LA SPERMOCULTURE J. Raymond Service de Bactériologie Pr Poyart GH Cochin Saint Vincent de Paul Novembre 2013
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LA SPERMOCULTURE
J. Raymond
Service de Bactériologie Pr Poyart
GH Cochin Saint Vincent de Paul
Novembre 2013
Indications
Le diagnostic d'une infection génitale haute,
pouvant être responsable d'une hypofertilité ou
d'une infertilité masculine.
Le contrôle de la qualité du sperme à chaque
recueil de sperme dans le cadre de l'AMP avec don
de sperme (IAD, FIV)
Physiopathologie de l’infection du
tractus génital masculin
• Sperme peut être infecté à tous les stades de sa formation
• L’ensemble de ses constituants (cellules, spz, plasma séminal) peut
véhiculer des particules infectantes ou des antigènes bactériens
• Contamination:
– exogène par voie ascendante lors du rapport sexuel: agents IST,
SGB, Gardnerella, Anaérobies..)
– endogène cutanéomuqueuse, entérique exceptionnellement
hématogène (coliformes, Haemophilus, Ureaplasma,
staphylocoques)
• Colonisation microbienne: fonction de la virulence du germe, la
charge microbienne, le système lymphocytaire immunocompétent
Principales infections génitales
chez l’homme
• Urétrite: 121/100 000 hommes (réseau sentinelle 2009)
• Orchi-épididymite: inflammation aiguë de l’épididyme et des
testicules
• Prostatite: inflammation aiguë ou chronique d’origine bactérienne
de la glande prostatique
• (Ulcérations génitales)
Cause rare d’hypofertilité (
Etude du microbiote séminale
Pas de différence
entre homme normal ou
infertile
sauf la présence
d’Anaeroccus
plus fréquente chez
l’homme infertile
Hou D, Fertility and Sterility, 2013
Germes responsables
• Agents de transmission vénérienne:
– Neisseria gonorrhoeae
– Chlamydia trachomatis
– Trichomonas vaginalis
– Mycoplasmes urogénitaux:
• Ureaplasma urealyticum ++++
• Mycoplasma hominis
• Mycoplasma genitalium
• Germes « banals »
Pouvoir pathogène des Mycoplames urogénitaux - Responsabilité difficile à affirmer car appartiennent à la flore commensale: 50% des ♀ possèdent Uu dans leur flore, ≤10% pour Mh => uréthrites non gonococciques (Uu: 15 à 20 % des uréthrites masculines) => Infections gynécologiques hautes (salpingites, bartholinite) (Mh) => Rôle dans la vaginose bactérienne => grossesse: chorioamniotites, endométrites, fièvres du post-partum => INN: pneumonies, septicémies, méningites (NN très hypotrophiques) => Rôle dans l’infertilité masculine?
U. Urealyticum et M. hominis
- Significativement plus de Uu chez les hommes infertiles
- Concordance entre l’homme et la femme pour Uu chez les
couples infertiles (32%) vs 12% chez les fertiles
Ly JS, Infertility, 2013
Mycoplasma genitalium
• Cause émergente d’infections sexuellement transmissibles
• Responsable d’urétrites aigües et chroniques chez l’ homme svt
asymptomatiques
• Données discordantes chez la femme (urétrite, cervicite, salpingite)
• Associé au VIH
• A rechercher devant la persistance de symptômes ou après échec
de traitement
• Diagnostic par culture ou sérologie impossible
Intérêt des NAAT
Manhart et al, 2011, Walker et al, 2011
Epidémiologie • Gonocoque : réseau RENAGO • Chlamydiae : réseau RENACHLA
Rapport 2010 des centres de dépistage des IST
Résultats - Epidémiologie 2012
• Cochin • Réseau Rénago 2012
– 129 infections à gonocoque – 2826 cas déclarés
– Ratio H/F: 65/45= 1.4 – Ratio H/F: 2,2
– Etendue: 14-54 ans
– Age médian: 23 ans
– Age moyen: 25 ans
Urgences
Urgences CCH; obstétrique; 4
4
Autres
;9
Centre de tri; 5
UCSA; 8
Urgences HD;
13 Tarnier; 58
Espace Santé
Jeunes; 28
Service d’origine des cas positifsRésistance aux antibiotiques
Molécule S I R
Pénicilline G 26% 61,5% 12,5%
Céfixime 97% 3%
Ceftriaxone 100%
Ciprofloxacine 59,6% 0,3% 40,1%
Spectinomycine 100%
• 1093 souches
• ↑ progressive des CMI vis-à-vis des C3G depuis 2008
(céfixime++)
• Ceftriaxone:
– CMI ≥0,023: 2% début années 2000
– >15% en 2012Chlamydiae: prévalence globale en France : 1.5%
3% parmi les 18-24 ansParticularités cliniques
• C. trachomatis:
50-60% des urétrites post gonococciques ou non gonococciques
Incubation: 7-21 jours
– Urétrite subaiguë alternant de phases d’accalmies et de phases de
recrudescence
– Ecoulement peu abondant, intermittent voir uniquement matinale
– 3-10% urétrite aiguë
– 50% formes asymptomatiques
– Complication: épididymite
Bébéar CMI 2009
• N. gonorrhoeae:
Incubation: 4-6j
– Urétrite aiguë: 90% des cas
– 6% porteurs asymptomatiques
• Dans 15 -25% des cas ces bactéries sont associéesComplications
Contamination par voie ascendante
• Prostatites
• Epididymites
• Rétrécissement urétéraux (rare)
• Diffusion hématogène pour le gonocoque possibleRôle de C. trachomatis dans l’infertilité
Très controversé
• Etudes in vivo: difficultés dans l’interprétation des
résultats:
(techniques de mesure de la qualité du sperme, analyse du
sperme par rapport à l’infection, infection en cours ou tardive,
taille des populations, méthode de détection de C. trachomatis.)
