Modèles in vitro et précliniques pour l'étude des effets des prébiotiques et des probiotiques sur la santé humaine et animale - UMR ...

Modèles in vitro et précliniques pour l'étude des effets
 des prébiotiques et des probiotiques sur la santé
 humaine et animale

 Benoit Cudennec

 UMR transfontalière INRAe 1158 - BioEcoAgro
 Institut Charles Viollette
 Université de Lille
 1

INTRODUCTION UMR transfontalière INRAe 1158 - BioEcoAgro

 Création de l’ICV UMR transfontalière BioEcoAgro
 2015 2020

 Pôle 1 Pôle 2 Pôle 3
 Systèmes de culture Biomolécules d’origines Formulation, qualité et sécurité
 innovants pour la végétale et microbienne: des aliments
 transition dans le contexte de l’identification à la Nutrition-Santé
 du changement climatique bioproduction

 2

INTRODUCTION UMR transfontalière INRAe 1158 - BioEcoAgro
 Nadia
 Everaert

 Rozenn
 Ravallec

 ● Plateau technique bioactivités ● Ferme expérimentale

 ● Plateforme PHExMAR

 3

INTRODUCTION Contexte global – One health

Modèle de digestion statique in vitro Biosystème intégré
INFOGEST Protocole in vitro de digestion statique
Brodkorb et al. Nature Protocols (2019): 991-1014.

 Oral phase
 salivary fluid
 amylase (75 U/mL)
 2 min, 37°C, pH 7

 Gastric phase
 Oral bolus with gastic fluid
 pepsin, gastric lipase
 2h, 37°C, pH 3

 Intestinal phase
 gastic chyme and intestinal fluid
 pancreatin
 2h, 37°C, pH 7

 Barrière intestinale (BI)
 (Caco-2/HT29-MTX)

 ● Adaptabilité du protocole
 Enfant, personne âgée
 Animaux (chien, porc…)
 Physiopathologies (inflammation intestinale) 5

Modèle de digestion statique in vitro Probiotiques et absorption intestinale du calcium
INFOGEST Protocole in vitro de digestion statique ● Survie des souches à la digestion GI ● Transport du calcium
Brodkorb et al. Nature Protocols (2019): 991-1014. 12

 a a a
 Intracellulaire
 Oral phase a a a a a

 Log (CFU.mL-1)
 b b b
 salivary fluid b b bb bb b 1.6
 L. plantarum 46a** 1.6
 L. fermentum 48a*
 ab

 Fluorescence emission
 8
 amylase (75 U/mL)
 b b
 2 min, 37°C, pH 7 c 1.4 1.4

 (EMt/EMt0-9s)
 1.2 1.2
 4
 Gastric phase 1.0 1.0
 Oral bolus with gastic fluid
 0 10 20 30 0 10 20 30
 pepsin, gastric lipase 0
 2h, 37°C, pH 3 Time (s)

 b

 he tum a

 ck d

 b

 b
 de icu a

 a
 en b

 46

 48

 56
 15

 49

 r u i 50

 62
 9
 ei

 rm kii
 m
 s

 s

 m
 i
 no as

 u

 tu
 Intestinal phase

 c
 c

 r

 e
 e
 L. aci

 en

 en
 L. nta
 Au travers de la BI

 L. vet

 ru
 L.

 rm
 f

 lb
 lb
 a
 gastic chyme and intestinal fluid

 l
 pl

 de
 fe

 fe
 a
 pancreatin 1.2

 L.
 fir

 L.
 L.
 ke
 2h, 37°C, pH 7
 ***

 L.
 **

 Basal side calcium

 (fold of t=30 min)
 **

 concentration
 ● RT-qPCR 1.1
 *

 1.0

 Barrière intestinale (BI)
 0.9
 (Caco-2/HT29-MTX)

 d
 b

 6a

 0b
 a
 S

 9b

 48

 49
 15
 PB

 rm m 4

 i5
 ei

 m

 us
 s

 ki
 as

 n

 u

 tu

 ec
 tic
 ie
 c

 ar

 en
 c

 ru
 L.

 e
 t
 fa

 an

 lv

 lb
 no

 he
 pl

 de
 fe
 a

 L.

