THÉRAPIES ISSUES DE LA CONNAISSANCE DES GÈNES : ESSOR D'UNE DISCIPLINE NOUVELLE AUX FACETTES MULTIPLES - SERGE BRAUN, PHARMD, PHD
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Thérapies issues de la connaissance des
gènes : essor d’une discipline nouvelle aux
facettes multiples
Serge Braun, PharmD, PhD
Directeur scientifique
« Ingénierie génétique »
(6th International Congress
of Genetics)
Lois de l’hérédité
(G. Mendel)
1866 1906 1932 1944 1947
1909
1911 « Thérapie génique » (C.E. Keeler; J Hered.)
Gènes transférés par l’acide nucléique:
« correction génétique »
(O. Avery)
« Génétique »
(W. Bateson)
« Gènes »
(W. Johannsen)
Gènes portés par les chromosomes
(T. Morgan)
« Ingénierie génétique »
(6th International Congress
of Genetics)
Gènes transférés par l’acide nucléique:
Lois de l’hérédité « correction génétique »
(G. Mendel) (O. Avery)
« Thérapie génique » (K.E. Keeler)
Années 60-70
1866 1932 1953
Double hélice Joshua Lederberg (Biological future of man .
(Watson et Crick) In: Wolstenholme G , ed. Man and his future.
London: J & A Churchill. 1963; p263-273)
Etablissement des bases de génétique
moléculaire:
- code génétique
- isolement, conception, synthèse et transfert de gènes dans
les bactéries, puis les cellules animales et humaines
- technologie de l’ADN recombinant avec systèmes de sélection
L’ADN en tant qu’outil thérapeutique :
la thérapie génique
Exemples de Vecteurs
Rétrovirus / Lentivirus AAV, Adénovirus Non-viral
- S’intègre - Peut persister - Peut persister
- Efficace - Ne s’intègre pas (?) - Ne s’intègre pas (?)
- Risque de rejet anti-vecteur - Efficace - Larges séquences
(et anti-transgène ?) - Risque de rejet - Pas de réponse
- Taille des séquences - Taille des séquences anti-ADN
- Production à grande échelle - Production - Peu efficace
à grande échelle
Une thérapie génique à grande échelle: transgene
Vaccination orale antirabique de la faune sauvage
RaboralTM
Glycoprotéine rabique
Virus de la vaccine modifié
2001: la rage est déclarée officiellement transgene
éradiquée en France
RaboralTM
1989 1997
Premières tentatives de thérapie génique chez l’Homme
1970: Stanfield Rogers (Univ Tennessee)
- Deux soeurs avec déficit en arginase
- Virus du papillome de Shope
1980: Martin Cline (UCLA), β-thalassémie
- 2 patientes
- Plasmide-β-globin-HSVtk Cellules souches
de la moelle osseuse
Controverses scientifiques, de procédures et Plasmide Réinjection
éthiques Rétrovirus
des cellules
corrigées
recommandations et règlementations
spécifiques
Transfert du gène sain
1990: William French Anderson (NIH)
- 1 patiente ADA-SCID
- Rétrovirus-ADA
Premières preuves de principe
(Thérapie génique ex vivo) Cellules souches
de la moelle osseuse
Réinjection
des cellules
Rétrovirus corrigées
Transfert du gène sain
Aleyna,
ADA-SCID
Guérie par
thérapie
génique
Les premières AMM
Gendicine®, Oncorine® Ad5-p53 (360$)
2000 essais / 4500 patients
AAV-LPL (1M$)
• Administration locale, ex-vivo, systémique
• Expression court/long termeIndications