• Etudes in vitro:
effet direct de C. trachomatis : adhère aux spz, pénètre dans la
tête, peut diminuer leur mobilité et conduire à une mort
prématurée (effet spermicide du LPS relargué, radicaux libres)
• FIV: La présence de C. trachomatis n’a pas d’impact sur le taux
de réussite de FIV
Eley et al 2005 Infection the lancet; De Barbeyrac, Eur J Ostet Gynecol reprod iol 2006Autres agents responsables d’IST
• U. urealyticum:
10-20% des urétrites post gonococciques ou non gonococciques
– Urétrite subaiguë
• T. vaginalis:
5-15% des urétrites non gonococciques
– Urétrite aiguë
• Mycoplasma genitalium (1980)
– Urétrite non gonococcique (UNG) aigüe +++
– Epididymite, Prostatite
– Infertilité
– Arthrite réactionnelleAutres germes: rôle??? • Candida albicans Urétrite d’évolution subaiguë Balanites • Pyogènes non gonococciques (Streptocoque B, S. aureus, P. aeruginosa…) Surinfection chez des patients atteints d’urétrites récidivantes, chroniques , mal traitées Symptomatologie peu bruyante • G. vaginalis rôle pathogène chez l’homme? • Corynebacterium seminale? Urétrite, prostatite (Riegel et al. 1995)
Impact des infections sur la stérilité
masculine
• Peu de données dans la littérature et controverses
• Stérilités excrétoires avec secondairement azoospermie ou
oligospermie par obstruction
– C. trachomatis: azoospermie obstructive
• Stérilités sécrétoires (fonctionnelles et transitoires):
– Impact direct du germe sur les spermatozoïdes
C. trachomatis
Boursouflure de la tête du spermatozoïde par UU
Atteinte de la mobilité par E. coli
Altérations cellulaires et kinétiques du spz par N. gonorrheae
– Impact de la réaction inflammatoire (leucocytes et anticorps)
Nécrospermie
Keck et al. Human Reproduction Update 1998Interactions bactéries-spermatozoïdes
Conséquences de l’infection • L’infection aiguë s’accompagne inconstamment d’une leucospermie (émission de radicaux libres) • L’infection chronique: rôle des cytokines entraînant une inflammation chronique responsable de fibrose affectant l’excrétion du sperme et souvent asymptomatique
La spermoculture
Importance de différencier
colonisation, contamination et infectionRéglementation
Arrêté du 11 avril 2008 relatif aux règles de bonnes pratiques
cliniques et biologiques en AMP
Moins de 6mois
Nomenclature:
Numération par unité de volume des espèces bactériennes dont les mycoplasmes
(B90)
Autres recherches dont Chlamydia trachomatis sur demande explicite et cotées
en susPrélèvement (1)
Nécessité de disposer de salle de recueil adaptée
avec affichage des procédures d'hygiène
Sperme frais
• Il doit être réalisé classiquement après miction suivie d'une
désinfection soignée des mains, des ongles, du pénis et du
gland à l'aide d'un antiseptique (Dakin) et rinçage. Recueil
direct dans un pot stérile.
Recommandations orales (Boucher et al Fertil Steril 1995)
• Une quantité minimale de 0,5 ml de sperme est adressée au
Service de Bactériologie.
• Il doit être acheminé le plus rapidement possible au
laboratoire pour 2 raisons:
– Fragilité de certains germes à température ambiante
(NG) et à la dessication (Mycoplasmes: utilisation d'un
milieu de transport saccharose phosphate).
