Modulation of anxiety by µ-opioid receptors of the lateral septal region in mice Julie Le Merrer , Barbara Cagniard , Pierre Cazala

Modulation of anxiety by µ-opioid receptors of the lateral
                  septal region in mice

    Julie Le Merrer , Barbara Cagniard , Pierre Cazala

Récepteurs opioïdes
   récepteurs µ: pour la morphine (agoniste partiel)
   récepteurs κ
   récepteurs δ

Ligands physiologiques = peptides opioïdes endogènes ou endomorphines

            Ce sont des petits peptides répartis en 3 familles:
                    les enképhalines
                    les endorphines
                    les dynorphines

Agoniste?     Substance qui se lie 1 récepteur et qui déclenche son activité

Antagoniste? Substance qui se lie 1 récepteur et qui bloque son activité

Pourquoi une telle étude?

~ morphine et agonistes des récepteur µ opioïdes injectés en périphérique =
anxiolitiques
~ antagonistes des récepteurs µ opioïdes injectés en périphérique = anxiogènes
~ action anxiolitique serait médiée par l’intéraction avec le système
GABAergique
~ Septum Latéral (LS):
        principalement constitué de neurones GABAergiques
        exprime les récepteurs GABA en grande quantité
        exprime les récepteurs µ opioïdes
Buts:
~ Examiner les effets comportementaux résultant d’une activation du système
opioïdergique dans le septum latéral (LS)
~ Elucider le rôle fonctionnel joué par les récepteurs opioïdes du LS dans la
modulation de l’anxiété

MATERIEL & METHODES

Animaux et stéréotaxie

      Souris ♂ de 14 à 18 semaines (28-32g)
      Anesthésie profonde en intra-péritonéale

 Système de contention de « Horsley-Clarke »

Composés utilisés

   Morphine ● diluée dans solution de Ringer
            ● Administration intracérébrale de 20 à 500 ng/100nl
   Naloxonazine = antagoniste des récepteurs µ opioïdes
                 À 100ng/100nl, administrée 25 min avant la morphine

Injections intraseptales

Minimiser les effets du stress: simulation d’injection pendant les 4 jours précédents les tests
Injections intraseptales 20min avant la session comportementale
Injection de 100nl

Tests comportementaux

 PLUS-MAZE
Différents paramètres mesurés:
  ~ nombre d’entrées dans chaque type de bras: ouverts
ou fermés
  ~ temps passé dans ces 2 types de bras
  ~ “activity ratio”= %age d’entrées dans les bras ouverts
  ~ “time ratio”= %age de temps passé dans les bras
ouverts

  4 HOLE BOARD

 Différents paramètres mesurés:
            ~ fréquence de “head-diping”
            ~ durée de “head-diping”
            ~ nombre de traversées des 4 cadrans

Immunohistochimie et histologie

  Vérification des sites d’injection

           ● par coloration au Crésyl-violet
         Contre coloration qui permet principalement l’identification des noyaux
         cellulaires (rouge-violet)

           ● immunomarquage Fos: immunomarquage? C-Fos?
~ Facteur de transcription qui va induire des réponses à long terme en modifiant au
niveau nucléaire l’expression de gènes cibles (changement des paramètres de
transcription des gènes à expression tardive)
~ Protéine codée par 1 gène à expression précoce immédiate, gène rapidement activé en
réponse à différents types de stimulations
~ Mise en évidence de cette protéine dans les noyaux des neurones, comme marqueur
d’activité neuronale
~ délai nécessaire pour observation de la protéine c-Fos après stimulation: expression de
l’ARNm c-Foc et expression de la protéine

Fig. 2. Photomicrographs of Fos immunostained coronal brain sections showing locations of the
cannula track and tip of the injection cannula (black arrows) Scale bar: 500 µm.

