Méthodes d'étude en biochimie - Partie 1 : Méthodes Spectrométriques
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Méthodes spectrométriques Année universitaire : 2019/2020
Institut National De Formation
Supérieure Paramédical Constantine
Méthodes d’étude en biochimie
Partie 1 : Méthodes Spectrométriques
Dr R. KHENOUCHI
2ème année laborantins de santé publique
Année universitaire : 2019/2020
Plan :
I. Introduction
II. Notions fondamentales
1. Propriétés de la lumière
2. Différents domaines des ondes électromagnétiques
III. Spectrophotométrie d’absorption moléculaire en UV –visible
IV. Photométrie des milieux troubles
1. Turbidimétrie
2. Néphélémétrie
V. La réflectométrie
VI. Techniques utilisant la luminescence
1. La fluorimétrie
2. La chimiluminescence et l’électrochimiluminescence
VII. Photométrie d’émission atomique
IX. Photométrie d’absorption atomique
X. Spectrométrie de masse
Conclusion
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Méthodes spectrométriques Année universitaire : 2019/2020
I. Introduction :
Les méthodes spectrométriques utilisent les propriétés spectrales de la lumière pour effectuer des
études qualitatives et quantitatives des molécules dans différents milieux.
Ils reposent sur des interactions entre les molécules et des quanta lumineux d’énergies différentes.
Les rayonnements les plus souvent utilisés sont l’ultraviolet (UV) et la lumière visible.
II. Notions fondamentales :
1. Propriétés de la lumière :
La lumière présente une double nature:
Nature ondulatoire :
La lumière est un déplacement transversal d’ondes
électromagnétiques
Les ondes électromagnétiques sont caractérisées par : la longueur
d’onde λ (en nm) , le nombre d’ondes ύ, la fréquence υ (Hertz)
et la vitesse de la lumière (C = 3.1010 cm/sec)
Nature corpusculaire:
La lumière est constituée de photons. Chaque photon possède sa propre énergie E.
La relation entre l’énergie E du photon et la fréquence est donnée par l’équation de Planck :
E = hυ avec h étant la constante de Planck.
Sachant que λ = C/υ d’où E = hC/ λ
Donc l’énergie du photon est inversement proportionnelle à la longueur d’onde de la radiation
lumineuse.
2. Différents domaines des ondes électromagnétiques :
En pratique, le spectre électromagnétique est séparé en plusieurs domaines :
- Les ondes radio : λ > 0.1 m.
- Les micro-ondes : λ de l’ordre du cm au mm.
- Le domaine IR (lointain, intermédiaire et proche) : λ entre le μm et le mm.
- Le domaine visible : λ entre 400 et 800 nm.
- Le domaine UV (proche et lointain) : λ allant de 400 à 10 nm.
- Le rayonnement X : λ entre 1nm et 1Å
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III. Spectrophotométrie d’absorption moléculaire en UV –visible :
1. Définition et principe:
Ensembles de techniques physico-chimiques dans lesquelles l’absorption de la lumière par des
solutions est utilisée pour l’identification et l’évaluation quantitative de la substance dissoute.
Seules les molécules qui contiennent des systèmes chromophores (doubles liaisons ou électrons
libres) absorbent dans le proche UV-visible.
2. Le spectre visible :
Le spectre de la lumière visible s’étend de 380nm à 750nm
A l’aide d’un prisme, il est possible de décomposer la lumière blanche en ses différents constituants
colorés de longueurs d’ondes données :
Le rouge : 650 à 750 nm.
L’orange : 595 à 650 nm.
Le jaune : 560 à 595 nm.
Le vert : 490 à 560 nm.
Le bleu : 435 à 490 nm.
Le violet : 380 à 435 nm.
Le spectre d’absorption moléculaire dans l’UV- visible est un spectre de bandes (spectre
continue). Il représente l’absorbance en fonction de la longueur d’onde.
3. Loi de Beer-Lambert :
Si un faisceau lumineux monochromatique I0 traverse une solution
absorbante d’une substance de concentration C, contenue dans une
cuve à faces parallèles, sur une longueur (trajet optique) L, le faisceau
lumineux transmis I est une fonction exponentielle de C et de L.
