11ème Club oxydase "Les NADPH Oxydases NOX/DUOX" - En association avec le GDR 2039 " NADPH oxydase et - Club oxydase 2019
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11ème Club oxydase
«Les NADPH Oxydases NOX/DUOX»
En association avec le GDR 2039 « NADPH oxydase et
Stress Oxydant »
23-24 Mai 2019, Université libre de Bruxelles
Campus Erasme - Auditoire B1.003
1
Nous remercions nos sponsors :
1
Informations générales :
Adresse : Université libre de Bruxelles
Faculté de Médecine
Campus Erasme
Bâtiment B – Auditoire B1.003
808, route de Lennik
1070 Bruxelles
Belgique
http://cluboxidase2019.eu/
infos@cluboxidase2019.eu
Google Map 50°48’48.7″N 4°16’02.4″E
1
Programme scientifique
11ème Club oxydase
23-24 Mai 2019, Université libre de Bruxelles
« Les NADPH Oxydases NOX/DUOX »
Jeudi 23 mai 2019
Dès 12h00 Accueil des Participants
13h00 - 13h10 Ouverture du colloque
Session 1 : Les NOX dans tous leurs états
Modérateurs : Tanya Bizouarn (Univ. Paris Sud) et Marion Thauvin (Collège de France)
13h10 – 13h50 Marie-Josée Stasia (IBS, Membrane and Immunity Team, Université
Grenoble Alpes)
« Twenty years after… What we know about the mechanisms of activation
and ROS release of NOX/DUOX family members? »
13h50 – 14h10 Vincent Jaquet (Department of Pathology & Immunology, University of
Geneva)
« Régulation redox de la réponse au TGF-β1 dans les fibroblastes humains »
14h10 – 14h30 Marie Erard (Laboratoire de Chimie Physique, Université Paris Sud)
« Imagerie quantitative en cellule vivante et modélisation 3D permettent
d’accéder aux caractéristiques du complexe cytosolique de la NADPH oxydase
des phagocytes en cellules vivantes »
14h30 – 14h50 Aicha Bouraoui (Laboratoire de Chimie Physique, Université Paris Sud)
« Une nouvelle régulation de NOX2 »
14h50 – 15h10 Hana Illichova (Laboratoire de Chimie Physique, Université Paris Sud)
« Constitutive NADPH oxidase activity and its consequences on intracellular
pH and cellular viability »
15h10 – 16h00 Pause-café et Posters + Photo de groupe
Session 2 : Les états redox cellulaires, les protections contre les ROS et l'environnement
Modérateurs : Sylvain Brun (Univ. Paris Diderot) et Christine Rampon (Collège de France)
16h00 – 16h40 Jean-François Collet (de Duve Institute, Université Catholique de Louvain)
« The uncommon strategy of a chaperone to protect its substrates from
over-oxidation »
16h40 – 17h00 Benjamin Ezraty (Laboratoire de Chimie Bactérienne, CNRS, Marseille)
« Oxidized Proteins: homeostasis of the DNA repair RecA protein is under
redox control »
3
17h00 – 17h20 Camille Andrieu (Laboratoire de Chimie Bactérienne, CNRS, Marseille)
« Etude de l’importance de la réparation des protéines oxydées lors de
l’interaction hôte-pathogène »
17h20 – 17h40 Nicolas Pauly (INRA, CNRS, ISA, Université Côte d'Azur)
« Key players in redox homeostasis during the legume – rhizobia symbiosis »
17h40 – 18h00 Alexander Demoor (Université Paris Diderot)
« Rôle des Nox dans la germination des ascospores et la formation de
l’appressorium chez le champignon modèle Podospora anserina »
19h30 - 22h30 Dîner au restaurant « L'Atelier »
Vendredi 24 mai 2019
9h00 - 9h15 In Memoriam Yves Gorin
(Corinne Dupuy, UMR8200 CNRS, Institut Gustave Roussy, Villejuif)
Session 3a : Les ROS dans la physiopathologie
Modérateurs : Jamel El Benna (Centre de Recherche sur l'Inflammation) et Mathieu Chocry
(Univ. Aix-Marseille)
9h15 – 9h55 Pham My-Chan Dang (INSERM U1149, Centre de Recherche sur
l'Inflammation)
« NOX1: Un agent double dans l'inflammation intestinale »
9h55 – 10h15 Marie-Hélène Paclet (Université de Grenoble)
« Œdème pulmonaire lésionnel : implication des ROS médiés par Nox2 dans
la perméabilité endothéliale»
10h15 – 10h35 Dan Liu (INSERM U1149, Centre de Recherche sur l'Inflammation)
« Casein kinase II, a potential regulator of NOX1 in intestinal epithelial cell
during inflammation»
10h35 – 11h20 Pause-café et Poster
Session 3b : Les ROS dans la physiopathologie
Modérateurs : Françoise Miot (Univ. libre de Bruxelles) et Stephenson Owusu (Univ. Paris
Sud)
11h20 – 12h00 Rabii Ameziane-El-Hassani (BioPatH, Mohammed V University, Morocco)
« Rôle des NADPH oxydases dans les cancers de la thyroïde »
12h00 – 12h20 Raphaël Corre (CNRS UMR 8200, Institut Gustave Roussy, Villejuif)
«Rôle de la NADPH oxydase DUOX1 dans la fibrose pulmonaire radio-induite»
5
12h20 – 12h40 Awaref Allouch (INSERM U1030, Institut Gustave Roussy, Villejuif)
« Gadolinium-based nanoparticles enhances the NOX5/p53-dependent
senescence elicited by ionizing radiation »
12h40 – 13h00 Julie Craps (MORF, Université Catholique de Louvain)
« Implication of miRs 199a-3p/5p in oxidative stress and angiogenesis in local
and systemic effects of a Th2 autoimmune disease: Graves’ thyroiditis »
13h00 - 14h00 Lunch et Posters
14h00 - 14h45 Table Ronde : Présentation du GDR et Futur du Club Oxydase
Session 4 : ROS et signalisation cellulaire: de la membrane au noyau
Modérateurs : Bernard Lardy (GREPI, Grenoble) et Bénédicte Vigne (Université Alpes,
Grenoble)
14h45 – 15h25 Sophie Vriz (CIRB, CNRS UMR Collège de France, Université Paris Diderot)
« H2O2 signaling in development & regeneration »
15h25 – 15h45 Marwa Ben Khémis (INSERM U1149, Centre de Recherche sur
l'Inflammation)
« Le TNFα potentialise l’activation de NOX2 et empêche la réponse des
monocytes à l’IL-10»
15h45 – 16h05 Jérémy Joly (Laboratoire de Chimie Physique, Université Paris Sud)
« Dynamique de Nox2 lors de la phagocytose»
16h05 – 16h25 Nadine El Banna (UMR3348 CNRS, Institut Curie, Université Paris-Sud)
« Vitamin C-induced breast cancer cell death is associated with remodelling
the redox state of cysteine-containing proteins »
16h25 – 16h45 Ildiko Szanto (Geneva University)
