Activité technologique en analyse biochimique N 6
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Année 2022 - 2023
2ème année BTS Bioanalyses et Contrôles
Activité technologique en
analyse biochimique N°6
L. GODIN godin.lionel@orange.fr
http://ligodin.free.fr
E.T.S.L. - 95, rue du Dessous des Berges - 75013 PARIS
Tél: 01 45 83 76 34 - Fax: 01 45 83 58 85 - Site: www.etsl.fr - Mail: mail@etsl.fr
TP n°6 : OPTIMISATION de MÉTHODE & DOSAGE du
MENTHOL dans l’HUILE ESSENTIELLE de MENTHE par
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
1. BUT ET CONTEXTE 2
1.1. But de la manipulation 2
1.2. Contexte de la manipulation 2
1.3. Toxicité des huiles essentielles 3
2. MATERIEL ET REACTIFS 4
3. MODE OPERATOIRE 4
3.1. Préparation des solutions mères 4
3.1.1. Préparation de la solution mère de menthol 4
3.1.2. Préparation de la solution mère de bromobenzène (étalon interne) 4
3.1.3. Préparation de la solution mère d'huile essentielle de menthe poivrée 5
3.1.4. Préparation de la solution à analyser d'huile essentielle (solution inconnue) 5
3.2. Optimisation de la méthode chromatographique 5
3.2.1. Procédure d'acquisition d'un chromatogramme en 1er gradient de température 5
3.2.2. Procédure d'acquisition d'un chromatogramme en 2nd gradient de température 5
3.3. Identification des pics d'intérêts 6
3.4. Dosage du menthol dans l'huile essentielle 6
3.4.1. Préparation de la gamme d'étalonnage interne et de l'étalon de contrôle 6
3.4.2. Passage de la gamme et traitements des résultats 7
3.4.3. Résultats 7
4. CONCLUSION GENERALE 7
5. RAPPORT D'ACTIVITÉ 8
5.1. Optimisation de la méthode chromatographique 8
5.1.1. Chromatogramme en 1er gradient de température 8
5.1.2. Chromatogramme en 2nd gradient de température 9
5.2. Identification des pics d'intérêts 10
5.2.1. Chromatogramme de la solution mère de menthol 11
5.2.2. Chromatogramme de la solution mère de bromobenzène 12
5.3. Dosage du menthol dans l'huile essentielle 13
5.3.1. Intervalle d'acceptabilité 13
5.3.2. Compatibilité métrologique 14
5.4. Conclusion générale 20
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.1/201 BUT ET CONTEXTE
1.1. But de la manipulation
Le but de la manipulation est double :
• Réaliser l'optimisation d'une méthode de dosage chromatographique du Menthol dans l’huile
essentielle de menthe poivrée.
• Utilisation de la méthode optimisée afin de doser le Menthol dans l’huile essentielle de menthe
poivrée par la méthode de l'étalon interne.
1.2. Contexte de la manipulation
Les huiles essentielles sont devenues, ces dernières années, une matière d’importance économique
considérable, avec un marché en constante croissance dont les domaines d’application sont directement liés à la
consommation humaine. C’est pourquoi, les huiles essentielles sont de plus en plus contrôlées afin de
vérifier d’une part la présence de certains composés naturels toxiques, leur origine naturelle ou non, leur source
(camphrier, cumin etc.) et la présence de certains composés actifs (menthol par exemple).
Les huiles essentielles doivent répondre à des caractéristiques imposées par les lois des pays producteurs et
exportateurs et par les pays importateurs. Ces critères sont définis dans des normes internationales ISO
(International Organisation for Standardization) ou françaises AFNOR (Association Française de
Normalisation). Ainsi sont contrôlées les propriétés organoleptiques et physiques telles que la coloration,
l’odeur, la réfraction, la solubilité́ , le point éclair mais également les propriétés chimiques telles que les
indices d’acides et d’esters. Les huiles essentielles sont des liquides hydrophobes et concentrés dont la
composition est complexe. La meilleure carte d’identité́ qualitative et quantitative d’une huile essentielle
reste cependant son profil chromatographique réalisé́ la plupart du temps en CPG.
