéolaire :
Réponse immunitaire innée
◦ Phagocytose par macrophage
◦ Résistance à la lyse
phagolysosomale
◦ Migration cellulaire jusqu’aux
ganglions lymphatiques
6• Immunité anti-
tuberculeuse
protectrice : type Th1
• Antigènes de M.
tuberculosis présentés
par les cellules
dendritiques aux Ly T
naïfs
• Différenciation des Ly
en Ly Th1 sous
l’influence de
l’Interleukine 12
Kaufmann SHE. Immunity, 2010
78
Les cellules mémoires et
effectrices circulent
dans le sang
Cellules mémoires
9
Kaufmann SHE. Immunity, 2010Pas de symptômes
Pas de contagion
Réponse immunitaire détectable
10• Test cutané : Intradermoreaction à la tuberculine
• Tests de détection de l’IFN-γ (IGRAs Interferon-gamma-release Assays)
Measurement of induration and erythema
Measurement of IFN-γ production
11• Source antigénique : > 200 protéines
de M.tuberculosis
• Lecture à 72h par mesure du diamètre
d’induration en mm
• Seuil de positivité
12` Performance et de logistique :
◦ Subjectivité
◦ Sensibilité moyenne
◦ Effet “Booster”
◦ Nécessité de 2 visites
` Faible spécificité :
◦ Réaction croisée avec le BCG
◦ Mycobactéries non tuberculeuses (NTM)
13` Détection in vitro de la production d’IFN-ɤ par les lymphocytes
T spécifiques de M.tuberculosis après stimulation avec des
protéines mycobactériennes
◦ Test ELISA QuantiFERON-TB® Gold
◦ Test ELISPOT T-SPOT®TB
` IFN-ɤ :
◦ Rôle central dans l’immunité anti-tuberculeuse
◦ Sécrété par les lymphocytes T après stimulation
◦ Mesurable et Stable
14` Antigènes spécifiques
◦ ESAT-6
◦ CFP-10
◦ TB 7.7
Antigènes Antigènes
spécifiques du spécifiques de
` Codage par les gènes
BCG M. tuberculosis
de la région RD1
` Absents de la plupart
des mycobactéries
atypiques
` Induisent la sécrétion
Antigènes
d’IFN-ɤ communs
ESAT-6 : Early Secretory Antigen 6
CFP-10 : Culture Filtrate Protein 10 complex
15Complex Mycobactéries
Tuberculosis ESAT CFP TB-7.7 non -TB ESAT CFP TB-7.7
M abcessus - - -
M tuberculosis + + + M avium - - -
M branderi - - -
M africanum + + +
M celatum - - -
M bovis + + + M chelonae - - -
Souches BCG M fortuitum - - -
gothenburg - - - M gordonii - - -
moreau - - - M intracellulare - - -
M kansasii + + -
tice - - - M malmoense - - -
tokyo - - - M marinum + + -
danish - - - M oenavense - - -
glaxo - - - M scrofulaceum - - -
M smegmatis - - -
montreal - - - M szulgai + + -
pasteur - - - M terrae - - -
M vaccae - - -
M xenopi - - - 16` Avantages des tests IGRA
◦ Pas de seconde visite
◦ Peu d’effet booster
◦ Reproductibilité des tests et réactifs
◦ Résultat objectif
◦ Spécificité +++ (BCG, Mb atypiques)
◦ Contrôle + : mise en évidence des faux négatifs
17` Test ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay)
` Dosage sur sang total (anticoagulant : héparine)
` Incubation des cellules mononucléées du sang périphérique avec les
protéines mycobactériennes
` Dosage de l’IFN-γ plasmatique par technique ELISA (UI/mL)
3. Plasma
+conjugué
Contrôle - ESAT-6 Mitogene Incubation
CFP-10 Contrôle + 2H
4. Lecture
incubation à 37ºC pdt 16-24h 2. Centrifugation .