« NOX enzymes in metabolic regulation: focus on the adipose tissue »
16h45 – 17h00 Clôture du colloque
7
Posters
11ème Club oxydase
23-24 Mai 2019, Université Libre de Bruxelles
« Les NADPH Oxydases NOX / DUOX »
Mathieu Chocry (CNRS 7051(INP), Université Aix-Marseille) Poster 1
« La gemcitabine : un traitement alternatif pour les patients atteints de cancer
colorectaux résistant au protocole de chimiothérapie basé sur l’oxaliplatine »
Irène Amblard (Collège de France) Poster 2
« Homeoprotein and hydrogen peroxide: which regulation(s) ? »
Marion Thauvin (Collège de France - CIRB, Paris, France) Poster 3
« Fine tuning of hydrogen peroxide levels reveals redox-dependence of filopodia »
Christine Rampon (Collège de France) Poster 4
« Nerves, H2O2 and shh: three players in the game of development and regeneration »
Bénédicte Vigne (Université Alpes, Grenoble) Poster 5
« NOX4 is the main NADPH oxidase involved in the early stages of hematopoietic
differentiation from human induced pluripotent stem cells »
Hélène Thomas (LIENSs, Université La Rochelle) Poster 6
« Enzymes de la famille de la NADPH Oxydases & pollution organique chez les bivalves des pertuis
charentais »
Rana Nassif (Faculty of health Sciences, University of Balamand, Lebanon) Poster 7
« Understanding the anti-cancer properties of metformin: Effect on ROS production by
tumor associated macrophages and colon cancer cells »
Stephenson Boakye Owusu (Laboratoire de Chimie Physique, Université Paris Sud) Poster 8
« Radiation-Induced Oxidative Stress Partially Assembles Neutrophil NADPH oxidase »
Tania Bizouarn (Laboratoire de Chimie Physique, Université Paris Sud) Poster 9
« NADPH oxidase in vitro activity measurements from cytochrome c reduction are
strongly impacted by superoxide anion membrane diffusion »
Zhanna Shitikova (Genkyotex) Poster 10
« A novel, second generation of NOX1/4 inhibitor attenuates TGFb-induced myofibroblast
activation in vitro and delays disease progression in a high fat diet-induced NASH model in vivo »
9Session 1 : Les NOX dans tous leurs états
Twenty years after… What we know about the mechanisms of activation and ROS
release of NOX/DUOX family members?
Marie-Josée Stasia, (IBS, Membrane and Immunity Team, Université Grenoble Alpes)
For many years, the phagocytic NADPH oxidase was considered as the unique membrane enzyme
producing superoxide and involved in innate immunity defence. Its physiopathological importance was
supported by the existence of a severe innate immunodeficiency syndrome called chronic granulomatous
disease in case of NADPH oxidase deficiency. However from 2000’s several enzymes named NOX1, NOX3,
NOX4 and NOX5, analogs to gp91phox (or NOX2) and responsible for reactive oxygen species (ROS)
production, have been identified in various tissues (Lambeth et al. 1999, Banfi et al. 2000, Geiszt et al.
2000, Cheng and Lambeth 2001, Banfi et al. 2001). These NOXs enzymes differ at the amount, the nature
and the role of the ROS generated, and at the cellular (and subcellular) localization. However they show
similarities to phagocytic NOX2 and are referred to as the NOX family. The common functions of NOXs are
due to the conserved structural properties including at the N-terminus, six transmembrane domains
containing four heme-binding histidines and a dehydrogenase domain with a NADPH and a FAD binding
domains at the C-terminus. All the NOXs except NOX5 need the membrane partner p22phox to be active. In
addition the assembly of cytosolic partners (p47phox/NOXA1, p67phox/NOXO1, p40phox) to the redox
element of NOX1-3 at the membrane, control the activation process of these enzymes except for NOX4
which has a constitutive activity and NOX5 which is mainly activated by calcium et possibly by calmodulin.
After activation, NOX1-3 and NOX5 in presence of oxygen and NADPH produce superoxide anions (O2.-).
NOX5 activity seems to be regulated by calcium-dependent stimuli and its binding with Hsp90 and co-
chaperones regulated the O2.- production (Chen et al. 2015). NOX4 produces oxygen peroxide (H2O2) and
its activity is mainly regulated by the level of mRNAs that can be modulated by several transcription factors,
cytokines and physiopathological situations. In the early 2000’s, very close structural enzymes to NOXs
named DUOX1 and DUOX2 were identified in the thyroid (Dupuy et al. 1999, De Deken et al. 2000). Like
NOX5, DUOX 1/2, are Ca2+-dependent NOXs but differ from NOX5 as they possess only two EF-hand Ca2+-
binding motifs. DUOXs have a seventh transmembrane segment ended by an ecto-peroxidase-like domain
(PO) at the N-terminus unique to DUOXs. Like p22phox for NOX1-4, the DUOX maturation factors DUOXA1
and DUOXA2, are essential to overcome the ER retention of DUOXs and to permit their functional
expression at the plasma membrane (Qin et al. 2004, Grasberger et al. 2006). Originally isolated from the
11thyroid, they produce H2O2 that is used to oxidize iodide during thyroid hormone synthesis. DUOXs are
also present in airway epithelial cells and the respiratory tract. DUOX2 expression is inducible in colon and
the salivary gland.
ROS produced by NOX1-5 and DUOX1/2 are now recognized to play essential roles in the physiology of the
brain, the immune system, the vasculature, the digestive tract, and hormone synthesis. NOX-derived ROS
have been implicated in regulation of cytoskeletal remodeling, gene expression, proliferation,
differentiation, migration and cell death. These processes are tightly controlled and reversible. The
mechanism of activation of NOXs/DUOXs enzymes is closely related to their roles in cells and tissues, to
their tissue distributions and subcellular localizations, and to specific signal transduction mechanisms.
