Caractérisation des protéines de choc thermique de faible poids moléculaire chez les bactéries lactiques
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Lait (1998) 78,165-171 165
© Inra/Elsevier, Paris
Caractérisation des protéines de choc thermique
de faible poids moléculaire chez les bactéries lactiques
Michel-Philippe Jobin, Françoise Delmas, Dominique Garmyn,
Charles Divies, Jean Guzzo
Laboratoire de microbiologie, U.A.-/nra, Ensbana, esplanade Erasme, 21000 Dijon, France
Abstract - Characterization of small heat shock proteins in lactic acid bacteria. Among heat
shock proteins (Hsp), low molecular weight Hsp (smHsp) are the less known. Four smHsp were
recently studied in lactic acid bacteria (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lac-
tobacillus helveticus et Oenococcus oeni). These smHsp are related to Eukaryotic œ-crystallins
able to form high molecular weight complexes with a chaperoning activity. Induction factors
of smHsp vary with the lactic acid bacterium. The expression of L. helveticus and O. oeni smHsp
genes are governed by different promoter structures. In L. helveticus, the regulation system is like
Lactococcus lactis stress genes already known with a vegetative promoter and a CIRCE sequence.
ln O. oeni, the regulation seems to be closely related to the class III stress genes, the less known
mechanism of regulation in Bacillus subtilis. © InralElsevier, Paris.
stress / lactic acid bacteria / smHsp / œ-erystallin
Résumé - Parmi les protéines de choc thermique (Hsp), celles de faible poids moléculaire
(smHsp) sont les moins connues. Quatre smHsp ont été récemment étudiées chez des bactéries
lactiques (chez Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveti-
eus et Oenococcus oeni). Ces srnHsp sont apparentées aux a-cristallines des Eucaryotes capables
de former des complexes de haut poids moléculaire possédant une activité de chaperonne. Les fac-
teurs d'induction des smHsp varient selon les bactéries lactiques. L'expression des gènes de
smHsp de L. helveticus et d'O. oeni est gouvernée par des structures promotrices différentes.
Chez L. helveticus le système de régulation serait comparable aux gènes de stress connus chez Lac-
tococcus lactis, avec un promoteur végétatif et un séquence CIRCE. Alors que chez O. oeni, la
régulation serait plus proche du modèle encore méconnu des gènes de stress de classe III décrit
chez Bacillus subtilis. © Inra/Elsevier, Paris.
stress / bactérie lactique / smHsp / a-cristalline166 M.P. Jobin et al.
1. INTRODUCTION souvent par une forte mortalité des cel-
lules. Il a cependant été montré qu'un pré-
Les bactéries lactiques sont capables traitement des cellules d'O. oeni à 42 "C
de fermenter les sucres en acide lactique. entraîne une augmentation de leur survie
Leur capacité de tolérance à l'acidité en dans le vin, de leur capacité à réaliser la
fait un outil de technologie industrielle FML et s'accompagne de la synthèse de
pour la transformation et la conservation protéines de stress (Hsp) [10].