On s’intéresse ici à la menthe poivrée dont les
feuilles ont une forte teneur en menthol. Cette
plante est cultivée en France, en Italie, en Angleterre
et aux Etats-Unis.
L’obtention d’un litre d’huile essentielle de menthe
poivrée nécessite l’utilisation de 400 kg de cette
plante.
L’huile essentielle extraite de la menthe poivrée
contient principalement du menthol (30-55 %), de la
menthone (14-32 %), du néomenthol (4 %) et du
cinéole (4 %).
Cette huile essentielle à forte teneur en menthol est utilisée depuis l’Antiquité pour ses qualités parfumantes,
culinaires et médicinales. Elle est surtout employée contre les troubles digestifs (spasmes, inflammations,
colites) et contre l’hypotension. Elle est aussi antiseptique et bactéricide.
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.2/20Les caractéristiques physico-chimiques de ces composés sont les suivantes :
Composés masse molaire température Aspect solubilité
(g.mol-1) d’ébullition (°C)
Menthone 154,24 207
Solide blanc à légèrement soluble
Menthol 156,27 212 température dans l’eau, mais
ambiante très soluble dans
l’alcool et l’hexane
liquide à légèrement soluble
Néomenthol 156,27 212 température dans l’eau, mais
ambiante très soluble dans
l’alcool et l’hexane
1.3. Toxicité des huiles essentielles
Les huiles essentielles sont des mélanges complexes de molécules, dont on peut distinguer 2 groupes : les
terpènes et les aromatiques.
Le stéréo-isomère le plus courant du menthol est le (–)-menthol, de configuration (1R,2S,5R). Il appartient
à la famille des monoterpénols.
Pour cette gamme de composés, seules les molécules de faible poids moléculaire (entre 10 et 20 atomes de
carbones) sont présents dans les huiles essentielles. Par conséquent, elles peuvent plus facilement pénétrer
notre peau et ainsi provoquer allergies et autres inflammations.
L’utilisation des huiles essentielles n’est pas à prendre à la légère. Les effets sont très variables d’une huile
essentielle à l’autre et dépendent beaucoup de la sensibilité des consommateurs.
Le menthol a une toxicité donnée par : (rat) DL50 oral : 3 300 mg·kg-1 ; peau (lapin) DL50 : 15 800 mg·kg-1.
Ainsi, il est nécessaire que les fournisseurs d’huiles essentielles identifient et quantifient les composés
potentiellement toxiques, afin d’informer au mieux les utilisateurs.
Pour cela, on utilise la CPG.
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.3/202. MATERIEL ET REACTIFS
• Une micro-seringue de 10 µL, pour l'injection ;
• 2 fioles de 50 mL avec leur bouchon et 2 fioles de 25 mL avec leur bouchon ;
• De l'hexane comme solvant ;
• Du menthol solide ;
• De l’huile essentielle de menthe poivrée ;
• Du bromobenzène utilisé comme étalon interne ;
• Chromatographe Varian GC450 piloté via réseau par un PC sous windows XP équipé du logiciel
CompassCDS 3.0 ; celui-ci est équipé de deux colonnes, deux injecteurs et un TCD.
Attention à ne jamais mettre en service avant d’avoir vérifié le passage effectif du
gaz vecteur dans le TCD
ä Gaz vecteur : Hélium
ä Colonnes : 1 Colonne apolaire, (CP CIL 5) 100 % méthyl, en position médium L = 15 m ;
2 Colonne polaire, (CP – WAX 52 CB) en PolyÉthylèneGlycol (PEG), en position
frontale L = 15 m.
ä Sortie du signal sur un intégrateur à microprocesseur.
ä Injection par micro-seringue de 10 µL.
3. MODE OPERATOIRE
3.1. Préparation des solutions mères
3.1.1. Préparation de la solution mère de menthol
A Peser dans une fiole de 50 mL, environ exactement 125 mg de menthol. Compléter à l'aide d'hexane.
Vous n’oublierez pas de noter la valeur exacte dans le CL. Calculer CM(menthol) dans le CL.