     Injection unilatérale dans le LS                      Injection unilatérale dans le MS

                                                   Injection bilatérale dans le LS

EFFET D’INJECTION UNILATERALE
                          DE MORPHINE DANS LE LS

Fig. 3. Effects of unilateral intra-LS injections of morphine (100 or 500 ng)
or vehicle (Ringer) on anxiety as measured in the elevated plus maze (8 min
total exploration session). Data represent means ± S.E.M. (n=8–11 per group).
*p

On observe un effet sur le nombre d’entrées
           dans les bras mais aussi un effet sur le type
           de bras: ouvert versus fermé ?????

                                     Dans chaque cas, les animaux vont
                                     plus dans les bras fermés.

                                      - Analyse séparée:

                                   la morphine - réduit le nombre d’entrées
                                   dans les bras ouverts
                                                - et ne diminue pas
                                   significativement le nombre d’entrées dans
                                   les bras fermés.

14
     9.5    7        2    1.3
                 8

- Analyse globale:

  Le traitement à la morphine n’affecte pas globalement
  le temps que les animaux passent dans les bras du plus-
  maze mais tous les animaux passent plus de temps dans
  les bras fermés.

- Analyse séparée:

   Injection de 100 ou 500 ng de morphine intra-LS
   diminue le temps passé dans les bras ouverts.

   Activity ratio: pourcentage d’entrées dans les bras
   ouverts.
               → Diminué comparé au controle

   Time ratio: pourcentage de temps passé dans les bras
   ouverts.
                → Pas de changement significatif

Fig. 3. Effects of unilateral intra-LS injections of morphine (100 or 500 ng) or vehicle (Ringer) on
anxiety as measured in the hole-board (6 min total exploration session) tasks. Data represent means ±
S.E.M. (n=8–11 per group). *p

EFFET DE PRE-INJECTION UNILATERALE
                          DE NALOXONAZINE DANS LE LS

NALOXONAZINE= antagoniste des récepteurs µ opioïdes

ANTAGONISTE= substance qui se lie à 1 récepteur et qui bloque son action

Fig. 4. Effects of pre-treatment with naloxonazine on the morphine-induced increase in anxiety as
measured in the elevated plus maze. All mice were injected unilaterally into the lateral septum and
received either vehicle (Ringer) or naloxonazine (100 ng) followed 25 min later by vehicle or morphine (100
ng). Data represent means±S.E.M. (n=8–11 per group). *p

- Analyse séparée:

La morphine, précédée d’1 injection saline, augmente le
temps passé dans les bras fermés tandis qu’elle diminue
le temps passé dans les bras ouverts: cet effet est
totalement réversé par 1 pré-injection de naloxonazine

     - Analyse séparée:

  ~ 
 de l’ »activity ratio » induite par la morphine
  (100ng) est réversée par pré-injection de 100ng de
  naloxonazine 25min avant la morphine.

  ~ “time ratio” 
 chez les animaux pré-traités avec
  solution saline mais pas avec la naloxonazine

Fig. 4. Effects of pre-treatment with naloxonazine on the morphine-induced increase in anxiety as
measured in the hole-board . All mice were injected unilaterally into the lateral septum and received
either vehicle (Ringer) or naloxonazine (100 ng) followed 25 min later by vehicle or morphine (100 ng). Data
represent means±S.E.M. (n=8–11 per group). *p

EFFET D’INJECTION DE MORPHINE DANS LE MS
Fig. 5. Effects of morphine injections into the MS on anxiety as measured (a) in
the elevated plus maze. Ringer was used as vehicle. Morphine was injected at doses
of 100 or 500 ng. Data are presented as means±S.E.M. (n=8–10 per group). *p

Fig. 5. Effects of morphine injections into the MS on anxiety as measured (b) hole-board
tasks. Ringer was used as vehicle. Morphine was injected at doses of 100 or 500 ng. Data are
presented as means±S.E.M. (n=8–10 per group). *p

EFFET D’INJECTION BILATERALE
                            DE MORPHINE DANS LE LS
Fig. 6. Effects of bilateral injections of morphine into the LS on anxiety as
measured in the elevated plus maze. Morphine was injected at doses from 20
ng to 500 ng. Ringer was used as vehicle. Data are presented as means±S.E.M.
(n=9–11 per group). *p

