Explications des analyses génétiques concernant la recolonisation des Alpes par le loup - Kora
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Explications des analyses génétiques concernant la recolonisation des Alpes par
le loup
• Introduction
Le Laboratoire de Biologie de la Conservation (LBC), fondé en 1999, est une unité spécialisée du
Département d'Ecologie et Evolution de l'Université de Lausanne, orientée vers les sciences appliquées. Il a
été fondé et est actuellement dirigé par le Dr Luca Fumagalli, et en font partie deux techniciens de
laboratoire ainsi que des étudiants en thèse et en master. Le LBC développe et employe des techniques de
génétique moléculaire pour l'étude et la gestion de populations naturelles, en particulier celles menacées
d'extinction. Ses prestations s'adressent aux organisations concernées par la gestion et la conservation de la
biodiversité, représentées notamment par des agences gouvernementales, des ONG, des instituts
universitaires, des privés ou des instances juridiques et douanières (dans le cas de braconnage d'espèces
protégées). Le LBC a travaillé sur des espèces aussi variées que mammifères, oiseaux, poissons, reptiles et
amphibiens, et pour le compte de nombreux pays européens. Depuis la fin des années 90, il est chargé par
l'Office Fédéral de l'Environnement de développer des méthodes génétiques non-invasives pour étudier la
recolonisation des Alpes suisses par de grands prédateurs tels que le loup et l'ours.
L'analyse d'échantillons collectés de façon non-invasive sur le terrain (salive, crottes, poils, urine, ...) est
extrêmement difficile techniquement à cause de la très faible quantité et mauvaise qualité de l'ADN présent
dans ce type d'échantillon. Pour cette raison, une logistique et des protocoles particuliers doivent être mis en
place, la durée des analyses est sensiblement plus longue que celle pour des échantillons conventionnels, et
une proportion non négligeable d'échantillons ne donnera pas de résultats correctement interprétables. Le
LBC fait partie d'un petit nombre de laboratoires à travers le monde qui propose ce genre d'analyses "à la
carte".
La figure 1 illustre en guise d'exemple le nombre d'analyses et le type d'échantillon que le LBC a analysé de
1999 à 2009 pour le mandat concernant la recolonisation des Alpes par le loup (Canis lupus) .
-1-La figure 2 montre la proportion des différentes espèces identifiées par séquençage de l'ADN au cours des
années 1999 à 2009 pour le mandat concernant la recolonisation des Alpes par le loup (Canis lupus) .
Le tableau 1 montre la première date où la présence d'un loup a été confirmée par analyse génétique dans les
cantons suisses où l'espèce a transité au moins une fois.
-2-• Méthodes
Pour les analyses non-invasives appliquées au loup, deux techniques sont essentiellement utilisées par le
LBC:
- le séquençage de l'ADN mitochondrial, qui permet d'identifier l'espèce qui est présente dans un échantillon
et son origine géographique (lignée génétique). La précision de ce dernier point dépend en grande partie de
l'espèce analysée et de son histoire démographique. Dans l'exemple du loup, nous pouvons par exemple
déterminer sans ambiguïté que l'origine génétique des individus identifiés dans l'ensemble des Alpes à partir
de la fin des années 80 est la péninsule italienne, car la variante génétique que l'on a détecté par séquençage
chez la totalité de ces individus est présente uniquement dans les populations sauvages du sud et du centre de
l'Italie et nulle part ailleurs dans le monde.
- le génotypage microsatellite, qui permet d'identifier les individus en établissant des profils ADN
individuels. Cette technique est beaucoup plus sensible à la faible quantité/qualité de l'ADN que le
séquençage, et pour cette raison une partie des échantillons dont l'ADN a été préalablement sequencé avec
succès ne pourront pas être génotypés.
Les différentes étapes d'une analyse génétique pour identifier l'espèce et établir un profil ADN sont résumées
ci-dessous:
1. Echantillonnage 10. Analyse et
sur le terrain interprétation des
données
2. Stockage des
échantillons Laboratoire LBC
9. Génotypage des profils
ADN par migration capillaire
3. Extraction de
l'ADN présent dans
les échantillons
8. Amplification de 8
microsatellites +
4. Amplification de marqueur du sexe
l'ADN mitochondrial
5. Migration de
l'ADN sur gel dans un
champ électrique LOUP
6. Purification et 7. Analyse et
séquençage de l'ADN interprétation des
données
Autres
espèces
-3-Remarques:
- les étapes 1 et 2 sont très importantes et vont influencer la suite des analyses.
- dans les analyses non-invasives, les quantités d'ADN que l'on essaye d'extraire dans l'étape 3 sont souvent
de l'ordre du picogramme (mille milliardièmes de gramme).
- les échantillons (à l'exception des crottes) vont subir un traitement durant toute la nuit (env. 8 heures)
précédant l'étape 3.
- si lors de l'étape 5 les fragments souhaités ne sont pas détectés, un deuxième essai est entrepris à partir de
l'étape 3 ou 4. Si celui-ci n'aboutit pas, l'échantillon en question fera partie de la catégorie "pas d'ADN".