de nombreux produits alimentaires d'ori- Chez les bactéries lactiques, l'étude de
gine animale ou végétale. Lors des pro- la réponse au stress est assez récente et
cédés industriels, les bactéries lactiques l'espèce la mieux caractérisée est Lacto-
sont soumises à des stress multiples pou- coccus lactis. Parmi les Hsp repérées chez
vant provenir de la croissance bactérienne L. lactis sur gels bidimensionnels, cer-
elle-même (par acidification du milieu et taines ont été identifiées par immunodé-
appauvrissement en nutriments) ou impo- tection comme étant les homologues de
sés dans l'environnement (par modifica- DnaK, Dnal, GroEL, GrpE [1], Lon et la
tion de la température ou du pH, choc protéase ATP-dépendante ClpB d'Esche-
osmotique, lyophilisation, etc). richia coli [3]. D'autres Hsp ont été carac-
Les bactéries possèdent cependant un térisées au niveau moléculaire. Elles
pouvoir d'adaptation. Un choc physico- appartiennent aux différents groupes de
chimique sublétal entraîne la mise en place protéines de stress:
de dispositifs physiologiques temporaires - DnaK [7] et GroEL [15] sont des pro-
assurant la survie dans le nouvel environ- téines chaperonnes qui participent au
nement. L'étude de ces mécanismes de repliement dans une conformation cor-
réponse aux stress chez les bactéries lac- recte des protéines en cours de synthèse
tiques devrait permettre d'améliorer la qua- et sont capables de rompre des agrégats
lité des levains lactiques utilisés en indus- protéiques provoqués par un stress;
trie. - DnaJ [26], GroES [15] et GrpE [7]
Oenococcus oeni, anciennement Leu- sont des Hsp assistant les protéines cha-
conostoc oenos [6], présente des propriétés peronnes;
acidophiles et de résistance à l'éthanol lui - HflB [18] est une protéase membra-
permettant de résister aux conditions envi- naire ATP-dépendante homologue de FtsH
ronnementales extrêmes du vin (un pH dont le rôle chez E. coli est de dégrader
allant de 3 à 3,5, des concentrations en le facteur (J32.
éthanol de 10 à 13 % et en sulfites de 50 à Des Hsp de faible poids moléculaire
100 mglL). Cette bactérie apparaît comme (ou smHsp, de masse allant de 14 à
un bon modèle pour étudier la réponse à 30 kDa) ont été repérées chez L. lactis,
de multiples stress chez les bactéries lac- mais aucune n'a encore été caractérisée.
tiques. .
En se développant dans le vin, O. oeni
réalise la fermentation malolactique 2. LES srnHsp CHEZ
(FML) qui est la décarboxylation du LES BACTÉRIES LACTIQUES
L-malate en L-Iactate. Cette désacidifica-
tion qui intervient après la fermentation Récemment, quatre smHsp ont été étu-
alcoolique, joue un rôle important sur la diées chez des bactéries lactiques. Une
qualité finale de certains vins [16]. Des smHsp de 16 kDa a été purifiée et entiè-
levains malolactiques sont couramment rement séquencée chez Streptococcus ther-
employés pour déclencher la FML mais mophilus [8]. D'autres smHsp ont fait
l'ensemencement direct du vin se traduit l'objet d'études génétiques. Chez Lacto-Les smHsp chez les bactéries lactiques 167
bacillus delbrueckii, le gène d'une smHsp tallines est capable de former des com-
a été partiellement séquencé (EMBL, plexes multimériques et possède une acti-
numéro d'accession P94867). Enfin, deux vité de chaperonne in vitro. La surex-
smHsp sont bien caractérisées au niveau pression de cette smHsp limite l'autolyse
moléculaire: une smHsp de 17 kDa chez des cellules lors de la phase stationnaire
Lactobacillus helveticus [25] et Lo 18, une tardive [27]. Cette smHsp est aussi un des
smHsp de 18 kDa chez O. oeni [14]. facteurs antigéniques majeurs de M. tuber-
Les smHsp sont les protéines de stress culosis [5].
les moins conservées dans leur séquence La localisation cellulaire de Lo 18 a été
en acides aminés. Cela explique les pour- examinée chez O. oeni. Elle est détectée à
centages d'identités assez faibles au sein la fois dans la fraction cytoplasmique et
des bactéries lactiques (inférieurs à 38 %) la fraction membranaire. Lo 18 est reliée
par rapport aux Hsp de plus haut poids de manière périphérique à la membrane
moléculaire qui sont souvent conservées plasmique par des interactions protéine-
pour plus de 50 % de leur séquence. Les protéine faibles [14]. La détection d'une
smHsp des bactéries lactiques présentent smHsp à la fois dans le cytoplasme et la
cependant un motif consensus dans leur membrane plasmique a déjà été rapportée
région C-terminale (figure 1) et appar- pour la protéine SP21 chez Stigmatella
tiennent à une même famille apparentée aurantiaca [17].