12NOX enzymes in metabolic regulation: focus on the adipose tissue
Ildiko Szanto
Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva, Switzerland
Obesity, the excessive accumulation of white adipose tissue (WAT), is a major health concern
worldwide. WAT expansion and lipid storage capacity are crucial factors in the maintenance of
whole-body energy and metabolic balance. However, chronic surplus energy intake may overcome
the limits of this healthy expansion inducing pathological alterations in fat tissue and eventually
leading to the “overflow” of lipids into other ectopic sites. The onset of this unhealthy adipose
tissue expansion is associated with hypoxia and chronic, low-grade inflammation that promote the
establishment of insulin resistance and Type 2 diabetes mellitus (T2DM). White adipose tissue
accumulation is a two-step process. The first step is hyperplasia, the recruitment of pre-adipocytes
residing in the stromal/vascular fraction to induce their differentiation into mature adipocytes.
The second step is hypertrophy, when lipid deposition occurs into pre-existing mature adipocytes.
While adipocytes derived from hyperplasia are small in size and insulin sensitive, large adipocytes
developed by hypertrophy are insulin resistant and are responsible for unhealthy adipose tissue
development. One of the components involved in the pathogenesis of unhealthy white adipose
tissue expansion is the deregulation of cellular redox homeostasis. NADPH oxidase enzymes,
(NOX-es) produce highly reactive oxidants and thus, play a key role in the regulation of cellular
redox state. Unrevealing the regulation of redox processes underlying the adipocyte
differentiation program and identifying the redox disturbances associated with unhealthy
accumulation are of crucial importance in understanding the pathogenesis of obesity, insulin
resistance and T2DM.
13Imagerie quantitative en cellule vivante et modélisation 3D permettent d’accéder
aux caractéristiques du complexe cytosolique de la NADPH oxydase des
phagocytes en cellules vivantes
Cornelia S. Ziegler1, Leila Bouchab1, Marc Tramier2, Dominique Durand3, Franck Fieschi4, Sophie
Dupré-Crochet1, Fabienne Mérola1, Oliver Nüße1, Marie Erard1 marie.erard@u-psud.fr
1
Laboratoire de Chimie Physique, CNRS, Univ. Paris-Sud, Université Paris-Saclay, 91405, Orsay France
2
Univ Rennes, CNRS, IGDR [(Institut de génétique et développement de Rennes)] – UMR 6290, BIOSIT – UMS
3480, F-35000 RENNES, France
3
Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS UMR 9198, Univ. Paris-Sud, Université Paris-
Saclay, Gif-sur-Yvette, France.
4
Univ. Grenoble Alpes, CNRS, CEA, Institut de Biologie Structurale, F-38044 Grenoble, France
De nombreuses protéines contiennent des régions intrinsèquement désordonnées (IDR) qui
séparent des domaines structurés. Ces protéines modulaires adoptent de nombreuses
conformations qui les rendent difficiles à caractériser in vitro avec les techniques classiques
comme la diffraction des RX, la RMN, la CryoEM. Les deux sous unités cytosoliques de la NADPH
oxydase des phagocytes, p47phox et p67phox, rentrent dans cette catégorie. Leur étude structurale
nécessite de développer des stratégies alternatives. Plusieurs modèles du complexe cytosolique
ont été proposés en combinant des données structurales partielles et des données obtenues sur
les protéines purifiées (Sumimoto 2008, Leto 2009, Nunes 2013). Les modèles les plus sophistiqués
intègrent des données topologiques (Groemping 2005, Massenet 2005).
Nous avons récemment développé une nouvelle stratégie pour étudier le complexe cytosolique en
cellules vivantes combinant différents marquages des sous-unités par des protéines fluorescentes
avec des spectro-microscopies FRET-FLIM et FCCS.
Nos études ont démontré une stœchiométrie 1: 1: 1 des trois sous-unités au repos, nous avons
aussi estimé leur affinité et analysé leur organisation spatiale. Utilisant ces résultats ainsi que
toutes les données structurales disponibles (RX, RMN et SAXS), un nouveau modèle
tridimensionnel de l’ensemble du complexe cytosolique a été développé. Ce modèle présente un
complexe allongé formé de deux parties séparées par une charnière flexible. Il est entièrement
compatible avec les multiples étapes de l'activation de l'oxydase (Zielger 2019,
doi:10.1074/jbc.RA118.006864).
14Une nouvelle régulation de NOX2
Aicha BOURAOUI1, Ruy LOUZADA2, Tania BIZOUARN1, Corinne DUPUY2, Laura BACIOU1
1
Laboratoire de Chimie Physique, CNRS UMR8000, Université Paris Sud, Orsay.
2
Institut Gustave Roussy, CNRS UMR8200 « Stabilité génétique et Oncogenèse », Université Paris Sud,
Villejuif.
Poldip2 est une protéine ubiquitaire initialement identifiée comme étant un partenaire de la sous
unité p50 de la polymerase δ en intervenant dans la réplication et la réparation de l’ADN. Depuis
sa découverte en 2003, beaucoup d’autres partenaires et fonctions lui ont été attribués. Elle joue,
entre autre, un rôle régulateur de l’isoforme NADPH oxydase NOX4. A ce jour, le mode d’action de
cette régulation n’a pas encore été identifié. Seul fait connu est que Poldip2 augmente l’activité de
NOX4 en s’associant à son partenaire, la protéine p22 phox. L’association de p22phox à d’autres
isoformes de NADPH Oxydase (NOX1, NOX2 ou NOX3) nous mène à soupçonner une interaction
possible entre ces derniers et Poldip2. Par ailleurs la co-localisation de NOX4 et NOX2 dans
plusieurs types cellulaires, tels que les cellules du muscle lisse et l’endothélium font de NOX2 un
bon candidat pour l’étude de l’effet régulateur possible de Poldip2 sur cet isoforme. Dans cette
perspective, la protéine recombinante Poldip2 (rat) a été produite de manière hétérologue dans
un système d’expression de levure P. pastoris. Grace à un vecteur d’expression spécifique de cette
levure, Poldip2 est sécrété dans le milieu extracellulaire. La protéine a été purifiée à partir du
milieu de culture. L’analyse de la séquence par spectrométrie de masse a permis de confirmer
l’identité du Poldip2 recombinant produit par la levure. Après avoir caractérisé structuralement
Poldip2 et confirmé sa capacité à augmenter l’activité de NOX4, nous avons étudié son effet sur
NOX2 des phagocytes. De manière surprenante, nos études en système cell-free ont montré des
propriétés inhibitrices de Poldip2 vis-à-vis de NOX2 avec des interactions privilégiées avec
certaines des composantes du complexe oxydase. Nos résultats suggèrent que l’interaction de
Poldip2 avec le complexe pourrait constituer une nouvelle voie de régulation de NOX2 en
perturbant l’assemblage du complexe NADPH oxydase.