39
33
10
12
11
7
5
9
Ginn et al. Gene therapy clinical trials worldwide to 2012 – an
Update J Gene Med 2013; 15: 65–77Amaurose Congénitale de Leber
Sain
RPE-/-
Forme précoce de rétinite pigmentaire
Vision réduite, notamment en lumière faible
RPE65 identifié en 1997Thérapie génique AAV4-RPE65
Fabienne ROLLING,
CHU de Nantes,
(administration locale)
Laboratoire de
thérapie génique,
Inserm U649 ITR hRPE65 huRpe65 Poly A ITR
rAAV-2/5
ITR hRPE65 human rpe65 Poly A ITR
a b c
RPE rAAV-2/4
OS
Chien sain Chien non traité Chien traité
IS
ONLLentivirus équin EIAV pour le
traitement de la maladie de Parkinson
IRES IRES SIN LTR
CMVp TH CH1 AADC
GTP-
Cyclohydrolase 1(CH1) Lésion 6-OHDA
BH4 L-Tyrosine
Tyrosine
Hydroxylase(TH)
Contrôle
L-DOPA
L-aminoacide
aromatique
décarboxylase
Dopamine (AADC)
Expression de dopamine, potentialisant la thérapie par la L-DOPAL’ADN en tant que cible thérapeutique :
la « chirurgie du génome »Chirurgie de l’ADN: forme ultime de thérapie génique
Nucléase
Coupure double-brin
Réparation
de l’ADN
Recombinaison homologue
Applications : • Invalidation Activation
• Insertion ou remplacement / inactivation
• Correction de gènesNucléases à doigts de zinc
• Domaines de liaison à l’ADN trouvés dans
facteurs de transcription des eukaryotes
• 1 codon / 1 Zinc finger
• Séquences cibles riches en G = 18-36 nt
• Fusion avec domaine nuclease de FokI
• Optimisation :
de l’interface de dimérisation
de l’interface entre Zn finger
des espaceurs
• Sigma, Sangamo, plateformes OPEN ou
CoDA
Nat Meth 9 (1) 2012 - Urnov et al., Nat. Rev. Genet 2010Nucléases à doigts de Zinc - Clinique
• Glioblastome
- Inactivation du récepteur aux glucocorticoïdes dans LT CD8+
- Phase I - City of Hope Medical Center/Sangamo; déc. 2012
• (Neuropathie diabétique)
• SIDA
- Mutation CCR5D32 chez les patients résistants aux HIV
- Efficacité des ZFNs: >50 % dans LT CD4+
- Spécificité des ZFNs: pas d’activité sur CCR2 - off-target =
1/20000
- Phase I - City of Hope Medical Center/Sangamo; jan. 2013Chirurgie des génomes basée sur les nucléases
Avantages Inconvénients
• Tout type de correction • Faible fréquence de
recombinaison homologue
• Correction non aléatoire
• Exclue pour les cellules
• Conservation du promoteur natif quiescentes
du gène d’intérêt
• Vectorisation nécessaire
• Plusieurs plateformes
disponibles • Spécificité - génotoxicité
Méganucléases, ZFP, TALEN, CRISPRL’ARNm cible thérapeutique
Régulation de gènes et
de l’ARN: un rôle clé
de « l’ADN poubelle »
ADN répétitif
non apparenté
aux éléments
transposables ADN répétitif
ADN
non codant
unique
Introns et
séquences
régulatrices
Types de séquences d’ADN dans le
génome humain
ExonsL’interférence à ARN
ARN interférents: ARN qui interagissent avec les ARNm pour
réguler/empêcher la synthèse de la protéine correspondante
ADN
(C. Mello et A.Z. Fire, Nobel 2006)
Interférence par ARN
ARNm
miARN / siARN siARN: une
Oligonucléotides Ribozyme
nouvelle classe
antisens de nutriments !