aux a-cristallines des Eucaryotes. Les a- La membrane plasmique étant la pre-
cristallines sont des protéines de stress mière cible lors d'un stress thermique,
capables de former in vivo des complexes acide ou éthanolique, il est possible que
multimériques allant de 200 à 800 kDa. la smHsp Lo 18 soit impliquée dans la
Elles possèdent une activité de chaperonne réponse permettant le maintien de l'inté-
in vitro comparable aux Hsp de plus haut grité de la membrane d'O. oeni en parti-
poids moléculaire [13] : elles limitent cipant par son activité de chaperonne à
l'agrégation des protéines en conditions l'adaptation de la structure membranaire
dénaturantes et favorisent leur renatura- aux nouvelles conditions environnemen-
tion en conditions normales de manière tales.
ATP-indépendante. La région C-terminale Les facteurs d'induction de ces smHsp
bien conservée parmi ces protéines semble sont multiples. Chez O. oeni, Lo 18 est for-
être impliquée dans cette activité de cha- tement surexprimée lors d'un choc ther-
peronne [24] qui est localisée au centre mique à 42 "C (figure 2). Lors d'un pas-
des complexes multimériques [4]. sage rapide de 30 à 37 ou à 42 "C, la
Au sein des procaryotes, il a été montré protéine est immunodétectée au bout de
que chez Mycobacterium tuberculosis, une 5 minutes et pendant au moins 3 heures
smHsp de 16 kDa homologue des a-cris- [14]. Un choc acide (de pH 5,3 à 3) ou
o oeni 148
L de~bru 124
5 thermo 140
Figure 1. Alignement des séquences C-terminales des smHsp des bactéries lactiques Oenococ-
eus oeni (O. oeni), Lactobacillus delbrueckii (L. de/bru) et Streptococcus thermophilus
(S. thermoï. * Acides aminés identiques. La séquence consensus caractéristique des a-cristallines
est encadrée.
Figure 1. Alignement of C-termina1 sequences from lactic acid bacteria Oenococcus oeni
(O. oeni), Lactobacillus delbrueckii (L. delbru) and Streptococcus thermophilus (S. thermos.
* Identical amino-acids. The œ-crystallin characteristic consensus sequence is boxed.168 M.P. Jobin et al.
Figure 2. Électrophorèse bidimensionnelle des protéines de Oenococcus oeni marquées à la
methionine [35S]. A. Conditions normales de croissance. B. Après un choc thermique (1 heure à
42 oC).
Figure 2. Bidimensional electrophoresis of [35S] methionine labelled proteins from Oenococcus
oeni. A. Normal growth conditions. B. After a heat shock (1 hour at 42 "C).
éthanolique (éthanol à 12 % vol/vol) ainsi tous les gènes de protéines de stress
que le passage en phase stationnaire de connus chez L. lactis (pour revue, [2]).
croissance sont aussi des phénomènes Aucune séquence similaire n'est présente
induisant la synthèse de Lo 18 [11]. Cette en amont du gène hspl8 chez O. oeni.
smHsp est donc une composante impor-
La comparaison de ces deux régions
tante de la réponse globale au stress de
promotrices identifiées ne permet pas de
O. oeni. Chez S. thermophilus, la smHsp
proposer un mécanisme unique de régu-
de 16 kDa est induite par un choc acide. Sa
lation des gènes de smHsp chez les bac-
surexpression lors du passage en phase
téries lactiques. Les données dont nous
stationnaire de croissance semble être due
disposons pour l'instant sont à comparer
à l'acidité et non à la carence nutrition-
nelle du milieu [8]. Chez L. helveticus, la aux deux modèles bactériens pour la régu-
smHsp de 17 kDa est induite lors d'un lation de l'expression des gènes de stress:
choc thermique [25]. E. coli et Bacillus subtilis (pour revue,
[21]).
