Laboratoire Expert BVD Travaux en cours et perspectives - Journée nationale de la référence professionnelle - Anses
←
→
Transcription du contenu de la page
Si votre navigateur ne rend pas la page correctement, lisez s'il vous plaît le contenu de la page ci-dessous
Laboratoire Expert BVD
Travaux en cours et perspectives
Journée nationale de la référence professionnelle
08 novembre 2018
Guy Kouokam
Ophélie Pécot
Avec le soutien
financier de la
1
Faits marquants année 2018
Organisation d’ EILA
But : évaluer l’aptitude des laboratoires à diagnostiquer correctement la BVD
Type d’EILA :
-PCR sur matrice biopsie auriculaire
-ELISA Antigénémie E0 sur matrice biopsie auriculaire
Nombre de laboratoires participants :
-PCR : 53
-ELISA Antigénémie E0 : 38
Analyse des résultats et rédaction des rapports en cours
Rendu des résultats : prévu pour ce mois de Novembre 2018
2
Faits marquants année 2018
Expertise
Validation de réactifs 2018 : vérification de la fiabilité des kits
Biopsie auriculaire
PCR : Virotype BVD/extraction MagAttract 96 cador Pathogen Kit
RealPCR BVDV RNA Test / extraction NucleoMag Vet
RealPCR BVDV RNA Test/ extraction IDEXX DNA/RNA Magnetic Bead Kit
LSI BVDV4all/Magmaxcore et LSI BVDV screening (sans protéinase K)
ELISA antigénémie E0 : lyse protocole long (72h à 25°C)
Autres activités
Analyses : 4 génotypages de virus BVDV réalisés (pour 1 GDS, 2 LDA)
Vente de matériaux de référence : 640 unités commercialisées
Cahier des charges pour validation des kits PCR et ELISA antigénémie sur sérum diffusé
Echantillothèque : Prélèvements reçus de 2 élevages
Prélèvements d’IPI reçus de 2 élevages
Caractérisation de l’échantillothèque (PCR, ELISA)
Valorisation scientifique :
Présentation d’un poster au 11ème congrès international de virologie vétérinaire
(génotypage de souches de BVDV isolées en France)
3
Faits marquants année 2018
Nouveaux matériaux de référence
Renouvellement de la biopsie auriculaire Ned biopsie auriculaire
Remplacement du premier NED ( car quantité limitante)
A destination des producteurs de réactifs et laboratoires départementaux
Sérum Ned (niveau exigible de détection) pour analyses de virologie (PCR et ELISA
antigénémie E0)
But : calage des kits de diagnostic PCR et ELISA Ag E0
Caractéristiques : mélange de sérums issus d’animaux infectés par différentes souches de
virus (BVDV-1b, BVDV-1d, BVDV-1e, BVDV-1k, BVDV-1l)
Utilisable pour validation des kits d’analyses de sérums individuels et de mélanges de 20
sérums (producteurs de réactifs)
Sérum Ned pour analyses de sérologie individuelle et de mélange :
But : validation d’analyses ELISA anticorps (individuelles et de mélange)
Caractéristiques : mélange de 4 sérums issus de bovins infectés par les virus BVBDV-1b
ou BVBDV-1e
Caractérisé avec un kit ELISA anticorps p80 et un kit ELISA anticorps E0
Caractérisé par trois méthodes de séroneutralisation
En cours de validation
4
Quelques méthodes utilisables dans le cadre
du programme d’éradication de la BVD
Matrice Mélange Prix Validé par le LE- Cadre d’utilisation
BVD
BA Oui(10) +++ oui
PCR sérum Oui (20) +++ oui
lait Oui +++ non dépistage des IPI
ELISA BA Non ++ oui
Ag E0 sérum Non ++ non (2019)
ELISA sérum Oui (20) + non (2019)
Anticorps Surveillance des
lait Oui (LT) + non (2019) cheptels
5
ETUDE N°1
Test de vieillissement des biopsies
auriculaires
6
Problématique
Biopsie auriculaire :
- Matrice utilisée pour le diagnostic
de la BVD (dépistage IPI, attribution
de garantie, contrôle de mouvement)
- Matrice prélevée par l’éleveur
et acheminée vers le laboratoire
- Problématique du délai
d’acheminement au laboratoire
(stockage prolongé chez l’éleveur,
Rapport
temps de transport jusqu’au laboratoire…) D’analyse
- Quel impact de ce délai sur la fiabilité
des résultats de PCR et ELISA antigénémie
- A partir de quel moment une biopsie ne peut
plus être analysée en PCR ou ELISA antigénémie ?