 L.
 fir

 L.

 L.
 ke
 ● Caractérisation des souches probiotiques

 L.
 Survie
 Cytotoxicité
 Adhésion Raveschot, et al. « Probiotic Lactobacillus Strains from Mongolia Improve Calcium Transport and 6
 Uptake by Intestinal Cells in Vitro ». Food Research International 133 (2020): 109201

Modèle de digestion statique in vitro Hormones intestinales

 Oral phase
 salivary fluid
 amylase (75 U/mL)
 2 min, 37°C, pH 7

 Gastric phase
 Oral bolus with gastic fluid
 pepsin, gastric lipase
 2h, 37°C, pH 3

 Intestinal phase
 gastic chyme and intestinal fluid
 pancreatin
 2h, 37°C, pH 7

 Barrière intestinale
 Modifié d’après Duca, et al. Nature Communications (2021):
 Cellules épithéliales
 (Caco-2/HT29-MTX)
 Cholecystokinines (CCK)
 Induction de la satiété:
 Cellules Augmentation des secrétions gastriques, diminution de la vidange
 entérodendocrines gastrique, voies vagales afférentes (CCK1R)
 EEC (lignée STC-1)
 Glucagon-like Peptide 1 (GLP-1)
 ● Sécrétion des hormones intestinales Induction de la satiété par ralentissement de la vidange gastrique, GLP1R
 Cholecystokinines (CCK) (cerveau)
 Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) Incrétine: Stimule la sécrétion d’insuline glucose-dépendante par les cellules
 7
 Peptide insulinotrope dépendant du glucose (GIP) bêta pancréatiques

Modèle de digestion statique in vitro Probiotiques inflammation et métabolisme
 1600
 A. IL-10

 ● Inflammation
 a

 1200

 Oral phase ab

 salivary fluid 800

 amylase (75 U/mL) Col 10
 bc

 2 min, 37°C, pH 7 400

 c c c
 c

 pg.mL-1
 0
 160

 ● métabolisme
 B. IL-12
 Gastric phase a

 Oral bolus with gastic fluid 120

 8
 pepsin, gastric lipase A
 2h, 37°C, pH 3 *a
 *a
 80

 active GLP-1, fold induction
 6 *a
 40

 Intestinal phase *b
 b b b b b b

 gastic chyme and intestinal fluid 4
 *b *a 0
 ol s 96 95 92 G
 ntr ng
 um
 la cti B3 B3 B3 3R
 pancreatin *ab
 *b
 *a Co
 B.
 lo L. ICV ICV ICV
 *c *c
 2h, 37°C, pH 7 b
 2

 0 180
 Control
 2,5 H2O2 a
 B
 Barrière intestinale
 ICVB392
 *a 160 ICVB395 a
 ICVB396
 2,0 a a
 Cellules épithéliales a
 *a
 *a

 140
 3RG
 a
 a

 TEER (% of T0)
 CCK, fold induction
 *a *a

 (Caco-2/HT29-MTX)
 ab
 *a *a ab
 1,5 ab ab
 ab ab
 b b 120
 b bc
 b abc
 1,0 c bc ab
 100 b

 Cellules bc bc
 b c
 bc
 c
 0,5
 entérodendocrines 80 bc

 EEC (lignée STC-1) 0,0 60
 Control IVCB392 ICVB395 ICVB396 3RG 0 20 40 60 80 100 120 140

 Time (min)

 ● Sécrétion des hormones intestinales ● Renforcement de la barrière intestinale
 Cholecystokinines (CCK) Belguesmia, et al. « In vitro probiotic properties of selected lactobacilli and multi-strain consortium on immune
 Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) function, gut barrier strengthening and gut hormone secretion ». 8
 Peptide insulinotrope dépendant du glucose (GIP) Journal of Functional Foods 57 (2019): 382-91.