Le mécanisme de régulation établi chez
3. RÉGULATION DE E. coli ne peut pas servir de modèle pour
L'EXPRESSION DES smHsp les smHsp des bactéries lactiques. En effet,
DES BACTÉRIES LACTIQUES la réponse au stress d'E. coli est sous le
contrôle des facteurs sigma alternatifs (J32
et (J24 qui reconnaissent des promoteurs
Les gènes de smHsp clonés chez
de type heat shock.
O. oeni et L. helveticus (respectivement
hsp 18 et hsp 17) ont été séquencés et leurs Chez B. subtilis, il existe trois classes de
régions promotrices déterminées [14,25]. régulation des gènes de stress.
Les cadres de lecture de ces gènes sont La classe 1 regroupe les opérons dnaK
précédés par des promoteurs caractéris- et groE qui possèdent un promoteur végé-
tiques de type domestique dits « végéta- tatif et une séquence CIRCE stabilisée par
tifs », Le gène hsp17 de L. helveticus pos- le répresseur HrcA (figure 3A). L'inacti-
sède une séquence inversée-répétée vation du répresseur lors d'un stress désta-
(CIRCE) que l'on retrouve en amont de biliserait la séquence inversée-répétée etLes smHsp chez les bactéries lactiques 169
permettrait la transcription des gènes appartient à cette classe et est soumis à
(figure 3B). Ce modèle pourrait être retenu une régulation transcriptionnelle négative
pour expliquer la régulation du gène hsp J7 puisque la délétion d'une partie en amont
de L. helveticus comme celle des gènes de son promoteur permet la transcription
de stress connus chez L. lactis. du gène [20].
La régulation des gènes de classe II L'expression de la smHsp Lo 18 chez
(une quarantaine de gènes de stress) ne O. oeni apparaît être régulée au niveau
peut pas s'appliquer aux gènes de smHsp transcriptionnel [14]. Le gène hsp J 8, sous
des bactéries lactiques puisqu'elle fait le contrôle d'un promoteur végétatif mais
intervenir un facteur sigma alternatif, crB sans séquence CIRCE, semble s'apparen-
qui permet à l'ARN-polymérase de se fixer ter à cette classe III dont la régulation est
sur des promoteurs particuliers. encore méconnue. Ce serait aussi le cas
La classe III comprend les gènes des des gènes de smHsp d'autres micro-orga-
protéases A TP-dépendantes Ion, C!pC, nismes comme Clostridium acetobutyli-
clpP etftsH. Ces gènes possèdent un pro- cum [19] ou Streptomyces albus [22].
moteur végétatif sans séquence CIRCE et Toutefois, Lo 18 étant synthétisée en
font intervenir pour leur régulation un ou phase stationnaire de croissance, on ne
plusieurs éléments inconnus. Il a été peut exclure qu'un facteur sigma homo-
récemment montré que le gène htpG logue à crS (le facteur sigma alternatif de la
A
HrcA
ARNpol.
CIRCE hsp
P.V. )(.
'B
ARNpol. HrcA
P.V.
n
hsp
M.
Figure 3. Régulation des gènes de choc thermique de classe 1 chez Bacillus subtilis. A. Condi-
tions normales de croissance. B. Après choc thermique. hsp: gène de protéine de stress; P.Y. :
promoteur végétatif; CIRCE : séquence inversée-répétée; HrcA : régulateur; HrcA : régulateur
dénaturé; ARN-poI. : ARN-polymérase. La flèche indique l'initiation de la transcription.
Figure 3. Regulation of c1ass 1 heat-shock genes in Bacillus subtilis. A. Normal growth conditions.