15Constitutive NADPH oxidase activity and its consequences on intracellular pH and
cellular viability
Hana Illichová1 (hana.illichova@u-psud.fr), Tania Bizouarn, Elodie Hudik, Oliver Nüsse, Sophie
Dupré, Marie Erard
1 Laboratoire de Chimie Physique, CNRS, Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, 91405, Orsay, France
[1] Berdichevsky et al. J Biol Chem. 2007, 282, 22122-39
[2] Masoud R et al. Free Radic Biol Med. 2017, 113, 470-477
[3] Yu, L. et al. J. Biol. Chem. 1997 272, 27288-27294
The phagocyte NADPH oxidase is a key enzyme in host defense and innate immune system,
composed of five subunits; two membrane proteins (gp91phox and p22phox), the enzymatic
catalytic core, three cytosolic subunits, p67phox, p47phox p40phox, and a small GTPase Rac. To
switch to the active state of the enzyme, assembly of all these subunits at the phagosome
membrane is required. In the active state, the role of NADPH oxidase is to transfer electrons from
cytosol to extracellular oxygen resulting in the formation of superoxide, which is a precursor of
ROS, such as hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl radical (HO°) or hypochlorous acid (HOCl) that
are critical for host responses to microbial infections. However, uncontrolled ROS production
contributes to inflammation of a healthy tissue and thus makes the NADPH oxidase a major drug
target.
Recently, we showed that a chimera [1] protein composed of the essential domains of the
cytosolic proteins p47phox, p67phox and Rac1, that are the necessary for NADPH oxidase
activation, leads to the constitutive activity of the enzyme in conditions ex vivo. This protein called
Trimera appeared to be a perfect tool to act as a single activating protein for the oxidase [2]. In
this configuration, ROS are produced continuously by the NADPH oxidase, from the moment the
Trimera is fully expressed in cells. The constitutive, robust activity in cells allows to focus on the
NADPH oxidase structure and function independently of cell stimulation.
In my presentation, I will first show the ROS production by the COSgp91,p22 cell line[3] expressing
Trimera labeled by a fluorescent protein. Secondly, I will present the consequences of continuous
ROS production in cells, e.g. the variations of intracellular pH and the effects on cell survival.
16Session 2 : Les états redox cellulaires, les protections contre les
ROS et l'environnement
The uncommon strategy of a chaperone to protect its substrates from over-
oxidation
Collet Jean-François, jean-francois.collet@uclouvain.be
de Duve Institute, Université Catholique de Louvain, Brussels, Belgium
How proteins fold and are protected from stress-induced aggregation is a long-standing mystery
and a crucial question in biology. While a long series of landmark studies have provided important
contributions to our current understanding of the proteostasis network, both in bacteria and
eukaryotes, key fundamental questions remain unsolved. Here we focused on the stress caused by
HOCl, a powerful oxidant produced by neutrophils to combat invading bacteria. HOCl, which kills
microorganisms by causing massive protein aggregation, is also the active ingredient in bleach, the
most widely used disinfectant worldwide. Although the GroEL(Hsp60)/GroES chaperone complex
is essential for Escherichia coli growth and survival, this system is inactivated during bleach stress.
We therefore postulated that a chaperone capable of protecting the substrates of GroEL/ES under
bleach stress has remained unidentified to date. This led us to identify and characterize CnoX. We
found that CnoX, which is widely conserved throughout Gram-negative bacteria and has structural
homologs in eukaryotes, is a novel type of protein-folding factor that combines holdase activity, by
which it prevents protein aggregation, with the ability to form mixed-disulfide complexes with
client proteins. Using this second function, CnoX protects sensitive cysteine residues in its
substrates from irreversible oxidation, which could otherwise interfere with refolding and/or block
reactivation.
17Oxidized Proteins:
Homeostasis of the DNA repair RecA protein is under redox control
Camille Henry1,2, Laurent Loiseau1, Angela Mérida-Floriano3, Sindhu Chitteni-Pattu2, Elizabeth
Anne Wood2, Josep Casadesús3, Michael M. Cox2, Frédéric Barras1,4, Benjamin Ezraty1
1Aix-Marseille Univ, CNRS, Laboratoire de Chimie Bactérienne, Institut de Microbiologie de la Méditerranée,
Marseille, France.
2Departement of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, USA.
3 Departamento de Genética, Universidad de Sevilla, 41012 Sevilla, Spain.
4 Institut Pasteur, Département de Microbiologie, SAMe Unit, Paris , France
Oxidative damages to DNA are repaired by several RecA-dependent pathways. In this study, we
found RecA itself could be altered by reactive oxygen species (ROS). Oxidized RecA was unable to
form filaments on DNA, to hydrolyse ATP and to perform DNA strand exchange. Methionine
sulfoxide reductases MsrA and MsrB, which reduce Met-O residues to Met, enabled oxidized RecA
to resume all of these activities. ROS exposed msrA msrB mutants of E. coli exhibited defects in
RecA-dependent processes, such as UV resistance, P1 transduction and SOS induction. Specifically
oxidation of Met35 caused complete loss of function whereas oxidation of Met164 led to loss of
recombination activity but gain of SOS activation. Thus, ROS can have both negative and positive
effects on RecA activity depending upon which Met residues got oxidized. Altogether, this work
endowed MsrAB with a new key role in cellular homeostasis, linking protein quality control and
DNA integrity.
18Studying the importance of repairing oxidized proteins during host-pathogen
interaction
Camille Andrieu, Alexandra Vergnes, Laurent Loiseau, Laurent Aussel, Benjamin Ezraty
candrieu@imm.cnrs.fr
Laboratoire de chimie bactérienne, CNRS, Marseille, France.
During infection by pathogenic microorganism, oxidative stress is produced by immune cells like
macrophages or neutrophils as a first defence against pathogen. Neutrophils have a specific
enzyme, myeloperoxidase, which is able to produce highly oxidative molecules, the hypochlorite
acid (HOCl). HOCl is able to disrupt several molecules and especially it oxidizes methionine into
methionine sulfoxide. The methionine oxidation is reversible ; this reaction is catalysed by an
ubiquitous enzyme family, the methionine sulfoxide reductase (MSR). These enzymes repair
oxidized proteins and maintain a sufficient level of free methionine. We study the involvement of
MSR in HOCl resistance and therefore in bacterial pathogenicity. For this purpose, we used
Salmonella typhimurium as a model. First of all, our work allowed us to determine an exhaustive
list of MSR activity in Salmonella. Then, a collection of MSR mutants of Salmonella combining
different deletion was generated and tested for their sensitivity to industrial HOCl and to an HOCl
production system based on purified myeloperoxidases. Our results showed that a mutant deleted
of the five MSR in Salmonella is more sensitive than the wild type strain to HOCl in both
conditions. These results encourage us to consider that MSR could be involved in the infectious
power of Salmonella typhimurium.