3.1.2. Préparation de la solution mère de bromobenzène
(étalon interne)
A Peser dans une fiole de 50 mL, environ exactement 250 mg de bromobenzène. Compléter à l'aide d'hexane.
Vous n’oublierez pas de noter la valeur exacte dans le CL. Calculer CM(EI) dans le CL.
Bromobenzène
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.4/20Les caractéristiques physico-chimiques du bromobenzène sont les suivantes :
Composés masse molaire température Aspect solubilité
(g.mol-1) d’ébullition (°C)
liquide à légèrement soluble
bromobenzène 106,2 156 température dans l’eau, mais
ambiante très soluble dans
l’alcool et l’hexane
3.1.3. Préparation de la solution mère d’huile essentielle de
menthe poivrée
A Peser dans une première fiole de 25 mL, exactement 125 mg d’huile essentielle. Compléter à l'aide
d'hexane.
Vous n’oublierez pas de noter la valeur exacte dans le CL.
3.1.4. Préparation de la solution à analyser d’huile
essentielle (solution inconnue)
A Prélever, à l’aide d’une pipette jaugée de 10 mL, dans la fiole précédente, 10 mL de la solution mère
d’huile essentielle que vous placerez dans une deuxième fiole de 25 mL.
A Prélever, à l’aide d’une pipette jaugée de 10 mL, dans la fiole « Etalon Interne », 10 mL de la solution
mère de bromobenzène que vous placerez dans cette deuxième fiole de 25 mL. Calculer Cinc(EI) dans le
CL.
Compléter jusqu’au trait de jauge à l'aide d'hexane.
3.2. Optimisation de la méthode chromatographique
3.2.1. Procédure d'acquisition d'un chromatogramme en 1er
gradient de température
Utiliser la notice technique du chromatographe GC450 Varian
3.2.2. Procédure d'acquisition d'un chromatogramme en 2nd
gradient de température
Utiliser la notice technique du chromatographe GC450 Varian
Comparer les chromatogrammes entre eux.
Que dire de la durée d'analyse et de la forme des pics en fonction de la
Rapport valeur du gradient de température ?
En déduire le meilleur gradient d'analyse.
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.5/203.3. Identification des pics d’intérêts
Utiliser la notice technique du chromatographe GC450 Varian
Donner les temps de rétention caractéristiques du menthol et du
bromobenzène dans les conditions chromatographiques idéales
déterminées précédemment. Expliquer pourquoi le bromobenzène "sort"
Rapport avant le menthol ?
Que représente le pic situé entre les deux pics d’intérêt ?
3.4. Dosage du menthol contenu dans l’huile essentielle
3.4.1. Préparation de la gamme d’étalonnage interne et de
l’étalon de contrôle
A Préparation de la gamme : l’étalon interne sera prélevé à l’aide d’une pipette jaugée de 2 mL dans la fiole
contenant la solution mère de bromobenzène.
Le menthol sera prélevé dans la fiole contenant la solution mère de menthol.
Préparer différentes fioles filles de 10 mL avec bouchon adéquat, suivant le tableau ci-dessous :
Fioles EI (bromobenzène) Menthol (mL) Concentration Concentration exacte
(mL) exacte en EI (g/L) en menthol (g/L)
1 2 2
2 2 3,5
3 2 5
4 2 6,5
5 2 8
Vous compléterez avec de l’hexane s’il y a lieu.
A Préparation de l’étalon de contrôle : vous préparez une fiole notée fiole CQ, dans laquelle vous placerez 2
mL d’EI et 4 mL de menthol, complété à l’hexane.
Fioles EI (bromobenzène) Menthol (mL) Concentration Concentration exacte
(mL) exacte en EI (g/L) en menthol (g/L)
CQ 2 4 Cref =
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.6/203.4.2. Passage de la gamme et traitement des résultats
Utiliser la notice technique du chromatographe GC450 Varian
3.4.3. Résultats
Relever la valeur de la concentration en menthol dans l’étalon de
contrôle CEQ donnée par le logiciel. Rechercher si cette valeur est
comprise dans l’intervalle d’acceptabilité Cref ± 10 %
Rapport
Indiquer les valeurs C1 et C2 des concentrations en menthol dans la
solution inconnue.