– Activité bactéricide propre du spermePrélèvement (2)
Sperme congelé
• Le sperme est conservé dans des paillettes d'une contenance
de 0,2 ml chacune. Le sperme y est associé au demi à un
milieu de conservation (ne contenant plus d'antibiotique)
• Pour une étude bactériologique standard, il faut 2 paillettes.
Si l'on souhaite une recherche complémentaire (Chlamydia),
un minimum de 3 paillettes est nécessaire.Examen direct
Avant homogénéisation du sperme, effectuer :
• Recherche de Trichomonas à l'état frais
• Deux frottis (lames) séchés à l’air ambiant pour coloration
de GRAM et de MGG avec recherche respectivement de
Germes et de PNN.
• Numération semi-quantitativeCulture
Homogénéiser le sperme au vortex à 2000 tours/min
Effectuer 2 dilutions du sperme dans du sérum physiologique:
Dilution au 1/2 Dilution au 1/10
(sauf pour les paillettes)
ensemencer 0,1 ml au râteau : ensemencer 0,1 ml au râteau:
- > numération des germes
-> recherche de gonocoque, levure
classiques
nb de colonies x 20 = CFU/ml nb de colonies x 100 = CFU/ml
Si absence de colonies, rendre
inférieur 20 UFC/ml. GS sous CO2
GS, chocolat sous CO2
Chocolat en anérobieRecherches complémentaires (1)
Mycoplasmes
• Un milieu biochimique liquide permettant une numération
Ensemencer 2 gouttes de sperme dans le milieu de
suspension Mycoplasma Duo (Sanofi Diagnostics Pasteur).
• L'identification repose sur l'hydrolyse spécifique de l'urée pour
U.U et de celle de l'arginine pour M.H. Faux positifs: spermes
trop alcalins (PH normal : 7.2-7.8), contamination bactérienne
bactéries urée + et ADH + (rare du fait de l'additif d'ATB dans
le milieu )
• Acidification non spécifique du milieu : sécrétion
essentiellement prostatique
• Alcalinisation du milieu: sécrétion des vésicules séminalesInterprétation
-Mise en évidence de Uu ou Mh à partir de prélèvements stériles est
significative
- A partir de prélèvements où ces espèces appartiennent à la flore
commensale
=> Nécessité d’une quantification
Ureaplasma urealyticum
- PU, PV ≥ 104 UCC/mL (Unité Changeant Couleur)
- urine, sperme, AB ≥ 103 UCC/mL
Mycoplasma hominis
- ≥ 104 UCC/mLM. hominis: résistance naturelle
à l’érythromycine
U. urealyticum: résistance naturelle
à la lincomycineRecherches complémentaires (2)
Chlamydiae
Technique de biologie moléculaire
Réalisé sur le premier jet d’urine à Cochin
• PCR / Amplicor Roche :
– amplification d'une séquence de 207 pb contenue dans le
plasmide cryptique commun à tous les sérotypes de C.
trachomatis (+ standard interne)
– automatisable sur Cobas Taqman
• TMA / Gen-Probe BioMerieux:
– amplification de l'ARNr technique manuelle
• LCR: LCx Abbot
– amplification de la sondeInterprétation des résultats
Germes de la flore urètrale normale et protectrice
• SCN (notamment S.epidermidis) entérocoque
• streptocoques -hémolytiques
• corynébactéries.
Toutefois si l'un de ces germes est retrouvé en grande
quantité dans le prélèvement, il peut être incriminé:
Identification et antibiogramme si ≥ 104 CFU/ml
Germes de la flore digestive ≥ 103 UFC/ml
Les germes de la flore digestive peuvent souiller un prélèvement
de sperme ou être à l'origine d'une infection génitale haute:
Entérobactéries, Streptocoques ß hémolytiques A, B, C, D, F, G,
Entérocoques, Staphylococcus aureus, Haemophilus, Anaérobies,
Gardnerella vaginalis, Pseudomonas, Acinetobacter, Levures, etc
Monomorphe ou nettement prédominant
(pathogénicité?)Agents responsables de MST: pas de seuil
N. gonorrhoeae
C. trachomatisCulture monomicrobienne ou nettement
dominante à germe pyogène
Identification et antibiogramme si ≥ 103 CFU/ml
-P. aeruginosa
-Entérobactéries
-Enterococcus faecalis
-Streptococcus milleri
-Gardnerella vaginalis
-Corynebacterium
seminale ou
glucurolyticumCulture polymicrobienne
Recueil mal effectué
Contrôle nécéssaireSpermocultures 2010
• Période 01/01/2010 – 30/11/2010
• Total: 1490 patients
• (1759 prélèvements)
• Culture négative: 391(26.5%)
• Culture positive sans flore associée: 67 (4.5%)
– dont 3 avec 2 germes
– dont 5 SGB à 102 / mL