19Key players in redox homeostasis during the legume – rhizobia symbiosis
Nicolas Pauly1,2, Marie Pacoud1, Damien Caubrière2, Geneviève Alloing1, Karine Mandon1,
Olivier Pierre1, Clare Gough2 and Pierre Frendo1.
Nicolas.Pauly@inra.fr
1 Université Côte d'Azur, INRA, CNRS, ISA, France
2 LIPM, Université de Toulouse, INRA, CNRS, Castanet-Tolosan, France
Reactive Oxygen Species (ROS) are signaling molecules controlling various fundamental processes.
They play a crucial role in different stages of the nitrogen-fixing symbiosis (NFS) between
Medicago truncatula and Sinorhizobium meliloti. This interaction leads to the formation of a new
organ, the nodule, where rhizobia reduce atmospheric nitrogen to ammonia. Several lines of
evidence showed that M. truncatula NADPH oxidases (MtRbohs) contribute to ROS synthesis
during NFS. In parallel, S. meliloti possesses an active enzymatic (catalase, superoxide dismutase)
and non-enzymatic (glutathione) antioxidant defense participating to its hosting in root nodules. In
this context, our goal was to determine ROS signatures during NFS.
For this, we used two redox biosensors consisting of a redox-sensitive green fluorescent protein
(roGFP2), genetically fused to Orp1 (specific to H2O2) or Grx1 (related to glutathione redox state).
These biosensors exhibit excitation maxima at 400 nm (oxidized form) and 490 nm (reduced form)
that permits ratiometric measurements. We introduced these biosensors in both symbiotic
partners, and signals were analyzed by spectrofluorimetry and confocal microscopy.
We first validated the functionality of these biosensors by treating cells with reductant (DTT) and
oxidant (H2O2) compounds. We strengthened our results by performing in vivo H2O2 and redox
imaging in M. truncatula mutants (NADPH oxidases or symbiotic receptors) and S. meliloti mutants
impaired in antioxidant defense (catalase and glutathione synthetase). Acquired signals confirm
the capacity of these biosensors to perceive intracellular redox modifications in the two symbiotic
partners. Our preliminary results clearly highlight differences in both partners during different
steps of symbiosis.
In conclusion, we provide new insights in redox signaling in the NFS. The use of biosensors in both
symbiotic partners opens new possibilities to dissect plant and bacterial H2O2 dynamics and redox
regulation, including NADPH oxidase-mediated ROS signaling.
20The implication of Nox genes in ascospore germination and appressorium
development in the model fungus Podsopora anserina
Alexander Demoor, Philippe Silar and Sylvain Brun, alex.demoor@gmail.com
Equipe Génétique et Epigénétique des Champignons
LIED-Laboratoire Interdisciplinaire des Energies de Demain-UMR8236
Université Paris-Diderot
Studies carried out on different fungi phylogenetically distant and harboring very diverse lifestyles
highlight the great diversification of the role of the NADPH oxidases (Nox) within this kingdom. The
filamentous fungus Podospora anserina is a particularly amenable ascomycete model, used in our
lab for Mendelian and molecular genetics approaches. This fungus possesses three Nox isoforms
Nox1, Nox2 and Nox3. Although no role for Nox3 has been unveiled yet, Nox1 and Nox2 play key
roles throughout the life cycle of P. anserina. In particular, Nox2 is required for ascospore
germination and formation of the appressorium, the structure that allows notably pathogenic
fungi to penetrate their host. In addition to Nox2, the MAPK Mpk2/Fus3 pathway as well as the
tetraspanin Pls1 are involved in both processes suggesting that a common set of genes may
control them. Understanding ascospore germination as well as appressorium development is of
considerable importance in fungi especially for pathogenic species since both processes represent
key stages of their infectious cycle. In order to identify new genes and to dissect this common
signaling pathway at the core of which Nox2 plays a crucial role, we have isolated about fifty
mutants showing uncontrolled spontaneous ascospore germination. Six of these GUN
(Germination Uncontrolled) mutants have been sequenced and for two of them, GUN1 and GUN2,
we started the functional characterization of the candidate gene.
21Session 3a : Les ROS dans la physiopathologie
NOX1, un agent double dans l’inflammation intestinale
Pham My-Chan DANG 1, my-chan.dang@inserm.fr
1 INSERM-U1149, CNRS-ERL8252, Centre de Recherche sur l’Inflammation, Paris, France.
Les NADPH oxydases (NOXs) constituent une famille d’enzymes composée de 7 membres, NOX1 à
NOX5 et DUOX1/DUOX2, dont l’unique fonction est de générer les formes réactives de l’oxygène
(FRO ou ROS). Elles sont exprimées dans divers tissus et cellules et sont considérées comme la
principale source endogène de ROS. Produites de façon contrôlée, les ROS issues des NOXs sont
impliquées dans des fonctions physiologiques importantes, cependant une dérégulation de cette
production peut-être à l’origine de nombreuses situations physiopathologiques. La NADPH
oxydase NOX1 est un complexe multimoléculaire constituée de deux sous-unités membranaires,
Nox1 et p22phox, et trois sous-unités cytosoliques, NOXO1, NOXA1 and Rac1. Elle est
abondamment exprimée dans les cellules épithéliales du côlon où elle serait impliquée dans la
défense immunitaire innée de la muqueuse intestinale dans des conditions physiologiques.
Cependant, le dysfonctionnement de NOX1 pourrait être lié à des situations pathologiques dans le
côlon, telles que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Dans cette
présentation, je parlerai des données de la littérature qui soutiennent le rôle de NOX1 dans la
défense immunitaire de l’intestin, des mécanismes par lesquels les ROS issus de NOX1
interviennent dans la défense immunitaire de l’intestin et des conséquences physiopathologiques
d’un déficit fonctionnel ou d’une activité accrue de NOX1 dans l’intestin.
22Œdème pulmonaire lésionnel : implication des ROS médiés par Nox2 dans la
perméabilité endothéliale
Kathy Khoy1, Minh Vu Chuong Nguyen1, Dominique Masson2, Beatrice Bardy2,
Christian Drouet1,3, et Marie-Hélène Paclet1,3, MHPaclet@chu-grenoble.fr
1 Université Grenoble Alpes - GREPI EA 7408, Grenoble, France
2 Etablissement Français du Sang (EFS) Rhône-Alpes, Site de Grenoble, France
3 Centre Hospitalier Universitaire Grenoble Alpes, Grenoble, France
Le TRALI représente un œdème pulmonaire lésionnel aigu survenant au cours d’une transfusion.