I = I0 e-εcL Ln I0/I = ε C L A = D.O = ε C l
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La transmittance : T = I/I0=1/A
Remarque : Pour que la loi de Beer-Lambert soit valable, il faut que :
- La lumière soit monochromatique
- le milieu soit limpide
- le pH reste constant durant le dosage
- la solution ne soit pas concentrée, en moyenne inférieure à 10 -2 moles/l
4. Appareillage :
Source lumineuse (lampe) :
- Des solides chauffés émettant des radiations lumineuses.
- Des décharges électriques (lampes à hydrogène)
Systèmes de sélection de la longueur d’onde (monochromateurs) :
Ils permettent de séparer une radiation de longueur d’onde définie à partir d’un mélange complexe
de radiations. Il en existe plusieurs dont les pouvoirs résolutifs et l’efficacité sont très variés :
Les prismes, les filtres colorés, les réseaux …
Cuves :
Elles sont en verre ou en plastique pour les lectures dans le visible, et en quartz pour les lectures en
UV, toutes les cuves ont un trajet optique de 1cm.
Détecteurs :
Ils transforment le signal lumineux en signal électrique : Cellules photoélectriques, Tubes
photomultiplicateurs
Amplificateur
Afficheur : permet d’obtenir directement le résultat en DO. Pour certains appareils, on peut
obtenir les résultats en concentration à l’aide d’un calculateur ou d’une imprimante.
5. Applications de la spectrophotométrie :
La spectrophotométrie UV-visible est le plus souvent employée en analyse quantitative par
application de la loi de Beer-Lambert
Elle permet de doser une substance dans un milieu simple ou complexe.
Ces dosages sont fait, soit:
En point final : en mesurant la D.O à la fin de la réaction.
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En cinétique : en suivant l’évolution de la réaction par la mesure de la D.O en fonction
du temps pour quantifier une substance ou mesurer une activité d’une enzyme.
Exemple : le dosage de la créatinine par l’acide picrique en milieu alcalin donne une réaction
colorée orange lue à 520nm. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration de la
créatinine.
Elle peut être utilisée pour l’identification et quantification d’une substance à l’aide de son spectre
d’absorption :
Exemples :
-Identification des chromoprotéines : l’hémoglobine et la myoglobine.
-Identification des différentes structures du glycogène (le glycogène normal, la dextrine limite,
l’amylopectine)
IV. Photométrie des milieux troubles :
Principe :
Ce sont des méthodes fondées sur la diffusion de la lumière par des petites particules en
suspension dans une solution.
L’absorption lumineuse des milieux troubles obéit à la loi de Rayleigh :
Io = I absorbée + I transmise+I diffusée
Il faut distinguer deux types de méthodes différentes : la turbidimétrie et la néphélémétrie.
1. Turbidimétrie :
Principe :
En turbidimétrie, on mesure donc la diminution de l’intensité lumineuse dans la même direction de
la lumière incidente.
Appareillage :
La turbidimétrie utilise un spectrophotomètre avec des longueurs d’onde comprises en général entre
620nm et 670nm
Elle est adaptable sur tous les automates de biochimie.
Applications:
La turbidimétrie est largement utilisée en biochimie clinique pour le dosage des protéines
spécifiques. (la α1-macroglobuline, la CRP , la transferrine, apolipoprotéines ..).
2. Néphélémétrie :
Principe :
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En néphélémétrie, on mesure l’intensité de la lumière diffusée par une suspension à 90° par rapport
à la lumière incidente.
Appareillage :
La néphélémétrie nécessite l’emploi d’un néphélémétre qui mesure la lumière UV (250nm à350nm)
diffusée dans toutes les directions par rapport à la lumière incidente.
Les néphélémètres sont automatisés.
Applications:
Les applications sont nombreuses en biochimie clinique.
Elle est également utilisée pour le dosage immunochimique des protéines spécifiques.
V. La réflectométrie :
C’est une méthode rapide de dosage sur bandelettes réactives ou plaques analytiques (chimie
sèche).