Blocage de Blocage de
la transcription la traduction
rotéine
+ Chalcone synthase (R. Jorgensen, 1990)Le monde des petits ARN
ARN codants ARN non codants
ARN transcriptionnels petits ARN
ARNm ARNr ARNt siARN, miARN, snoARN, snARN, circARN,
piARN, rasiARN, stARN, snmARN,…
siARN: small interfering RNA ou petit ARN interférent
miARNm: micro ARN
(qui comprennent les ARNst pour petits ARN temporaires)
snoARN: small nucleolar RNA ou petit ARN nucléolaire
snARN: small nuclear RNA ou petit ARN nucléaire
circARN: ARN circulaire
piARN: PIWI-RNA
rasiARN: repeat-associated small interfering
stARN: small temporal RNA
snmARN: small non-mRNA
21-U ARN
Mirtrons: pré-miARNs localisés dans les introns de différents gènesL’interférence à ARN
ARN interférents: ARN qui interagissent avec les ARNm pour
réguler/empêcher la synthèse de la protéine correspondante
ADN
ARNm
siARN (db) / miARN (sb)
Oligonucléotides Ribozyme
antisens
Blocage de Blocage de
la traduction la traduction
rotéineThérapies par modulation de l’ARN
Stade de
Pathologie Gène cible Agent thérapeutique
développement
CORRECTION D'EPISSAGES ABERRANTS
Mutations d'épissage Dérégulation de l'épissage alternatif
b-thalassémie HBB molécule trans-épissage clones minigènes Alzheimer/Taupathies MAPT molécule trans-épissage
lignées cellulaires
Cancer BRCA1, PTCH1 oligos antisens clones minigènes oligos antisens, molécule
Mucoviscidose CFTR U1snARN clones minigènes Cancer BCL2L1, FGFR1, oligos antisens souris
Duchenne dystrophine oligos antisens chien GRMD MDM2, MCL1 lignées cellulaires
Hémophilie Fact IX, VII U1snARN clones minigènes multiple molécules lignées cellulaires
Fanconi FANCC U1snARN cellules de patients Amyotrophie spinale infant.SMN2 oligos antisens, molécule
Phase I-III
Rétinites pigmentaires Rho, RPGR U1snARN cellules de patients INVALIDATION DE L'EXPRESSION DE GENES (+/- RNase H)
Sites cryptiques d'épissage Alzheimer BACE1, muAPP oligos antisens lignées cellulaires, souris
b-thalassémie HBB oligos antisens souris SOD1 oligos antisens Phase I
Cancer BRCA2 oligos antisens clones minigènes Cancer CDKNA, MYC molécules Phase I
Insuf. congénitale surrén.CYP11A oligos antisens clones minigènes BCL2, TGF b ,custérine oligos antisens Phase III
eIF-4E, RNR, Akt-1,
Mucoviscidose CFTR oligos antisens, molécule cellules de patients survivine oligos antisens Phase I, Phase II
Duchenne dystrophine oligos antisens cellules de patients ERBB2, SRA1,TERT, oligos antisens lignées cellulaires
Dystrophie de Fukuyama FKTN oligos antisens souris STAT3 oligos antisens souris
Insuffisance en GH GHR oligos antisens clones minigènes VEGF+kinésine, dsARN Phase II
Progeria (HGPS) LMNA oligos antisens souris DMLA IRS-1, kinase C-Raf oligos antisens Phase III, Phase I
Dystrophie myotonique DMPK oligos antisens souris REDD-1, RTP801 dsARN Phase II
Neurofibromatose NF1 oligos antisens cellules de patients Hyperlipidémie familia. APOB oligos antisens Mipomersen/Kinamro
Niemann-Pick C NPC1 oligos antisens cellules de patients Asthme, colite IL4/5RA,+CCR3, ICAM-1 oligos antisens Phase I, Phase II
Usher USH1C oligos antisens souris Rétinite à CMV IE2 oligos antisens Fomiversen/Vitravene
Séquences régulatrices Chorée de Huntington HTT oligos antisens souris
Cancer BRCA1 oligos antisens cellules de patients Sclérose en plaques CD49D oligos antisens Phase II
Neurofibromatose NF1 molécule cellules de patients Diabète de type II PTP1B, GLP-1R, SGLT1 oligos antisens Phase II, Phase I
Albinisme oculaire de type1