Des études ont souligné le rôle central des neutrophiles (PMN) qui seraient activés par un facteur
présent dans le produit sanguin transfusé. Dans ce travail, nous avons étudié l’impact des
anticorps anti-HLA sur l’activation des PMN et de la NADPH oxydase phagocytaire Nox2, ainsi que
le mécanisme par lequel les PMN pourraient être impliqués dans la survenue du TRALI.
Les résultats montrent que les anticorps anti-HLA, à partir d’une concentration seuil, activent
Nox2, conduisant à la production de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS). Les ROS libérés sont
capables d’induire la perméabilité endothéliale. Le mécanisme d’activation des PMN par les
anticorps anti-HLA ferait intervenir la formation de complexes immuns à la surface des PMN. Ces
complexes immuns sont reconnus avec une grande affinité par les récepteurs Fc des PMN
induisant l’activation des phagocytes. Ces données permettent de valider pour la première fois
l’hypothèse de l’implication des anticorps anti-HLA dans la survenue de l’œdème lésionnel
pulmonaire en validant un modèle en deux étapes:
1) une situation clinique ou thérapeutique prédisposante du patient qui aboutit à une pré-
stimulation des PMN
2) l’apport, lors de la transfusion, d’anticorps anti-HLA au-delà d’une concentration seuil.
Cela conduit à l’activation des PMN, la libération de ROS et à une lésion endothéliale. L’action de
ces anticorps anti-HLA se ferait via la formation de complexes (antigène – anticorps) à la surface
des PMN, complexes reconnus par les récepteurs Fc. Une double interaction au sein d’un même
PMN pourrait favoriser la formation de cluster de récepteurs Fc activés au niveau de radeaux
lipidiques, conduisant à une activation optimale de ces récepteurs, entraînant une cascade de
signalisation aboutissant à l’activation de Nox2 des PMN. Ces données permettent de comprendre
l’un des mécanismes conduisant au TRALI.
23Casein kinase II, a potential regulator of NOX1 in intestinal epithelial cell during
inflammation
Liu Dan1 (liudaquna@outlook.com), Kaouthar Boudiaf 1, Marwa Ben-Khemis1, Coralie Pintard1,
Jamel El-Benna1, Thibaut Leger2, Jean-Claude Marie1, and Pham My-Chan Dang1
1 INSERM-U1149, CNRS-ERL8252, Centre de Recherche sur l’Inflammation, Paris, France.
2 Institut Jacques Monod, Université Paris Diderot 7
NADPH oxidases (or NOXs) are a unique family of enzymes dedicated to the production of reactive
oxygen species (ROS). NOX1, one of its members, is a multicomponent enzyme consisting of the
transmembrane proteins, NOX1 and p22PHOX, and the cytosolic proteins, NOXO1, NOXA1 and Rac1.
It is abundantly expressed in colon epithelial cells, where it could be involved in mucosal innate
immune defence in physiological conditions. However, dysfunction of NOX1 could be also linked to
pathological situations in the colon such as inflammatory bowel diseases (IBD). To further
understand how NOX1-derived ROS could contribute to the inflammatory process, our aim was to
identify new regulators of NOX1.
Mass spectrometry experiments identified casein kinase II (CKII), as a binding partner of NOXO1, in
T84 human colonic epithelial cell line co-stimulated by TNF⍺ and IL-17. This interaction was
confirmed by co-immunoprecipitation and western-blot analysis. In order to determine the
functional relationship between CKII and NOXO1/NOX1 we used a highly selective inhibitor of CKII,
CX4549, and found that the inhibition of CKII leads to an increase of NOX1 activity in T84 cells co-
stimulated by TNF⍺ +IL-17. In addition, we identified on NOXO1 several consensus
phosphorylation sites for CKII and showed that CKII was able to phosphorylate recombinant
NOXO1 in vitro. Furthermore, in a mice model of acute colitis induced by the intra-rectal injection
of TNBS (trinitrobenzene sulfonic acid) macroscopic and histological damages were accompanied
by increase of NOX1 and P22phox subunits expression at the protein level and decrease of CKII
activity. These data suggest that CKII could downregulate NOX1 activity and that during intestinal
inflammation, the decrease of CKII activity may lead to an increase of ROS production which could
contribute to the progress of the inflammation.
24Session 3b : Les ROS dans la physiopathologie
Rôle des NADPH Oxydases dans les cancers thyroïdiens
Rabii AMEZIANE EL HASSANI
Laboratoire de Biologie des Pathologies Humaines ‘BioPatH’, Faculté des Sciences, Université Mohammed V
de Rabat, Maroc
Les NADPH Oxydases ‘NOXs’ sont des enzymes dont la fonction unique au niveau de la cellule est
la production des espèces réactives de l’oxygène ‘ROS pour Reactive Oxygen Species’ qui jouent un
rôle important dans divers processus physiopathologiques. Il a été observé que les cellules
cancéreuses produisent une quantité de ROS plus importante que les cellules non transformées ;
et que le stress oxydatif généré pourrait favoriser l’instabilité génétique à travers des mécanismes
moléculaires non encore décortiqués.
La thyroïde exprime 3 NADPH Oxydases. Il s’agit de la DUOX2 qui génère l’H2O2 nécessaire à la
thyroperoxydase (TPO) pour la biosynthèse des hormones thyroïdiennes, et la DUOX1 et la NOX4
dont le rôle physiopathologique dans ce tissu est encore inconnu.
Dans cette conférence, nous ferons l’état des lieux des travaux de recherche concernant
l’implication des NADPH Oxydases et du stress oxydatif dans les cancers de la thyroïde. Nous
développons plus particulièrement la régulation des NADPH oxydases thyroïdiennes suite à
l’exposition aux radiations ionisantes et sous le contrôle de l’oncogène BRAFV600E. Le rôle de ces
NOXs dans les dommages à l’ADN ainsi que dans la radiorésistance thyroïdienne sera détaillé.
L’implication des NADPH Oxydases thyroïdiennes, en tant que systèmes générateurs de ROS, dans
la radio-carcinogenèse ainsi que dans la médiation des effets de l’oncogène BRAFV600E, ouvre
des perspectives prometteuses pour améliorer la prise en charge des cancers thyroïdiens.