Fig. 6. Effects of bilateral injections of morphine into the LS on anxiety as
measured in the hole-board tasks. Morphine was injected at doses from 20
ng to 500 ng. Ringer was used as vehicle. Data are presented as means±S.E.M.
(n=9–11 per group). *p

EFFET D’INJECTION UNILATERALE
          DE MORPHINE DANS LE LS SUR L’EXPRESSION DE Fos

SEPTUM ET EFFERENCES:
                      the ventral part of the lateral septum

 Injection de solution de Ringer dans            Injection de morphine (500 ng) dans
       la partie dorsale de LS                          la partie dorsale de LS

                  Le niveau d’expression de Fos est plus faible chez les animaux
                  traités à la morphine que les animaux témoins

 Fig. 7. Photomicrographs of Fos immunoreactivity in coronal sections Scale bar: 100 µm.

SEPTUM ET EFFERENCES:

        Le niveau d’expression de Fos est plus faible chez les animaux
        traités à la morphine que les animaux témoins:

        Dans HDB: partie horizontale
                                       bande diagonale de Broca (efférence du LS)
        Dans VDB: partie ventrale

        Dans AH= noyau antérieur de l’hypothalamus          principales cibles de LSd
        Dans MPA= aire préoptique médiane de l’hypothalamus

HIPPOCAMPE:

               dorsal hippocampus (CA1 field)

Injection de solution de Ringer   Injection de morphine (500
 dans la partie dorsale de LS     ng) dans la partie dorsale de
                                               LS

   CA1 : le niveau d’expression de Fos est plus faible chez les animaux traités avec la
   plus forte dose de morphine

   CA3 et DG : l’expression de Fos est plus faible pour les deux doses de morphine

   Fig. 7. Photomicrographs of Fos immunoreactivity in coronal sections Scale bar: 100 µm.

TRACT MAMMILLOTHALAMIQUE:

expression de Fos augmentée:
Corps mammillaires (LM)
Partie dorsale du thalamus antérieur (AD)

STRUCTURES DOPAMINERGIQUES
ET AIRES DE PROJECTION:

expression de Fos augmentée:
Aire tegmentale ventrale (VTA)
Coquille du noyau accumbens
(AcbSh)=cible de VTA

expression de Fos diminuée:
Coeur du noyau accumbens (AcbC)

EFFET D’INJECTION UNILATERALE DE MORPHINE DANS LE LS
    Plus-maze:
             ● activité locomotrice
;
             ● entrées dans les bras ouverts sont massivement 
;
             ● activity ratio 


                    Augmentation de l’anxiété

    Hole-board:

              exploration (head-dipping) 
      Augmentation de l’anxiété

    Cependant: morphine 
 l’activité locomotrice dans ce test
                   Effet sédatif de la morphine ne peut pas être totalement éliminé

  EFFET D’INJECTION UNILATERALE DE MORPHINE DANS LE MS

                                             Effets anxiogènes observés seraient
Pas de comportement anxieux                  spécifique de cette subdivision
                                             septale: LSd

EFFET DE PRE-INJECTION UNILATERALE DE NALOXONAZINE DANS LE LS

         Naloxonazine est un antagoniste des récepteurs µ opioïdes
         Elle réverse les effets anxiogènes induits par l’injection de
         morphine dans le LS.

                Ces effets anxiogènes seraient médiés par les récepteurs µ opioïdes

        EFFET D’INJECTION BILATERALE DE MORPHINE DANS LE LS

Pas d’effets anxiogènes comme avec injection unilatérale

● 
 la fréquence de head-dipping mais pas de significativité.
● Injections bilatérales à hautes doses stimulent l’activité locomotrice ( du nombre de
croisements entre cadrans)
●injection bilatérale induit 1 forte expression de Fos
           dans le chemin mésolimbique (comme injection unilatérale)
          + le caude putamen et le cortex moteur

         Recrutement du chemin nigrostriatal dopaminergique → stimulation locomotrice