Modèle cellulaire STC-1 Screening pour études in vivo
 ● in vitro

 9

Modèle cellulaire STC-1 Screening pour études in vivo
 ● in vitro ● in vivo

 Alard, et al. « Multiple Selection Criteria for Probiotic Strains with High Potential for Obesity Management ».
 Nutrients 13, no 3 (2021): 713.
 Dr. Corinne Grangette
 10
 U1019—UMR 9017—CIIL—Centre d’Infection et d’Immunité de Lille, Institut Pasteur de Lille

Modèle cellulaire STC-1 In vivo / in vitro
Laits maternisés PL: Lipides d’origine végétale
 DL: Lipides d’origines laitière et
 végétale (50/50)
 DL+LF: DL supplémenté
 avec Lactobacillus fermentum

 Porcelet Yucatan

 Prélèvements contenus
 intestinaux

 Cellules
 entérodendocrines
 (STC-1)

 GLP-1

 11

Modèle cellulaire STC-1 In vivo / in vitro
Laits maternisés PL: Lipides d’origine végétale
 ● in vivo
 DL: Lipides d’origines laitière et ● in vitro
 végétale (50/50)
 DL+LF: DL supplémenté
 avec Lactobacillus fermentum

 Porcelet Yucatan

 Prélèvements contenus
 intestinaux

 Cellules
 entérodendocrines
 (STC-1)

 Lemaire, et al. « Addition of Dairy Lipids and Probiotic Lactobacillus Fermentum in Infant Formulas Modulates
 GLP-1 Proteolysis and Lipolysis With Moderate Consequences on Gut Physiology and Metabolism in Yucatan Piglets ».
 Frontiers in Nutrition 8 (2021).
 Dr. Isabelle Le Huërou-Luron
 12
 Institut NuMeCan, INRAe, INSERM, Univ Rennes, St-Gilles

Effets des prébiotiques In vitro / in vivo

 ● Stimulation de la sécrétion ● Analyse métagénomique
 des hormones intestinales

 chicorée
racines torréfiées

 ● Contenus en métabolites (ACP)

 Fouré, et al. « Chicory Roots for Prebiotics and Appetite Regulation: A Pilot Study in Mice ». 13
 Journal of Agricultural and Food Chemistry 66, no 25 (2018): 6439-49.

Effets des prébiotiques In vivo
 ● Expression génique (biopuces à ADN)

 ● Abondance relative des phylums bactériens

 Farines de chicorée

 ● Dosage des hormones circulantes

 Pouille, et al. « Chicory Root Flour – A Functional Food with Potential Multiple Health Benefits 14
 Evaluated in a Mice Model ». Journal of Functional Foods 74 (2020)

Probiotiques et prébiotiques in vitro Biosystème intégré / modèle d’inflammation intestinale

 Oral phase
 salivary fluid Prélèvement
 amylase (75 U/mL) apical
 2 min, 37°C, pH 7
 Activité pro et anti-
 inflammatoire
 Gastric phase - IL10
 Oral bolus with gastic fluid - TNF- 
 pepsin, gastric lipase
 Non stimulé (NS)
 - IL1- 
 2h, 37°C, pH 3 - IL8

 Intestinal phase
 gastic chyme and intestinal fluid
 pancreatin Prélèvement
 2h, 37°C, pH 7
 basolatéral
 Activité anti-oxydante
 - MDA
 Intégrité de barrière
 Stimulé (S) Prélèvement - RT-qPCR
 Apical: Exposition au LPS du « tissus » (jonctions serrées)
 du côté apical - TEER pendant le contact
 Barrière intestinale:
 (Caco-2/HT29-MTX)
 Basolatéral:
 Macrophage
 (U937)
 ● Inflammation intestinale in vitro