25Rôle de la NADPH oxydase DUOX1 dans la fibrose pulmonaire radio-induite
Ruy Andrade Louzada1-4, Raphaël Corre2,3, Rabii Ameziane El Hassani5, Lydia Meziani3,6, Eric
Deutsch3,6, Bruno Crestani7 & Corinne Dupuy1-3
1 Université Paris-Sud, Orsay, France
2 UMR 8200 CNRS, Villejuif, France
3 Gustave Roussy, Villejuif, France
4 Laboratorio de Fisiologia Endocrina Doris Rosenthal, Instituto de Biofısica Carlos Chagas Filho,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
5 Laboratoire de Biologie des Pathologies Humaines ‘‘BioPatH,’’ Faculté des sciences, Université
Mohammed V de Rabat, Rabat, Morocco
6 INSERM U1030, Villejuif, France
7 Inserm UMR1152, Université Paris Diderot Paris7-UFR de Médecine Site Bichat, Paris, France
Bien que la radiothérapie soit le deuxième contributeur en terme de guérison définitive avec plus
de 50% des patients complètement guéris, les effets tardifs, comme la fibrose, demeurent un
risque important pour les survivants du cancer à long terme. La gestion des effets secondaires dus
aux radiations ionisantes est devenue un aspect important de la qualité de vie des patients
pendant et longtemps après la radiothérapie soulignant ainsi la nécessité d'une plus profonde
compréhension de la physiopathologie sous-jacente aux séquelles observées après RI pouvant
conduire à de nouvelles interventions thérapeutiques.
L'irradiation thoracique des tumeurs malignes du poumon peut conduire à deux syndromes
bien connus associés aux dommages de l’irradiation: une réponse inflammatoire précoce
(pneumonie) et à la fibrose. Un nombre croissant d’études suggère fortement l’implication d’un
stress oxydatif chronique, généré par une production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS),
dans la progression de la fibrose. Les cellules peuvent produire des ROS par l’activation et/ou
l’induction de NADPH oxydases. Ces protéines membranaires, qui constituent une nouvelle
famille d'enzymes (NOX/DUOX), sont totalement dédiées à la production de ROS. Nos données in
vitro et in vivo (souris sauvages versus souris déficiente en DUOX1) montrent que la NADPH
oxydase DUOX1 est induite à post-irradiation dans les cellules pulmonaires et joue un rôle clé dans
les lésions tardives induites par l’irradiation thoraxique.
L'identification DUOX1 comme régulateur des voies pro-fibrotiques peut offrir une approche
prometteuse.
26Gadolinium-based nanoparticles enhances the NOX5/p53-dependent senescence
elicited by ionizing radiation
Frédéric Law1-4, Laurent Voisin1-4 , Haithem Dakhli1-4, Maxime Thoreau1-4, David M. Ojcius5,
Eric Deutsch2-4, Olivier Tillement6, Awatef Allouch1-4 and Jean-Luc Perfettini1-4
1 Cell death and Aging team, Gustave Roussy, 114 rue Edouard Vaillant, F-94805 Villejuif, France; 2
Laboratory of Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, 114 rue Edouard Vaillant, F-94805
Villejuif, France;
3 Gustave Roussy, 114 rue Edouard Vaillant, F-94805 Villejuif, France;
4 Université Paris Sud - Paris Saclay, 114 rue Edouard Vaillant, F-94805 Villejuif, France;
5 Department of Biomedical Sciences, University of the Pacific, School of Dentistry, 155 Fifth Street, San
Francisco, California 94103;6 CNRS UMR5306, Université Claude Bernard Lyon 1, CNRS, Institut Lumière
Matière, F-69622, Villeurbanne, France.
The radiation therapy (also known as radiotherapy) is one of the most common strategies against
tumors. More than half of all patients with cancer are treated with ionizing radiation (IR) alone or
in combination with surgery or chemotherapy. Several applications of nanomedecine (such as
radioisotope-labeled or metallic nanoparticles) have been developed to improve the therapeutic
index of radiation therapy by using nanomaterials as contrast agents to better deliver the
radiation doses into tumor sites and/or as radiosensitizers, to enhance the dose deposition in
tumors and reduce irradiation-related side-effects. Although the combination of heavy-metal-
based nanoparticles with ionizing radiation is extensively studied for cancer treatment, the
biological mechanisms involved in the tumor response are poorly understood. We showed that
the combination of gadolinium-containing nanoparticles with ionizing radiation induces G2/M cell
cycle arrest and increased expression of the cyclin-dependent kinase p21, and triggers the
senescence of irradiated cancer cells. Thus, the combination of gadolinium-containing
nanoparticles with ionizing radiation impairs the proliferation of cancer cells by inducing the
senescence of irradiated cells. Interestingly, the induction of this cellular process requires NADPH
oxidase 5 (NOX5)-dependent ROS production and the transcriptional activation of tumor
suppressor protein p53. Altogether, our results revealed that the combination of gadolinium-
based nanoparticles with ionizing radiation induces the senescence of irradiated cancer cells by
triggering a NOX5/p53-dependent signaling pathway.
27Implication of miRs 199a-3p/5p in oxidative stress and angiogenesis in local and
systemic effects of a Th2 autoimmune disease: Graves’ thyroiditis.
Julie Craps*1, Virginie Joris*2, Michel Mourad3, Antoine Buemi3, Chantal Daumerie3, Benoit
Lengelé1, Leilo Baldeschi4, Antonella Boschi4, Chantal Dessy**2 and Marie-Christine Many**1.
Julie.craps@uclouvain.be
1IREC - MORF, ²IREC - FATH, 3Endocrinology Department, 4Ophthalmology Department, Faculté de
Médecine, Université catholique de Louvain, Bruxelles, Belgium.
*Co-first authors,** Co-last authors
Graves’ thyroiditis (GD) is characterized by hyperthyroidism and often associated to
ophthalmopathy (TAO). GD thyroids and adipose tissue present high oxidative stress (OS) and
hypervascularization. miR199a-3p (3p) and miR199a-5p (5p) are involved in endothelial function,
OS, angiogenesis and adipogenesis. Therefore, we aimed to measure 3p/5p expression in samples
from GD patients and evaluate their potential impact on development of GD-clinical and systemic
effects.
Thyroid samples were obtained from patients operated for multinodular goiters (controls) or GD,
orbital fat samples came from blepharoplasty or TAO. miRs expressions were evaluated following
Maxwell extraction and quantitative real-time PCR. To mimic GD, human primary thyrocytes were
stimulated with IL-4. Microvascular endothelial cells were cultured in matrigel support in the
presence of medium from non-treated or IL-4 treated (GD-conditioned medium) thyrocytes and
angiogenic effect of GD was evaluated by tubes formation. Proteins have been analyzed by
immunohistochemistry and Western Blot.
