Méthodes d'étude de l'activité des antibiotiques - Pr Hélène MARCHANDIN - DFGSP3 2018/2019 - Moodle UM
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DFGSP3 – 2018/2019
Méthodes d’étude de
l’activité des antibiotiques
Pr Hélène MARCHANDIN
Introduction
• Sensibilité (S) et résistance (R) naturelles des
espèces bactériennes à certains antibiotiques (ATB)
= propre à toutes les souches d’1 genre ou d’1 espèce donnée
• Nombreux mécanismes de R acquise aux antibiotiques
= propre à certaines souches d’une espèce
è Etude in vitro de l’activité des ATB
sur bactéries pathogènes
=
Etape nécessaire au choix d’une
antibiothérapie adaptée
2
Interactions bactérie-antibiotique
Nombre de bactéries/ml
Ralentissement
de la croissance
Bactériostase è CMI
Bactéricidie è CMB
Effet létal de
l’antibiotique
3
Etude de la bactériostase
= détermination de la CMI
(concentration minimale inhibitrice)
plus faible concentration d'antibiotique capable
d'inhiber toute croissance visible de la bactérie in vitro
En milieu liquide En milieu solide
Dilution en milieu liquide Dilution en milieu gélosé (réf)
Diffusion en milieu gélosé*
- Méthodes manuelles (réf) - Disques
- Méthodes automatisées* - Bandelettes
4
(réf) : méthodes de référence * méthodes utilisées en routine
Détermination CMI / DILUTION en milieu liquide
Méthodes manuelles
Inoculum bactérien
standardisé (sans ATB)
Gamme de
concentration d’ATB
î de raison 2
5Croissance
+ bactérienne
- - - - - - - - + + + +
Exemple
6Microméthodes
- en microplaques Gamme d’ATB(s)
T
Etude d’un ou
plusieurs :
- ATB
- isolats bactériens
par plaque
T 2 4 8 16 32 64 µg/ml
Exemple
Souche d’E. coli
et amoxicilline
CMI 64µg/ml 7- méthodes automatisées
• cartes / micro-puits : ≠ antibiotiques
à ≠ concentrations
• incubation, lecture de la croissance bactérienne
et interprétation automatisées
è méthodes plus rapides : environ 6-7h
8Détermination CMI / DILUTION en milieu gélosé
Gamme de T 0,5 1 2 µg/ml
concentration
d’ATB
+
inoculum
bactérien
Souches 1 et 4 : CMI = > 2 µg/ml
standardisé
Souche 2 : CMI = 2 µg/ml ; souche 3 : CMI = 1 µg/ml
(spot)
9Détermination CMI / DIFFUSION en milieu gélosé
Méthode des disques
Inoculum standardisé
0,5 McFarland ≈ 108 UFC/ml
Milieu de Mueller-Hinton
Lecture d’un diamètre d’inhibition (en mm)
10Correspondance avec la CMI
Courbes de concordance diamètre d’inhibition – CMI
pour chaque ATB
Antibiotique X
11Evaluation de la CMI par bandelettes
Gradient continu d’ATB sur bandelette
Ex : Méthode Etest
Ellipse d’inhibition
Lecture directe de
la CMI : intersection
bandelette - croissance
CMI bactérienne
de
vancomycine CMI de
teicoplanine
12 mg/L
1 mg/L
12Interprétation des résultats
Classement des souches bactériennes en
Sensibles (S)
Intermédiaires (I)
Résistantes (R)
vis-à-vis d’un antibiotique donné
≥D C
è CMI critiques et diamètre critiques (= seuils)
déterminés pour chaque ATB 13Exemple : Entérobactéries et pénicillines
14Application 1 : détermination des
Catégories de populations
è Catégories de populations / d’espèces :
définies après étude d’un nombre important de représentants/de souches
d’une même espèce
• habituellement sensible
• modérément sensible
• inconstamment sensible
• résistante
Variables :
- selon l'espèce étudiée
- dans le temps en fonction des antibiotiques (récents ou utilisés
depuis longtemps) et selon les souches bactériennes
(hospitalières / communautaires) 15Exemple : distribution des CMI d’érythromycine
(macrolide) de souches de 4 espèces
Habituellement sensibles
Modérément sensibles
è spectre naturel
Inconstamment sensibles d’activité des ATB (cf Vidal)
Résistant
è base des antibiothérapies
probabilistes
16è spectre d’activité des ATB (cf Vidal) - Exemple
17Application 2 : détermination des
Catégories thérapeutiques ou cliniques
≥D C
Concentrations sériques
cs CS
Une bactérie sera dite résistante à un antibiotique si elle est capable
de se multiplier en présence d'une concentration de cet ATB
supérieure à celle que l'on peut atteindre in vivo
18è Catégories thérapeutiques ou cliniques
• sensibles : bactéries dont la CMI est inférieure aux concentrations
sériques obtenues avec posologies usuelles (cs)
è forte probabilité de succès thérapeutique lors d’un
traitement par voie systémique avec la posologie recommandée
• résistantes : bactéries dont la CMI est > aux taux les plus élevés (CS)
è forte probabilité d’échec thérapeutique
• intermédiaires : bactéries dont la CMI est comprise entre cs et CS
è succès thérapeutique imprévisible
Réalisation d’un antibiogramme guider l’antibiothérapie
19L’antibiogramme