Principe :
L’échantillon à doser est déposé sur le feuillet
supérieur de l’empilement de couches de
réactifs secs.
Apres répartition de l’échantillon et
incubation, il se développe une réaction
colorée lue par réflectométrie (on mesure la
lumière réfléchie).
VI. Techniques utilisant la luminescence :
La luminescence : émission de photons obtenus lors du retour à l’état fondamental d’une molécule
portée au préalable à un état excité.
Ce phénomène est mis à profit dans la spectrométrie par luminescence qui regroupe des méthodes
se distinguant par la nature de la source d’excitation. Telles que :
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1. La fluorimétrie :
Principe :
Il s’agit de l’émission de la lumière à partir d’une molécule se trouvant à un niveau d’excitation
électronique obtenu par absorption de la lumière (UV, visible ).
Absorption d’un photon par une molécule Passage de l’état fondamental à un état excité
Retour à l’état fondamental avec émission d’un photon (la fluorescence)
L’intensité de fluorescence : dépend de l’intensité de la lumière incidente et de la concentration C
du composé à doser.
Appareillage :
Les fluorimètres utilisent les filtres colorés et permettent de travailler à longueur d’onde fixe.
- Sources lumineuses : Lampe à xénon
- Filtres et monochromateurs : à réseau ou à prisme
- Cuves : en quartz non fluorescent (Il existe des cuves en matière plastique et des
microplaques en polystyrène a fond plat a usage unique)
- Photomultiplicateurs
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- Convertisseur analogique numérique : permet d’enregistrer les données acquises dans
la mémoire d’un ordinateur équipé d’un logiciel prenant en charge le traitement des
données
Applications :
Les applications sont nombreuses.
- Dosage des acides aminés et de leurs métabolites : Phénylalanine, tyrosine, histidine,
sérotonine, 5HIAA
- Dosage des catécholamines, acide homovanilique….
- Dosage des médicaments et toxiques : Barbituriques, benzodiazépines,
phénothiazines…
2. La chimiluminescence et l’électrochimiluminescence:
La chimiluminescence (CL) :
C’est l’émission de la lumière par une molécule dont l’excitation électronique est obtenue par
une réaction chimique à température ambiante.
Exemple :
Le phosphate de dioxétane est un produit luminogène qui sous l’action de la phosphatase alcaline
libère un groupement phosphate (anion instable). cet anion libère un photon.
La quantité de lumière émise est proportionnelle à la quantité de phosphatase alcaline.
L’électro chimiluminescence (ECL) :
C’est la production de lumière par électrolyse
Le retour à l’état fondamental s’accompagne d’une émission de lumière
Applications de la CL et de l’ECL :
Les applications de ces méthodes sont très nombreuses en biochimie clinique.
Les détecteurs de CL et de ECL sont couplés avec des technologies performantes telles que :
l’HPLC, la CPG, électrophorèse capillaire ….
VII. Photométrie d’émission atomique :
Définition :
La photométrie d'émission atomique mesure l'émission d'un rayonnement électromagnétique dans
l’UV- visible due à la désexcitation d'atomes qui ont été excités par l'énergie apportée par une
flamme.
Principe :
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La flamme, dont la température est élevée, permet de réaliser la combustion des molécules,
organiques et la vaporisation de la matrice de l'échantillon à analyser ainsi que la dissociation des
composés dans lequel l'élément à doser est engagé.
L'élément à doser passe sous forme de vapeur atomique. Sous I ‘effet des températures élevées,
certains atomes sont excités et voient leurs électrons passera des niveaux d'énergie supérieurs.
Les niveaux excités sont instables et le retour au niveau fondamental d'énergie minimale conduit
à une libération d'énergie sous forme d'un rayonnement électromagnétique de longueur d'onde
caractéristique de l'atome qui se désexcite.
C'est la mesure de l'émission à une longueur d'onde caractéristique de l'atome à mesurer (pour
laquelle l'émission est intense) qui fonde la photométrie d'émission atomique de flamme (FEP).