spectrophotométrique
18Témoin Témoin
négatif positif
Stockage des tubes à
température ambiante
- Prélèvement : 3 x 1 mL
- Agitation douce par retournements (x5)
- Incubation à 37°C 16 à 24h
le plus rapidement possible
19Preanalytical delay reduces sensitivity of QuantiFERON-TB Gold In-Tube for
detection of latent tuberculosis infection
Doberne et al. Journal Clin. Microb. 2011;49(8):3061-64
Négativation des
QFT
19% (5/26) à 6h
22% (5/23) à
12h
20Nul TB Ag – Nul Mit – Nul Résultat
Témoin – Tube patient Témoin +
Tube gris Tube rouge Tube violet
≤8 < 0.35 ≥ 0.5 NEGATIF
≤8 ≥ 0.35 ≥ 0.5 POSITIF
≤8 ≤ 0.5 ININTERPRETABLE
Abs ctrl positif
≥8 ININTERPRETABLE
Activation
spontanée
21` Antigènes spécifiques (testés séparément) :
◦ ESAT
◦ CFP-10
` A partir de Cellules mononucléées
` Technique ELISPOT
22• Prélèvement de sang
dans un tube Vacutainer CPT™
• centrifugation du tube
• Prélèvement des cellules mononucléées
• Lavage et comptage cellulaire (cellule ou
automate d’hématologie)
• Ajout des cellules aux plaques 96 pts
• Ajout des antigènes dans les puits
(ESAT-6, CFP-10)
• Incubation 16 à 24h
23PBMC après Ajout des PBMC et Capture de l’IFN-γ
extraction Ficoll ou Ags TB. Les Ly T spé par les anticorps.
tubes BD CPT sécrètent l’IFN-γ. Incubation.
Chaque spot
correspond à une
cellule sécrétrice
d’IFN-ɤ
Lavages et ajout Ajout du substrat Apparition des spots
24
de l’Ac conjugué en 7 minutes- Comptage du nombre de spot
- “à l’oeil” à l’aide d’une loupe binoculaire ou d’un microscope
- Comptage à l’aide d’un lecteur automatisé Elispot :
• Lecture automatisée des plaques
• Calcul du nombre de spots par puits
• Stockage des images sur PC
• Paramétrage automatique de la caméra et de l’analyse
Validation :
nb de spots panel A/B – Témoin négatif
≥ 8 : POSITIF
≤ 4 : NEGATIF
≥ 5 et ≤ 7 : DOUTEUX
25Témoin Témoin Panel A Panel B
négatif positif
26` TEST POSITIF
◦ fréquence élevée de Ly T (effecteurs/mémoires) spécifiques
de M. tuberculosis :
rencontre de M. tuberculosis
◦ faux positifs rares (M. kansasii, M. marinum, M.szulgai` Test NEGATIF
◦ Ne permet pas d’exclure une infection par M. tuberculosis
` Test ININTERPRETABLE
◦ Absence d’activation dans le contrôle positif
x Indication sur la compétence immunitaire du patient (âge,
déficit…)
x Validation de la conservation des prélèvements avant
incubation et de la manipulation.
◦ Activation spontanée dans le contrôle négatif :
x Infection, inflammation…
28Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma
Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis
R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus
Chest 2010;137;952-968
Etudes analysées :
676 citations
124 études retenues
(exclusions : edito, medico-economique, revues, lettres, case report, données insuffisantes…)
Sensibilité : 40 études
Spécificité : 7 études
R. Indéterminés : 116 études
2930
31
Patients
immunodéprimés
32` Meilleure performance diagnostique des IGRAs par rapport à l’IDR
(supériorité des IGRAs dans les pays développés)
` Sensibilité : T-SPOT TB > QFT TB Gold IT
` Spécificité : QFT TB Gold IT > T-SPOT TB
` Résultats indéterminés : T-SPOT TB > QFT TB Gold IT
` IDR avant IGRAs non recommandée
33` Diagnostic de tuberculose-infection latente pour réaliser
l’enquête autour d’un cas (sujet > 15 ans)
` Lors de l’embauche, pour les professionnels de santé et ceux
qui travaillent dans un service à risque, c’est-à-dire dans les
mêmes conditions que celles préconisées par les
recommandations sur l’IDR
` Aide au diagnostic des formes extra pulmonaires de la
tuberculose maladie
` Avant mise en route d’un traitement par anti-TNFα
34Utilisation stricte des tests IGRA dans le seul diagnostic de l’ITL et
uniquement dans l’objectif de la traiter (sauf cas particulier)
` Diagnostic de ITL : ↘ le réservoir de patients infectés
◦ Enquête autour d’un cas : prise en charge des sujets contacts
(enfants > 5 ans - sujets âgé > 80 ans)