- Détermination de la sensibilité d’une souche bactérienne
à un ou plusieurs antibiotiques
- Antibiotiques à tester :
Choix selon :
• le type bactérien (cocci ou bacilles à Gram + ou -)
• le spectre des ATB
Nombre variable (è ∼ 30 : entérobactéries en milieu hospitalier)
è réponse au clinicien : interprétation en termes de
d’activité
20Interprétation de l’antibiogramme : 3 niveaux
1- Interprétation des diamètres d’inhibition ou des CMIs
selon valeurs critiques
+ Réponse doit aussi tenir compte de l’identification
2 – de l’espèce bactérienne et de ses R naturelles
3 – du (des) mécanisme(s) de résistance acquise détecté(s)
= LECTURE INTERPRETATIVE de l’antibiogramme
21Exemple 1 : Klebsiella – Pénicillinase naturelle (groupe 2 des EB)
*
* 20 - 23
20 - 23
*
* Résistances naturelles
22Exemple 2 : Enterobacter - céphalosporinase naturelle (groupe 3 EB)
*
*
* Résistances
* naturelles
(β-lactamines)
* Résultats
*
interprétés
R
quels que
* soient les Ø
d’inhibition
observés
23Exemple 3 : Staphylococcus et production de pénicillinase (R acquise)
c)
Ø > 26 mm Ø > 26 mm Ø < 26 mm
Bordure floue Bordure nette
S R R
Seuil
26 mm
+ aspect
de la
Lecture bordure
interpré-
-tative
24Exemple 4 : Staphylococcus aureus méticillino-résistant (R acquise)
Méticillino-résistance (PLP additionnelle) :
- détection par disque de céfoxitine
- seuil : S. aureus (22 mm) si R
Lecture
interprétative
è Interprétation : résistance à toutes les β-lactamines
(pénicillines, céphalosporines, carbapénèmes)
SAUF ceftaroline et ceftobiprole 25Etude de la bactéricidie
= détermination de la CMB
(concentration minimale bactéricide)
plus faible concentration d'antibiotique
è ≤ 0,01% de survivants
Gamme de sans ATB
concentration
d’ATB de
raison 2
+ inoculum
bactérien
26Dénombrement comparatif / à l’inoculum bactérien initial
T
≤ 0,01% de survivants
si 100 colonies sur témoin
Dénombrement à T1h, T2h, ... è cinétique de bactéricidie
27Recherche de mécanismes de résistance particuliers
❏ Mécanismes de R de détection délicate
•Ex : Streptococcus pneumoniae de sensibilité diminuée
(bas niveau de R) à la pénicilline (PSDP)
è Dépistage : è CMI Pénicilline G
Disque d’oxacilline PSDP si > 0,064 mg/L
(1 µg)
OXA – 1 µg
≥ 20 mm
< 20 mm à PSDP
28❏ Mise en évidence d’une enzyme inactivatrice
•Ex 1 : Méthodes rapides de détection de la production
de β-lactamase par Haemophilus
Moraxella catarrhalis
= test chromogénique
Coloration
Disque de nitrocéfine (Cefinase® )
rose si
(β-lactamine chromogène)
hydrolyse
29•Ex 2 : Restauration de l’activité d’1 ATB en
présence d’un inhibiteur de l’enzyme inactivatrice
è Différences de Ø par exemple entre :
amoxicilline (AMX)
amoxicilline + acide clavulanique (AMC)
(inhibiteur de β-lactamases)
Ex : Entérobactéries et mise en évidence de la
production d’une β-lactamase
AMC
Ø>
AMX
30è Images de synergie (dites en « bouchon de champagne »)
entre disque de C3G et disque contenant ac. clavulanique
ó production de β-lactamase à spectre étendu (BLSE)
mécanisme de multirésistance chez bacilles à Gram négatif
AMC C3G
Diamètre en en présence de BLSE
Δr
AUG CTX
30 mm Diamètre en l’absence de BLSE
AUG=AMC : amoxicilline+acide clavulanique 31
C3G : céphalosporine de 3ème génération, CTX : céfotaximeExemple : Antibiogramme de Klebsiella pneumoniae productrice de BLSE
*
*
*
C3G
* : Résistances naturelles
+ R acquises (dont C3G) par production de BLSE 32
Imipénème et céfoxitine S : ATB non hydrolysés par la BLSE❏ Mise en évidence d’une cible insensible à l’ATB
• Ex : technique immunologique / agglutination de particules
sensibilisées par des AC spécifiques de la PLP2a (détecte aussi PLP2c)
staphylocoque staphylocoque
méticillino-résistant méticillino-
(SARM) + - sensible
❏ Mise en évidence du support génétique de la R
Méthodes moléculaires T+ 1 2 3 4 5 6 T-
• Nombreuses applications
• Ex : amplification par PCR du gène
mecA codant la PLP2a (SARM)
(idem mecC à PLP2c)
33Etude d’autres paramètres
Etude de l’activité d’associations d’ATB : diverses méthodes
Exemple
Indifférence Synergie
(A+B) > A + B
Antagonisme Addition
(A+B) < A + B
34 Dosage sériques du ou des ATB
Méthodes chromatographiques
è ajustement des posologies (efficacité / toxicité)
35è ajustement des horaires d’administration Optimiser le temps où concentration ATB > CMI 36
Conclusion
Etude de l’activité des ATB importante dans
l’instauration d’un traitement antibiotique efficace
+/- surveillance traitement
Infection bactérienne è antibiothérapie probabiliste
Identification ou ?
+
è ajustement thérapeutique
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