GD thyrocytes showed an increased 4-hydroxynonenal, indicating a rise in lipid peroxidation, and
increased catalase expression suggesting improved H2O2 detoxification. NADPH-oxidase-4
upregulation in GD thyroids correlated with HIF-1α stabilisation and upregulation of VEGF
expression. GD-conditioned medium promoted tubes formation in 2D-endothelial cultures. A
significant reduction of 3p/5p expression in GD thyroids was observed. Interestingly, GD orbital
adipocytes also showed a downregulation of 3p/5p.
In conclusion, we showed a dramatic reduction in miR199a-3p/5p expression in GD-thyroid
extracts and GD-orbital fat. Taken together, our results are in agreement with a potential
implication of these miRs as regulators of OS, angiogenesis and the systemic manifestations of GD.
28Session 4 : ROS et signalisation cellulaire: de la membrane au noyau
H2O2 signaling in development and regeneration
Sophie Vriz, vriz@univ-paris-diderot.fr
Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Collège de France, Paris - FRANCE
Reactive oxygen species, long considered only in terms of oxidative stress, are now seen as an
integral part of cell signaling mechanisms based on protein thiol modifications and short-lived lipid
formation in physiological contexts. Recent years highlighted the role of redox signaling in cell
plasticity both during development and regeneration (which may be regarded as a form of adult
development). Back and forth examination of the involvement of redox signaling in cell behavior
during these two developmental processes will illustrate common and divergent features.
29Le TNFα potentialise l’activation de NOX2 et empêche la réponse des monocytes à
l’IL-10.
Marwa Ben Khemis1(marwa.benkhemis@inserm.fr), Coralie Pintard1, Dan Liu1, Min Liu1, Marjan
Mojallali1, Amira hajdahmane1, Margarita Huratado-Nedelec1, Jamel El-Benna1, and Pham My-
Chan Dang1
INSERM-U1149, CNRS-ERL8252, Centre de Recherche sur l’Inflammation, Paris, France.
La NADPH oxydase des cellules phagocytaires (NOX2) est un complexe enzymatique dont l’unique
fonction est de produire les formes réactives de l’oxygène (FRO) qui sont essentielles à la défense
anti-infectieuse de l’hôte. Cependant, une production excessive de FRO peut induire des lésions
tissulaires contribuant ainsi à la genèse des maladies inflammatoires. De ce fait la production des
FRO par NOX2 doit être finement régulée. L’activité de NOX2 peut être potentialisée ou diminuée
selon deux processus appelés respectivement « priming » et « de-priming ». Alors que le
mécanisme de priming de NOX2 est bien connu, le mécanisme de désactivation de NOX2 demeure
actuellement très mal compris. Notre objectif est de déterminer si l’IL-10, une cytokine anti-
inflammatoire, est capable d’inhiber le priming de la production des FRO induit par le TNFα une
cytokine pro-inflammatoire, dans les monocytes.
Nos résultats montrent que le TNFα, induit un priming de NOX2 dans les monocytes. Cependant,
l’IL-10, n’exerce aucun effet sur ce priming. Afin de comprendre cette incapacité de l’IL-10 à
inhiber le priming de NOX2 induit par le TNFα, la signalisation intracellulaire de ces deux cytokines,
seules ou en combinaison, a été analysée. Les résultats révèlent que le TNFα interfère avec la
signalisation de l’IL-10 en induisant une déphosphorylation rapide de STAT3, l’effecteur en aval du
récepteur de l’IL-10. La déphosphorylation de STAT3 implique l’intervention d’une tyrosine-
phosphatase de type SHP1/SHP2 mais semble indépendante des voies MAP kinase qui sont
activées par le TNFα
. L’inhibition de la voie IL-10 est une propriété spécifique du TNFα En effet, les autres médiateurs
pro-inflammatoires, GM-CSF et LPS, ne sont pas capables d’inhiber la signalisation de l’IL-10. Ces
résultats révèlent qu’en plus d’exercer des effets pro-inflammatoires, parmi lesquels le priming de
la production des FRO, le TNFα pourrait exacerber l’inflammation en empêchant la réponse des
monocytes à l’IL-10
30Dynamique de Nox2 lors de la phagocytose
J. Joly1, R. Le Bars2, S. Dupré1 & O. Nüße1
1 Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, 91405 Orsay, France, et CNRS U8000, LCP, 91405 Orsay,
France
2 Imagerie-Gif Cell Biology Pole, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université
Paris-Sud, Université Paris-Saclay, 91198 Gif-sur-Yvette cedex, France
Les neutrophiles sont les premières cellules à arriver au site de l’infection où elles internalisent les
pathogènes par phagocytose. Dès le début du processus, la NADPH oxydase s’assemble au
phagosome et contribue à la destruction du pathogène. La sous-unité catalytique membranaire de
la NADPH oxydase, Nox2, est donc recrutée à la coupe phagocytaire puis au phagosome. Le
dessein de cette étude est de savoir si Nox2 s’accumule au phagosome et le cas échéant, quel est
le timing de cette accumulation et quelles sont ses sources subcellulaires, ainsi que l’influence de
cette accumulation sur son pattern de distribution dans la membrane.
Notre étude a utilisé des cellules neutrophil-like (PLB-985) pour lesquelles l’expression de Nox2 a
été supprimée1 puis réintroduite avec un transgène codant pour la protéine GFP-Nox22 ainsi que
des neutrophiles humains. La caractérisation de ces nouvelles cellules a permis le suivi de
l’évolution de la quantité de GFP-Nox2 au phagosome. Par immunofluorescence, la colocalisation
de Nox2 avec les endosomes Rab11 et EEA1 positifs a ensuite été étudié, dans les cellules au repos
et lors de la phagocytose, dans les PLB-985 et neutrophiles. Enfin, grâce à la technique de
dSTORM, l’évolution du pattern de Nox2 dans la membrane a été évalué au cours du temps en
phagocytose frustrée.
Ces travaux ont montré que dans les PLB-985, la sous-unité NOX2 s’accumule majoritairement au
phagosome cinq minutes après sa fermeture. Dans les PLB-985 et dans les neutrophiles, la
présence de Nox2 dans des endosomes de recyclage ou dans des endosomes précoces a aussi été
mise en évidence. La présence d’endosomes accolés phagosome suggère leur implication dans
l’apport de Nox2 au phagosome. En phagocytose frustré on constate après dix minutes une
augmentation du nombre mais pas de la taille des micro-domaines contenant Nox2.
1 : L. Zhen et al., PNAS, 1993
2 : H. van Manen et al., Biophys J, 2008
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