- lors des étapes 4 à 7, les écouvillons requièrent deux fois plus d'analyses que les autres échantillons.
- lors de l'étape 7, nous allons trier les échantillons attribués au loup, et poursuivre les analyses avec ces
derniers uniquement.
- lors de l'étape 7, la superposition de plusieurs séquences due à la contamination par plusieurs espèces ne
sera généralement pas lisible, et l'échantillon fera partie de la catégorie "non-interprétable".
- l'étape 8 est répétée 8 fois pour chaque échantillon non-invasif (au total: 72 génotypages/échantillon), afin
de minimiser le risque d'erreur dû à la faible quantité/qualité de l'ADN.
- lors de l'étape 9, une proportion non-négligeable des échantillons ne donnera pas de résultats interprétables
à cause de la mauvaise qualité de l'ADN dans les analyses non-invasives. Cette proportion est influencée
par le type d'échantillon, la dégradation qu'il a subi sur le terrain, la qualité du stockage, la quantité d'ADN
qui s'y trouvait, etc., et ne peut pas être déduite à l'avance.
- lors de l'étape 10, les profils ADN sont comparés à une base de données afin d'identifier les nouveaux
individus ou les individus déjà détectés auparavant.
• Délais
Il est difficile de fixer des délais très précis avec des échantillons non-invasifs, car plusieurs facteurs
imprévisibles entrent en jeu lors des analyses, notamment des problèmes techniques liés à la mauvaise
qualité des échantillons. De plus, certains appareils particulièrement onéreux sont en commun avec d'autres
groupes de recherche de l'Université. Ainsi, l'accès à ces derniers dépend de leur utilisation par des dizaines
d'autres personnes, ce qui peut engendrer un certain retard.
En ligne générale, depuis la prise en charge des échantillons par le laboratoire il faut compter jusqu'à deux
semaines pour les résultats concernant le séquençage de l'ADN mitochondrial et jusqu'à 3 semaines
supplémentaires pour le génotypage microsatellite.
En cas de problèmes techniques inattendus (par exemple panne d'un appareil), nous informerons si des délais
supplémentaires sont à prévoir.
-4-• Echantillonnage sur le terrain et stockage
La récolte des échantillons destinés à une analyse génétique peut être effectuée par des personnes n'ayant pas
suivi de formation particulière. Néanmoins, il s'agit d'une étape cruciale pouvant limiter ou parfois même
empêcher les études génétiques futures. En ligne générale, afin d'éviter toute contamination entre
échantillons et avec de l'ADN humain, il est important de travailler avec des des mains et du matériel propres
(par ex. scalpel propre, à usage unique ou stérilisé à la flamme, et exempt de traces appartenant à un autre
individu) et de déposer les échantillons individuellement dans des tubes ou sachets étiquetés. Pour éviter la
dégradation des échantillons, le stockage doit s'effectuer le plus rapidement possible après l'échantillonnage.
Pour l'exemple particulier du loup, nous conseillons les techniques suivantes:
- crottes: déposer une petite portion de la crotte dans un tube en la recouvrant complètement d'alcool 100% et
bien refermer le couvercle pour éviter des fuites. Ce prélèvement sera destiné aux analyses génétiques. Le
reste de la crotte sera déposé dans un sachet, et sera utilisé pour les analyses du régime alimentaire (J.-M.
Weber). Les deux prélèvements doivent être étiquetés et envoyés à: Jean-Marc Weber, Sablons 30, 2000
Neuchâtel. Il est indispensable d'utiliser uniquement de l'alcool pur (éthanol ou alcool éthylique), et de ne
pas employer de l'alcool dénaturé (comme par ex. l'alcool à brûler). Idéalement, il faudrait préparer un
stock de tubes avec l'alcool avant de partir sur le terrain. Nous conseillons les tubes suivants: Flacons de
comptage Roth, type Vial en LDPE, 20 ml. Peuvent être commandés à l'adresse www.carlroth.ch (article
nr. 0794.1).
- écouvillons (coton-tiges): frotter l'écouvillon autour des blessures des proies, en choisissant des blessures
propres (peu ou pas de sang de la proie) afin de récolter l'éventuelle salive du prédateur. Utiliser un
écouvillon par blessure. Déposer ensuite l'écouvillon dans un carton ou une enveloppe en papier, au sec et à
température ambiante. Nous conseillons les écouvillons utilisés en routine par la police.
- poils: vérifier que les poils ont la racine (bulbe), un poil coupé sans racine ne possède pas d'ADN. Déposer
les poils dans une enveloppe en papier, au sec et à température ambiante.
- urine dans la neige: prélever la partie de la neige qui contient l'urine, la déposer dans un tube avec
couvercle, et la conserver au congélateur.
- tissus: déposer quelques cm3 de tissu dans un tube et les recouvrir d'alcool 70-100%. Conserver à
température ambiante ou au frigo.
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