7Paramètres de l’étude
2 températures évaluées : 25°C (température ambiante hors période estivale)
37°C (pic de température en période estivale)
Origine des biopsies : 1 animal ayant été caractérisé avec un Ct faible (28-30) : MR80
2 animaux ayant été caractérisés avec des Ct moyens (~25) : D001, D004
1 animal sain : G002
Nombre de jours : J7, J11, J14, J18 J22, J32 et J40, J45, J60 (pour certaines BA)
Techniques utilisées :
PCR : 3 méthodes validées par LE-BVD
(couple extraction-PCR) : extraction sur colonne/PCR1 => kit A
extraction rapide/PCR2 => kit B
extraction sur bille/PCR3 => kit C
ELISA antigénémie E0
Finalité :
- Orientation pour les laboratoires de diagnostic qui utilisent la PCR et l’ELISA antigénémie sur
biopsies auriculaires pour le diagnostic BVD
- Sensibilisation pour les éleveurs impliqués dans l’envoi des échantillons de biopsies
8Vieillissement des biopsies auriculaires à 25°C- PCR
Kit A Kit B Kit C
biopsie 25°C 25°C 25°C
MR80 + + +
J0 D001 + + +
D004 + + +
MR80 + + +
J7 D001 + + + Efficacité
D004 + + + des 3 kits
MR80 + + +
J11 D001 + + +
D004 + + +
MR80 + + +
J18 D001 + + +
D004 + + +
MR80 + + -
J22 D001 + + + Divergence
D004 + + + de résultats
MR80 - + - des 3 kits
J32 D001 + + +
D004 + - +
A 25°C : Le dernier signal positif BVDV détecté l’est à 18j j pour les 3 biopsies avec les 3 kits
La valeur maximale de Ct obtenue à J18 : 32,02 (D004, kitB)
A 37°C : Le dernier signal positif BVDV détecté l’est à 14j j pour les 3 biopsies avec les 3 kits
La valeur maximale de Ct obtenue à 7j : 35,7 (D001, kitB) 9Résultats des analyses ELISA antigénémie E0
Kit ELISA Ag X-25°C Kit ELISA Ag X-37°C
7 7
% Densité optique
% Densité optique
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
Seuil de
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 positivité
D001 D004 MR80 D001 D004 MR80
Durée d’incubation (jours) Durée d’incubation (jours)
- Toutes les biopsies analysées sont positives jusqu’à 32j d’incubation à 37°et à 25°C
- Les biopsies moyennement chargées (D001 et D004) restent positives à J40, J45, J60
- Pour l’ELISA Ag E0 , les valeurs des pourcentages de DO calculées sont très fortes et
très éloignées du seuil de positivité du kit
10Conclusion
Analyses PCR
- Pour un échantillon faible positif la durée limite de conservation avant analyses pourrait être
fixée à 7 jours (pour une température de 37°C) ou à 18 jours (pour une température de
25°C). => important car ce type d’échantillon peut être retrouvé sur le terrain (ex :16/64, LE-
BVD)
- Conservation à 37°C des biopsies => Ct max observé très tardif => pas compatible avec
des analyses de PCR en mélange de 10 => analyse individuelle souhaitable dans ce cas
Analyses d’ELISA antigénémie E0
- Jusqu’à une période de 32 jours de conservation de la biopsies à 25°C et 37°C les résultats
des tests ELISA antigénémie E0 sont positifs (statut attendu) avec le kit X (quid de la
spécificité ?)
Proposition :
Dans les situations critiques choisir le test en fonction du temps d’acheminement de la biopsie :
- PCR si échantillon reçu dans les 7 jours (période estivale) ou 18 jours (hors période estivale)
- ELISA Antigénémie E0 si échantillon reçu au-delà de ces périodes
- Demander un autre prélèvement au-delà de 32 jours par sécurité
Résultats cohérents avec ceux obtenus en 2012 par Bapelle et col, 2012
11Perspective
Etude à replacer dans son contexte :
Tests réalisés sur biopsies ayant été congelées
biopsies non fraiches => miment-t-elles réellement la réalité des pratiques sur le
terrain ?
Tests réalisés avec uniquement trois kits => des résultats similaires
seraient-t-ils obtenus avec d’autres kits ?
Quelques questions :
Comment expliquer les résultats non convergents des kits au delà de 7j /37°C
et de 18j (25°C) ?
Dégradation aléatoire des biopsies ?
