Atelier " Méthodes innovantes d'analyse en biologie cutanée "
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Atelier « Méthodes innovantes d’analyse en
biologie cutanée »
Session 2: Techniques biophysiques et
imagerie d’étude de la peau
Veronica La Padula, PhD
Centre Technologique des Microstructures
Université de Lyon 1
Marek Haftek, MD PhD
Laboratoire de Recherche Dermatologique, LBTI, UMR5305 CNRS
Faculté de Médecine et de Pharmacie Lyon, le 12 septembre 2017
Université de Lyon 1
IMMUNOHISTOCHIMIE POUR LA MICROSCOPIE EN LUMIÈRE TRANSMISE
ET À FLUORESCENCE/CONFOCALE
Paraffine OCT
Fixation chimique, déshydratation, infiltration et Fixation chimique, inclusion en OCT
inclusion en paraffine Coupe au cryostat (échantillon congélé, -20°C)
Coupe au microtome (température ambiante) Épaisseur de la coupe: 5-10 µm
Épaisseur de la coupe: 5-10 µm 50 µm (free floating)
Études de morphologie et de distribution de protéines Études de morphologie et de distribution de protéines
TuJ1/TRPV1
Possibilité d’inclure
les tranches en
Healthy subject
résine époxy pour la
microscopie
corrélative
optique/confocale-
Diabetic neuropathy
MET
HCV-related
PGP9.5 PGP9.5 neuropathy
Li et al., Brain, 2005 Lewis Kass-Iliyya et al., Parkinsonism & Lauria et al., JNPS, Li et al., Brain, 2005
Related Disorders. 2015 2005
MICROSCOPIE ELECTRONIQUE EN TRANSMISSION (MET)
Résines époxydiques
Fixation chimique, déshydratation, infiltration et inclusion en résine
Coupe à l’ultramicrotome (température ambiante)
Épaisseur de la coupe:
500 nm – 1 µm (semi-fine, microscopie optique, Bleu de Toluidine)
60-80 nm (ultra-fine, MET, UA/Pb Citrate)
Études de morphologie et de distribution de protéines (pre-embedding)
(M. Haftek)
Marquage de l’Ag KM48 sur les cellules épidermiques avant inclusion.
Li et al., Brain, 2005
IMMUNOHISTOCHIMIE POUR LA MET
London Resin White
Résines acryliques
Fixation chimique, déshydratation, infiltration et inclusion en résine
Coupe à l’ultramicrotome (température ambiante)
Études de morphologie et de distribution de protéines
Quantification de protéines
MBP
Li et al., Brain, 2005
CRYO-IMMUNO TEM (TOKUYASU)
Sucrose
Fixation chimique, inclusion en sucrose par congélation
Coupe au cryo-ultramicrotome (-110°C)
Études de morphologie et de distribution de protéines
Quantification de protéines
Marquage sur cryosection de l’épiderme
quantification des compartiments (M. Haftek)
MICROSCOPIE ELECTRONIQUE À BALAYAGE (MEB)
Electrons secondaires Electrons rétrodiffusés
MÉTHODES DE
MICROSCOPIE
CORRÉLATIVE EN
COURS DE
DÉVELOPPEMENT
(confocal-MEB)
RECONSTRUCTION 3D
AU MEB DE COUPES
ULTRA-FINES SÉRIÉES
Localisation de la cornéodesmosine sur des cornéocytes isolés, M. Haftek
EQUIPEMENTS DISPONIBLES AU CTµ
ZEISS LSM800 Philips CM120
Microscope confocal MET
Résolution XY: 200 nm Résolution : 0,3 nm
Résolution Z: 500 nm
Filtres: 405, 488, 561, 640 nm
« Shuttle and find »
microscopie corrélative
HIGH PRESSURE FREEZING
FREEZE SUBSTITUTION
ZEISS Merlin Compact LEICA UC 7 et UC S
SEM Ultramicrotomes
Résolution XY: 1 nm RT et CRYO
EDX Épaisseur des coupes: 60
nm - 1 µm
MERCI DE VOTRE
ATTENTION
Veronica La Padula, veronica.la-padula@univ-lyon1.fr
Stéphane Gavarini, stephane.gavarini@univ-lyon1.fr
Marek Haftek, marek.haftek@univ-lyon1.fr
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