B. After thermal shock. hsp: heat-shock gene; P.Y.: vegetative promoter; CIRCE: contolling
inverted-repeat of chaperone expression; HrcA: regulator; HrcA: denaturated regulator; ARN-poI.:
RNA-polymerase. Arrow indicates the trancription inititation.170 M.P. Jobin et al.
phase stationnaire chez E. coli [12]) soit RÉFÉRENCES
impliqué dans l'expression du gène, même
si à l'heure actuelle encore aucun facteur [Il Auffray Y., Gansel X., Thammavongs B.,
Boutibonnes P., Heat shock-induced protein
sigma alternatif n'a été mis en évidence synthesis in Lactococcus lactis subsp lactis,
chez une bactérie lactique. Curr. Microbiol. 24 (1992) 281-284.
[2] Boutibonnes P., Les protéines de choc ther-
Une régulation post-transcriptionnelle mique chez Lactococcus lactis : synthèse et
pourrait aussi intervenir au niveau de la régulation; thermotolérance, Lait 76 (1996)
111-128.
stabilité du messager, de l'efficacité de sa
[3] Boutibonnes P., Bisson V., Thammavongs 8.,
traduction ou de la stabilité de la protéine. Hartke A., Pan off 1.M., Benachour A., Auf-
Ainsi, chez S. albus, la synthèse de la fray Y., Induction ofthermotolerance by che-
smHsp Hsp 18 est soumise d'une part à une mical agents in Lactococcus lactis IL 1403,
Int. 1. Food Microbiol. 25 (1995) 83-94.
régulation transcriptionnelle faisant inter-
[4] Boyle D., Gopalakrishnan S., Takemoto L.,
venir un régulateur négatif, d'autre part à Localization of the chaperone binding site,
une thermorégulation post-transcription- Biochem. Biophys. Res. Commun. 192
nelle agissant sur l'efficacité de traduction (1993) 1147-1154.
du messager [23]. [5] Chang Z., Primm T.P., lakana 1., Lee I.H.,
Serysheva 1., Chiu W., Gilbert H.F., Quio-
cha F.A., Mycobacterium tuberculosis
16-kDa antigen (HspI6.3) functions as an
oligomeric structure in vitro to supress ther-
4. CONCLUSION mal aggregation, 1. Biol. Chem. 271 (1996)
7218-7223.
[6] Dicks L.M., Dellaglio F., Collins M.D., Pro-
L'étude de la réponse au stress chez les posai to reclassify Leuconostoc oenos as
bactéries lactiques devrait permettre d'ac- Oenococcus oeni (corig.) gen. nov., comb.
nov., Int. 1. Syst. Bacteriol. 45 (1995)
croître la résistance des cellules aux 395-397.
contraintes imposées dans leur environ- [7] Eaton T., Shearman c, Gasson M., Cloning
nement en vue d'améliorer la qualité des and sequence analysis of the dnaK gene
levains utilisés pour l'ensemencement des region of Lactococcus lactis subsp. lactis,
1. Gen. Microbiol. 139 (1993) 3253-3264.
milieux extrêmes. Cependant, si les
[8] Gonzalez-Marquez H., Réponse au stress
diverses Hsp de haut poids moléculaire
acide chez Streptococcus thermophilus. Puri-
sont relativement bien caractérisées, les fication, identification et caractérisation d'une
connaissances acquises sur les smHsp sont protéine surexprimée, Ph. D. Thesis, univer-
sité Henry-Poincaré, Nancy, France, 1997
encore restreintes. Ce sont les Hsp les
[9] Gonzalez-Marquez H., Perrin c, Bracquert P.,
moins conservées au niveau de leur
Guimont c., Linden G., A 16 kDa protein
séquence en acides aminés. Leurs facteurs family overexpressed by Streptococcus ther-
d'induction sont multiples et varient selon mophilus PB 18 in acid environments, Micro-
biology 143 (1997) 1587-1594.
les microorganismes. Enfin, les méca-
[10] GUZZD1., Cavin 1.F., Diviès C., Induction of
nismes de régulation de leur expression
stress proteins in Leuconostoc oenos to per-
ainsi que leur rôle dans la réponse au stress form direct inoculation of wine, Biotechnol.
constituent de larges champs à explorer. LeU. 16 (1994) 1189-1194.
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