GRP143 oligos antisens cellules de patients Myasthénie AChE oligos antisens Phase II
Saut d'exon Albinisme oculaire I GRP143 oligos antisens cellules de patients
Myopathie de Duchenne dystrophine oligos antisens 2'OM Phase III HCV miRNA122 oligos antisens Phase I
oligos antisens Morpholino Phase II Œdème maculaire diabét. VEGF siARN Phase II
Epidermolyse bulleuse COL7A1 oligos antisens cellules de patients TRANSLECTURE DE CODONS STOP
Myopathie de Myoshi DYSF oligos antisens cellules de patients Myopathie de Duchenne dystrophine Molécule AtalurenModulation de l’épissage par oligos
antisens: application à la DMD
1 / 3500 garçonsSain DMD
Dystrophin
Duchenne : J Neuropathol Exp Neurol. 2009;68:762-73
• Degénérescence musculaire progressive
• Atteinte centrale (30%)
• Atteintes des muscles lisses, cardiomyopathie
• Diagnostic: 16 mois- 8 ans
Dystrophie musculaire de Becker: plus tardive, moins marquéeDystrophine
Motifs répétés Spectrine-like Domaine riche en Cystéine
Domaine de liaison à l’actine Hinge C-terminaleHors-phase phénotype sévère
(DMD)Restauration du cadre de lecture phénotype modéré (BMD)
Saut d’exon par oligonucléotides antisens
Saut d’exon
pour la myopathie de Duchenne
Non traité TraitéEFFICACY ASSESSMENT
IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS
PhosphorothioatesDrisapersen: FDA « breakthrough therapy » 27/06/13)
Exon sauté Délétions ou exons réparés
51 45-50, 47-50, 48-50, 49-50, 50, 52
50 51, 51-53, 51-55
45 12-44, 18-44, 44, 46-47, 46-48, 46-49, 46-51, 46-53, 46-55
53 10-52, 45-52, 46-52, 47-52, 48-52, 49-52, 50-52, 52
44 10-43, 19-43, 30-43, 35-43, 36-43, 40-43, 42-43, 45, 45-54
8 4-7, 5-7, 6-7, 3-7,
55 47-54, 48-54, 49-54, 50-54, 52-54, 54, 56, 56-62
7 2-6,8-11, 8-17, 8-43, 8-45
52 53, 53-55, 53-57, 53-59, 53-60
17 12-16, 18, 18-20, 18-22, 18-25, 18-27, 18-29, 18-33, 18-36,
18-38, 18-41, 18-44Mécanismes épigénétiques; rôle dans: Implications dans :
- Cancer
le développement, l’évolution
- Maladies autoimmunes
effets de facteurs environnementaux - Maladies mentales
vieillissement - Maladies cardiovasculaires
- Diabète
Structure de
la chromatine
Méthylation
De l’ADN
ZolinzaTM
Modifications
des histonesThérapies issues de la connaissance des gènes : essor
d’une discipline nouvelle aux facettes multiples
• Thérapie génique
• « Chirurgie » de l’ADN
• Modulation de la transcription, saut d’exon
• Régulation des ARNm Marché ARNi:
• Modulation de la traduction 2010: 7 Mds $
2015: >24 Mds $
• Epigénétique
• Pharmacogénomique
Supposent une connaissance précise des caractères génétiques des
individus
Génotypage, séquençage à très haut-débit
Médecine personnaliséeComprendre Comprendre Comprendre Innovations Améliorer
la structure la biologie des la biologie de thérapeutiques l’efficacité de la
des génomes génomes la maladie prise en charge
1950-2000
2004-2010
2011-2020
> 2020
>Comprendre Comprendre Comprendre Innovations Améliorer
la structure la biologie des la biologie de thérapeutiques l’efficacité de la
des génomes génomes la maladie prise en charge
1950-2000
2000-2010
2011-2020
> 2020
>Comprendre Comprendre Comprendre Innovations Améliorer
la structure la biologie des la biologie de thérapeutiques l’efficacité de la
des génomes génomes la maladie prise en charge
1950-2000
2000-2010
2010-2020
> 2020
>Comprendre Comprendre Comprendre Innovations Améliorer
la structure la biologie des la biologie de thérapeutiques l’efficacité de la
des génomes génomes la maladie prise en charge
1950-2000
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