Appareillage (photomètre de flamme) :
Les flammes utilisées en pratique sont décrites dans le tableau ci-dessous :
comburant combustible température
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Dioxygène Propane 2000°C, adaptée pour doser
Na+, K+, Ca 2+
Dioxygène Butane
Dioxygène Acétylène
Protoxyde d’azote Acétylène 3200°C, adaptée pour doser
Na+, K+, Ca 2+
Application :
La photométrie d’émission est utilisée pour le dosage quantitatif de métaux alcalins et
alcalinoterreux (Na, K, Li, Ba ...)
Si on choisit de mesurer le rayonnement émis à une longueur d'onde caractéristique de l'élément à
doser, l'intensité est proportionnelle à sa concentration dans l'échantillon. A la stricte condition que
le débit et la température de flamme soient constant.
Sensibilité :
Les dosages sont très précis. La sensibilité et la détectabilité sont excellentes.
On peut réaliser des dosages de traces de l'ordre de 0,1µg/mL.
IX. Photométrie d’absorption atomique :
Principe :
Un faisceau lumineux sensiblement monochromatique traverse une flamme dans laquelle on
introduit l’éliment à doser sous la forme de brouillard de fines gouttelettes.
Le faisceau incident est absorbé proportionnellement à la longueur traversée par le rayonnement et
au nombre d’atomes neutres de cette élément par unité de volume de la solution.
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La spectrométrie d’absorption atomique se caractérise par des qualités particulières de sensibilité et
de spécificité.
La loi de Beer-Lambert utilisée dans la photométrie d’absorption moléculaire reste valable dans
l’absorption atomique.
Le coefficient d’absorption atomique dépend de la température de la flamme, de la pression, de la
source d’émission et à la concentration de l’élément à doser.
Appareillage :
On distingue les appareils à simple faisceau et ceux qui utilisent un montage différentiel à double
faisceau.
Un spectrophotomètre d’absorption atomique peut se réduire schématiquement aux éléments
suivants :
- Une source lumineuse émettant la raie correspondant à l’élément à doser
- Un système générateur d’atomes : flamme ou four à graphite
- Un monochromateur de bonne résolution
- Un détecteur de flux associé à un dispositif de mesure
Applications :
Dosage des métaux alcalins, des alcalinoterreux, cuivre , zinc, chrome , fer , cobalt..etc
Cette technique ne nécessite que 2 qualités pour l’échantillon : la fluidité et l’homogénéité.
Sensibilité :
De l'ordre de quelques µg/mL.
X. Spectrométrie de masse :
Principe :
La spectrométrie de masse consiste à analyser les fragments chargés issus d’une molécule soumise à
un phénomène d’ionisation et séparées selon leur masse.
Appareillage :
Le spectromètre de masse comporte :
- Une source d’ions : enceinte dans laquelle la molécule à étudier est ionisées, soit en la
bombardant par un faisceau d’électrons, soit en la portant à haute température (thermo-
ionisation)
- Une chambre d’accélération : où on communique aux ions formés une vitesse importante.
- Un système dispositif : où les ions de masse différente sont séparés
- Un récepteur : qui collecte les ions et détermine leur nombre en fonction de leur masse.
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Les spectres de masse :
Ils délivrent l’enregistrement de l’intensité du faisceau d’ions en fonction de leur masse. Le spectre
de masse se présente donc comme la succession de pics de hauteur différente correspondant à une
masse donnée. En fait, on obtient le pic pour chaque valeur du rapport m/q.
Chaque ion détecté est représenté par un trait, dont la hauteur représente l’intensité relative d’un
faisceau d’ions reçus.
Applications :
- Analyse qualitative et quantitative d’un mélange gazeux (SM peut être utilisée comme
détecteur de CPG)
- Détermination des masses molaires et des formules de composés organiques
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Conclusion:
L’analyse spectroscopique permet de relier la longueur d’onde du rayonnement émis ou absorbé
aux propriétés de l’ensemble des atomes ou molécules constituant la substance considérée
Elle permet l’identification d’une substance chimique de composition inconnue ainsi que le dosage
des divers constituants d’un mélange.
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