◦ Patients infectés par le VIH (bilan initial)
◦ Dépistage avant mise sous anti-TNF
◦ Personnel de santé (y compris stagiaires et étudiants) :
x embauche (si IDR > 5 mm)
x cas contact
◦ Migrants entre 5 et 15 ans
` Diagnostic de tuberculose maladie : Chez l’enfant
(ITL : Infection tuberculeuse latente) 35Matulis et al. American College of Rheumatology, San Diego, CA. November
2005
Comparison of in vitro-specific blood tests with tuberculin skin test for
diagnosis of latent tuberculosis before anti-TNF therapy
Sellam J. et al. Ann. Rheum Dis. 2007;66(12):1610-5
Detection of latent tuberculosis in immunosuppressed patients with
autoimmune diseases: performance of a Mycobacterium tuberculosis antigen-
specific interferon gamma assay
Matulis G. et al. Ann Rheum Dis. 2008;67(1):84-90
Interféron gamma releasing assay versus tuberculin skin test prior to treatment
with Golimumab, a human anti-TNF antiody, in patient with Rheumatoid
Arthritis, Psoriatic Arthritis, or Ankylosing Spondylitis
Hsia EC. et al. Arthritis and Rheum. 2012;64(7):2068-76
36Influence of replacing tuberculin skin test with ex vivo interferon γ
release assays on decision to administer prophylactic antituberculosis
antibiotics before anti-TNF therapy
Mariette et al. Ann Rheum Dis2012;71:1783-1790
` Objectif :
Evaluer l’impact thérapeutique (% de patients pour lesquels la
décision thérapeutique antiTB a été modifiée par les résultats
des tests in vitro par rapport aux recommandations de
l’AFSSAPS) du dépistage de l’ITL par QFT ou T-SPOT-TB avant
traitement par anti-TNF-α
20 centres, 400 patients, durée 24 mois
31,8% Polyarthrite Rhumatoïde, 45% Spondylarthrite ankylosante,
23,2% Maladie de Crohn (60% immunosuppresseurs, 36,4% corticoides)
37Influence of replacing tuberculin skin test with ex vivo interferon γ
release assays on decision to administer prophylactic antituberculosis
antibiotics before anti-TNF therapy
Mariette et al. Ann Rheum Dis2012;71:1783-1790
` Résultats
◦ 34,9% patients IDR > 5 mm / 16,7% patients IGRA positif
◦ 30,8% discordance IDR/IGRA (IDR+/IGRA- : 80% et IDR-/IGRA+ :
20%)
◦ Bonne concordance pour les deux tests IGRA
◦ Meilleure sensibilité du QFT/T-SPOT TB
◦ Résultats indéterminés : 7,3% T-SPOT TB et 2,8% QFT (pas
d’influence de la prise de corticoides ou d’immunosuppresseurs)
Conclusion
Les tests IGRA permettent de diminuer de 50% le nombre de patients traités
par antibiothérapie anti-tuberculeuse avant biothérapie
Attention : cas de TB avec IGRA négatifBrock et al. Respiratory Research. 2006
CorrelationbetweenCD-4cell
count andresponsetoPHA
`Risque plus élevé de developper une 100
tuberculose maladie
Log 10 Response to
mitogen (IU/ml)
10
`Fortecorrélation entre le taux de CD4 et le
taux de IFN-γ dans le tube mitogène 1
(P3
0-
patients HIV
0-
0-
10
20
CD4 cell count (cells/microliter)
39` Tests diagnostiques de l’infection tuberculeuse latente (ITL)
` Excellente valeur prédictive négative dans les TB latentes
` Excellente spécificité / élimination des faux positifs liés au
BCG préalable
` Intérêt dans les formes extra pulmonaires
` Chez les immunodéprimés, même si la sensibilité est
modérée chez ce groupe de patients (ne permet pas d’exclure
une TB ou ITL)
40Les IGRA
` Ne permettent pas de distinguer TB active et TB latente
` Ne sont pas validés chez le jeune enfant (< 5 ans)
` Données insuffisantes pour suivre l’efficacité d’un traitement
pour TB active ou latente
` Ont une sensibilité diminuée
◦ Chez les personnes âgées
◦ Chez les immunodéprimés
4142
43
Gyneco Obstétrique Pédiatrie
Cardiologie 1% 1% Hématologie
Ophtalmologie 1%
1%
4% Neurologie
Néphrologie
1% Autres Médecine travail
1%
4% 21%
Pneumologie
4%
Médecine
statutaire
12%
Maladies
Infectieuses
11%
Hépato-Gastro-
Dermatologie
Entérologie Médecine Interne
5%
3% Rhumatologie 15%
Allergologie
2% 14%
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