• Culture positive avec flore: 1032 (69%)
– Contamination probable: 947 (63.5%)
• Dont 22 avec un germe rendu (50% SGB)
– Flore avec germe(s) prédominant(s): 85 (5.5%)
• Dont 4 avec 2 germes
• culture significative, monomicrobienne ou polymicrobienne avec
prédominance d’un germe: 9.5% (140/1490)Bactéries isolées 2010
une seule bactérie
GV SGB CS EC ENT S EF SGG PN HPI
Monomi 9 22 3 8 8 5 4 4 1 0
Prédomin
ance 29 14 18 7 4 4 1 0 1 2
Total 38 36 21 15 12 9 5 4 2 2Données Cochin 2010
1) PCR multiplex :
3272 échantillons
Co-infection: 1.2%
Prevalence (%) Global Women Men STIs Consultations Reproductive Biology
(n=3272) (n=1591) (n=1681) (n=2019) (n=943)
C.trachomatis 6.7 8.5 5 9.2 1.5
N.gonorrhoeae 2 1.9 2 2.9 0
M.genitalium 2.5 2.8 2.3 3.2 1.4
2) Culture : M. hominis: 1% ; U. urealyticum: 11%
J. Loubinoux, Ricai 2012Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrheae
30
Males
90
Females
80 25
20
70
20 13
60
19
Number
Number
50 15
40
63 10 8
30
1
45 14
20
15 5 4
2 11
10 6 6 4
10 10 10 3 3 1
7 7
0 1 0 1
14-15 16-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-79 13-15 16-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-70
Age (years) Age (years)
35
Prévalence selon l’âge
30
5
25
et le sexe 20
Number
15
24 5
10 9
5 9 9 7
4 5 3
0 1 1
14-15 16-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-62
Age (years)
J. Loubinoux, Ricai 2012 Mycoplasma genitalium53 patients:
39 avec infections
14 sans infections
Population contrôle: 30
E. coli, U. urealyticum et S.
aureus altèrent la qualité
du spermePas de corrélation Bactériospermie et leucospermie 199 patients bactériospermie: 31% leucospermie Rôle des streptocoques et entérocoques sur l’altération des spz
56 patients
Bacteriospermie: Seuil > 103 bactéries/ml Leucospermie: seuil: >106 /ml
35% 61%
- Ureaplasma:18%
- Enterococcus: 14%
- Staphylococcus: 16%
Bactériospermie et leucospermie
- Bacteroides:7%
sont 2 paramètres indépendants
- E. coli: 4,5% Pas d’impact sur les paramètres du
- Streptococcus: 4,5% sperme
- Prevotella: 4,5%
Pas de corrélation entre bactériospermie et
paramètres sériques inflammatoires (CRP, PSA)
Fertil Steril. 2006:86:601-5• 600 spermes chez 543 patients asymptomatiques
consultant pour infertilité
• Pas de corrélation avec
leucocytospermie et la bactériospermie
• Variation dans le temps: processus de
colonisation dynamique
• Nécessité de contrôler avant traitement
Andrologia 2005• Prévalence de C. trachomatis en Tunisie: 43% des
hommes consultant pour infertilité
(asymptomatiques)
• Pas d’effet de C. trachomatis, M. hominis, M.
genitalium, U. urealyticum et U. parvum sur les
paramètres du sperme
Gdoura et al J. andrology 2008The presence of bacteria species in semen and sperm
quality
Elena Moretti & Serena Capitani & Natale Figura & Andrea Pammolli & Maria Grazia Federico &
Valentina Giannerini & Giulia Collodel
J Assist Reprod Genet (2009) 26:47–56
• 246 patients infectés:
– Diminution de la concentration et de la mobilité (vs contrôles)
– E.coli, S. anginosus associés une nécrose
– Pas d’influence de SGB, U. urealyticum sur la qualité du sperme
Mise en évidence de possible réaction croisée entre la tubuline des
spermatozoides et les pili des bactéries entrainant une
diminution de la qualité des spermatozoides
• Kumar V (International J of Urology, 2011)
Interaction E. coli et Spz par l’intermédiaire du SIF « Sperm
immobilization factor) in vitroInfluence de la prostatite bactérienne chronique
Chang Y, Scientific reports, 2014
Méta-analyse: La PBC diminue le vitalité et la mobilité des spz,
mais pas le volume, ni la concentrationConclusion
Critères d’infection (OMS, 1992)
• leucocytospermie ≥ 106/ml discutable
• bactériospermie ≥ 103/ml
• détection de N. gonorrhoeae, C. trachomatis, U.
urealyticum
MAIS interprétation délicate pour tous les autres
Collaboration clinico-biologique essentielle +++
Ne pas poser un diagnostic d’infection du sperme trop
rapidement pour éviter des traitements antibiotiques
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