Pour la suite :
Inclure de nouveaux kits dans le protocole
Analyse d’une série d’échantillons faibles positifs (J7/37°C, J18/25°C)
Tenir compte des recommandations de cette étude lors de l’analyse des biopsies
reçues en laboratoire pour analyse afin de s’assurer de la fiabilité des résultats
12ETUDE 2
Détection d’IPI en lait de tank
13Paramètres
Contexte (programme d’éradication) :
- Une garantie bovin non IPI est requise pour la circulation de bovin
- Différentes modalités d’attribution de la garantie : surveillance sérologique, diagnostique virologique
- Autre possibilité : analyse PCR du lait de tank (deux analyses espacées de 3 à 6 mois)
But : Déterminer la taille limite de mélange de lait de tank pour la détection d’IPI par PCR
Matériel requis et stratégie :
- Laits d’IPI et d’animaux sains collectés en élevages laitiers
- Étape 1 : caractérisation de laits d’IPI laitiers individuels (IPI forts, faibles, moyens)
- Etape 2 : caractérisation de laits de tank où la présence d’IPI laitiers a été identifiée
- Etape 3 : constitution de laits de mélange (lait de tank) artificiels
=> race prim’holstein, statut négatif (virologie et de sérologie)
=> taille 50, 75, 100, 125, 150, 180
- Réalisation de PCR sur les laits de tank reconstitués avec des laits d’IPI avec un kit 1, kit2, kit 3
- Y a t-il une corrélation avec les résultats obtenus sur laits de tank prélevés en élevages infectés ?
14Résultats d’analyses
Caractérisation de 12 IPI laitiers Détection d’IPI en lait de tank artificiel
kit1 kit 1
40
40
35 35
Valeurs des Ct
30 30
Valeurs des Ct
25 25
20 20
15 15
10 10
5 5
0 0
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
IPI Faible IPI Moyen IPI Fort
Numéro des échantillons Taille des mélanges
Analyses :
Dilution d’IPI faible sur un lait individuel (LI)
- Ct obtenus : fort 21,1 faible : 28,3
Dilution Ct kit 1 Ct kit 2 Ct kit 3 moyen : 24,5
50ième 34,7 28,1 0 - Jusqu’à une taille de mélange de 180 bovins
contribuant au lait de tank artificiel, on peut
200ième 31,8 29,5 0 détecter des IPIs quel que soit leur type (fort,
300ième 31,8 30,6 0 moyen, faible) avec le kit 1
- l’IPI faible peut être retrouvé positif en PCR
600ième 31,9 - 0 si dilué au 1/600ième au moins sur lait individuel
avec le kit1 et le kit 2
1000ième Inhibé 32,2 0
- Aucun Ct de sorti avec le kit 3 sur LI
15Caractérisation de laits de tank de terrain
Vaches en lactation et
Ct lait de tank Ct IPI nombre d’IPI détectés
E001LT 36,5 28,2 Non communiqué (NC*),1 IPI
E002LT 31,2 26,1 52 en lactation, 6 IPI
E008LT 32,4 24,7 57 en lactation, 1 IPI
E013LT 39,9 21,5 NC , 1 IPI
E014LT 35,6 22,6 NC, 4 IPI
E017LT 30,3 24,8 NC, 2 IPI
E018LT 27,1 24,5 25, 1IPI
E019LT 0 NR NC,1IPI
E020LT 30,7 21,1 1 IPI
1 IPI moyen se détecte dans du lait de 25 ou de 57 vaches en lactation
1 IPI faible se détecte dans du lait de 52 vaches en lactation
Ct obtenus cohérents avec Ct obtenus sur des mélanges artificiels
16Conclusion
- Quelques valeurs de Ct obtenus sur des laits d’IPI
- La présence d’un IPI peut être identifiée par analyse du lait de tank artificiel de
180 vaches (résultats confirmés avec deux kits sur trois) la PCR assez
sensible sur la matrice lait
- Quelques difficultés techniques avec le lait :
répétabilité des valeurs des contrôles endogènes
matière grasse du lait (inhibition) => tests PCR de contrôle
culot cellulaire pas forcément identique d’un essai à l’autre
que donnerait la même étude sur du lait issu d’une autre
race de vache (brune des alpes ? Montbéliarde ?)
- Pour aller plus loin :
refaire des essais avec des dilutions de lait plus poussées
sur un lait individuel de vaches de races différentes et
sur des laits de tank (réels issus d’élevages mixtes ou non)
refaire les analyses avec d’autres kits PCR
intérêt d’un calage des kits de PCR sur lait
17Perspectives pour l’année 2019
Validation des réactifs :
PCR et ELISA antigénémie E0 sur sérum
- Période de validation: Mi Janvier à Mi-Avril
ELISA anticorps sur lait, sérum, mélanges de lait et de sérums :
- Cahier des charges en cours de validation (GDS-France/Anses)
- Matériel de référence en cours de préparation
- Période validation : Mi-Avril à fin Août
Recherche et développement :
Contribution à l’optimisation des méthodes de diagnostic de la BVDV en
cas d’avortement déclaré chez les ruminants (dispositif OSCAR)
Echantillothèque :
Réception de prélèvements et caractérisation
18Remerciements
Niort
Ophélie Pécot
Aurore Teillet
Aude Allemandou
Sophie Stourm
Benoît Croisé
Christian Baudry
Marc Tabouret
Groupements de Défense Sanitaire
Laboratoires départementaux
Producteurs de réactifs
19MERCI DE VOTRE ATTENTION
20Vous pouvez aussi lire