 15

in vivo Gembloux ferme expérimentale
● Alimentation et stratégies nutritionnelles
 ● Modulation du microbiote intestinal ● Propriétés du chymes
 Analyse du microbiote (qPCR, 16S sequencing) Viscosité pH

 ● Modulation des acides gras à chaines ● Perméabilité intestinale
 courtes (SCFA) et des métabolites In vivo et ex vivo
 intermédiaires (chambres de Ussing)
 SCFA (HPLC), et metabolomics (LC-MS and
 Prélèvements GC-MS)
 ● Renforcement de la barrière
 ● Réduction de l’inflammation intestinale intestinale
 Morphologie intestinale (hauteur des Cibles de l’inflammation Intestinale
 microvillosité, profondeur des cryptes) (ELISA + High Throughput PCR,
 RNA-seq)

 Porcelets (24 box)

 16
Dufourny, et al. « Apple Pomace and Performance, Intestinal Morphology and Microbiota of Weaned Piglets—A Weaning Strategy for Gut Health? » Microorganisms 9, no 3 (2021)

Modèle de digestion du porcelet in vitro Gembloux ferme expérimentale

Modèle in vitro simulant les 3 étapes de la digestion
gastrointestinale du porcelet

 Estomac et intestin
 Pepsine
 pancréatine

 Absorption intestinale
 Dialyse

 Fermentation colique
 Fèces inoculum + digestats +
 transporteur de mucines

 17

Modèle de digestion du porcelet in vitro Gembloux ferme expérimentale

 ● Production de gaz
Modèle in vitro simulant les 3 étapes de la digestion
gastrointestinale du porcelet

 Estomac et intestin
 Pepsine
 pancréatine

 ● Modulation de la production des SCFA
 Absorption intestinale
 Dialyse

 Fermentation colique
 Fèces inoculum + digestats +
 transporteur de mucines

 Uerlings, et al. « In Vitro Prebiotic Potential of Agricultural By-Products on Intestinal Fermentation, Gut
 Barrier and Inflammatory Status of Piglets ». British Journal of Nutrition (2020). 18

Probiotiques et prébiotiques in vivo Gembloux ferme expérimentale
 ● Microbiote séquençage 16s
Modèle in vitro simulant les 3 étapes de la digestion
gastrointestinale du porcelet

 Estomac et intestin
 Pepsine
 pancréatine

 Absorption intestinale
 Dialyse

 Inuline et racine de chicorée
 Fermentation colique
 Fèces inoculum + digestats +
 transporteur de mucines Bactéries
 productrices de
 butyrate

 Uerlings, et al. « In Vitro Prebiotic Potential of Agricultural By-Products on Intestinal Fermentation, Gut
 Barrier and Inflammatory Status of Piglets ». British Journal of Nutrition (2020). 19

Probiotiques et prébiotiques in vivo Gembloux ferme expérimentale
 ● RT-qPCR
Modèle in vitro simulant les 3 étapes de la digestion
gastrointestinale du porcelet

 Estomac et intestin Pulpe de chicorée
 Pepsine
 pancréatine
 Cellules épithéliales
 intestinales
 (lignée IPECJ2)
 Absorption intestinale
 Dialyse

 Fermentation colique
 Fèces inoculum + digestats +
 transporteur de mucines

 Uerlings, et al. « In Vitro Prebiotic Potential of Agricultural By-Products on Intestinal Fermentation, Gut
 Barrier and Inflammatory Status of Piglets ». British Journal of Nutrition (2020). 20

Conclusion et perspectives

 Valorisation des ressources et préservation de l’environnement et de la santé (One health)
 Importance de développer de nouveaux modèles in vitro (3R)
 Nécessité de valider ces modèles par des confrontations in vivo & clinique

 … Et les post-biotiques (Fermentation)
 - peptides bioactifs et autres polyphénols
 - molécules antagonistes (bactériocines)…

 21

Merci de votre attention!

 22