Vérifier la compatibilité métrologique dans le cas des deux essais
précédemment effectués en répétabilité à l’aide de l’annexe
Rapport métrologique.
Donner la valeur retenue pour la concentration en menthol CMenthol.
Vous exprimerez le résultat comme indiqué dans l’annexe
métrologique.
Rendre la courbe d’étalonnage interne et indiquer la concentration en
g/L en menthol dans le flacon d’huile essentielle.
Déterminer la masse mmenthol de menthol, et le % de menthol dans le
Rapport flacon d’huile essentielle.
Comparer avec la valeur indiquée par le fabricant.
Évaluer grossièrement le % de la menthone dans le flacon d’huile
essentielle.
4. CONCLUSION GENERALE
Conclure sur l’ensemble des manipulations réalisées.
Rapport
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.7/205. TP N° 6 : RAPPORT D’ACTIVITÉ :
OPTIMISATION DE METHODE & DOSAGE
DU MENTHOL DANS L’HUILE
ESSENTIELLE DE MENTHE PAR CPG
5.1. Optimisation de la méthode chromatographique
5.1.1. Chromatogramme en 1er gradient de température
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.8/205.1.2. Chromatogramme en 2nd gradient de température E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.9/20
Comparer les chromatogrammes entre eux.
Que dire de la durée d'analyse et de la forme des pics (hauteur, aire et largeur) en fonction de la
valeur du gradient de température ?
En déduire le meilleur gradient d'analyse.
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.10/205.2. Identification des pics d’intérêt
5.2.1. Chromatogramme de la solution mère de menthol
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.11/205.2.2. Chromatogramme de la solution mère de
bromobenzène
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.12/20Donner les temps de rétention caractéristiques du menthol et du bromobenzène dans les conditions
chromatographiques idéales déterminées précédemment.
Expliquer pourquoi le bromobenzène "sort" avant le menthol ?
Que représente le pic situé entre les deux pics d’intérêt ?
5.3. Dosage du menthol dans l’huile essentielle
5.3.1. Intervalle d’acceptabilité
Compléter le tableau ci-dessous :
Fioles EI (bromobenzène) Menthol (mL) Concentration Concentration exacte
(mL) exacte en EI (g/L) en menthol (g/L)
1 2 2
2 2 3,5
3 2 5
4 2 6,5
5 2 8
CQ 2 4 Cref =
Relever la valeur de la concentration en menthol dans l’étalon de contrôle CEQ donnée par le
logiciel. Rechercher si cette valeur est comprise dans l’intervalle d’acceptabilité Cref ± 10 % et
conclure.
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.13/205.3.2. Compatibilité métrologique
Indiquer les valeurs C1 et C2 des concentrations en menthol dans la solution inconnue.
Vérifier la compatibilité métrologique dans le cas des deux essais précédemment effectués en
répétabilité à l’aide de l’annexe métrologique.
Donner la valeur retenue pour la concentration en menthol CMenthol. Vous exprimerez le résultat
comme indiqué dans l’annexe métrologique.
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.14/20Rendre la courbe d'étalonnage interne, le chromatogramme correspondant à l’étalon de contrôle et les 2
chromatogrammes inconnus. Coller les 4 feuilles correspondantes ci-dessous :
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.15/20E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.16/20
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.17/20
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.18/20
• Indiquer la concentration en g/L en menthol dans le flacon d’huile essentielle.
• Déterminer la masse mmenthol de menthol, et le % de menthol dans le flacon d’huile
essentielle.
• Comparer avec la valeur indiquée par le fabricant.
• Évaluer grossièrement le % de la menthone dans le flacon d’huile essentielle.
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.19/205.4. Conclusion générale
Conclure sur l’ensemble des manipulations réalisées. Discuter des difficultés éventuellement
rencontrées.
E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Protocole & Rapport 6.20/20Vous pouvez aussi lire
