Proposition de sujet de thèse 2021 - Aix-Marseille Université

Proposition de sujet de thèse 2021
(A remplir par les équipes d'accueil et à retourner à Isabelle HAMMAD : hammad@cerege.fr
*à renseigner obligatoirement pour la validation du sujet, (1) : A remplir lors de la campagne d'attribution des
allocations, à l'issue de la session de juin des Masters

Sujet de doctorat proposé : Etude comparative de deux procédés innovants de formation
de nanoliposomes pour des applications en nanomédecine.

Encadrants : Elisabeth BADENS (elisabeth.badens@univ-amu.fr) et Adil MOUAHID
(adil.mouahid@univ-amu.fr) :
Laboratoire : LM2P2, UMR CNRS 7340

Tableau récapitulatif du sujet
Candidat(e)(1)
Nom - Prénom :
Date de naissance :
Licence (origine, années, mention) :
Mention et classement au Master 1 année (Xème sur Y)

Mention et classement au S3 du Master 2 (Xème sur Y)
Mention et classement au S4 du Master 2 (Xème sur Y)
Mention et classement au M2 (année) (Xème sur Y)
MASTER (nom, université)
Sujet de doctorat proposé*                                      Etude comparative de deux procédés innovants de
                                                                formation de nanoliposomes pour des applications
                                                                en nanomédecine
Encadrants (2 max, indiquer si HDR ou pas)*                     Elisabeth BADENS (HDR) et Adil MOUAHID
Laboratoire*                                                    LM2P2, UMR CNRS 7340
Programme finançant la recherche (indiqué si obtenu ou          Fonds propres déjà acquis
envisagé) (1)

Sujet de doctorat proposé*

Intitulé* : Etude comparative de deux procédés innovants de formation de nanoliposomes
pour des applications en nanomédecine

Descriptif :
        Face aux problèmes environnementaux actuels, une transformation de l’industrie est actuellement en
cours. L’objectif visé est de développer des procédés sobres en énergie et en matières premières, sans rejets.
Les procédés utilisant les fluides supercritiques (FSC) représentent une alternative à l’utilisation de solvants
organiques liquides posant des problèmes de toxicité et de sécurité ; leur utilisation engendre des problèmes
environnementaux avérés. Les procédés supercritiques sont considérés comme des procédés propres, s’intégrant
parfaitement dans le contexte actuel de transformation de l’Industrie.
        Lorsque ces procédés sont appliqués à la mise en forme de médicaments, un autre atout majeur est lié au
bon contrôle des caractéristiques des produits obtenus en termes de taille, distribution de taille et morphologie
[1, 2]. Les procédés utilisant les FSC présentent en effet la spécificité d’être compacts, avec un nombre réduit
d’opérations unitaires, et cela permet d’obtenir un produit fini avec des caractéristiques homogènes. En fonction
de la nature du système étudié et des conditions opératoires, il est possible de former des particules ou des
vésicules de taille nanométrique avec une distribution de taille resserrée. Cette technologie est ainsi adaptée à
l’élaboration de nanomédicaments dont l’utilisation connaît actuellement un intérêt croissant en médecine. En

effet, la taille des nanovecteurs est une caractéristique clé de leur internalisation cellulaire. Des particules ou
vésicules ayant une taille allant jusqu'à 5 microns peuvent subir une internalisation cellulaire mais le processus
est plus rapide si leur taille est inférieure à 100 nm. Il est communément admis que le diamètre recommandé de
particules pour le traitement du cancer est compris entre 10 et 100 nm, et que les nanoparticules de l'ordre de
quelques dizaines de nanomètres entrent plus efficacement en utilisant des voies d'internalisation cellulaire
limitant la dégradation [3].

        L’équipe « Procédés & Fluides supercritiques » a développé ces dernières années différents procédés
innovants de mise en forme de médicaments et s’est plus particulièrement intéressé à la formation de
liposomes. Une revue sur ce sujet a récemment été publiée par une équipe belge [4]. Les liposomes sont des
vésicules de matière molle, non toxiques et biodégradables. Leurs bicouches phospholipidiques, qui imitent les
membranes cellulaires, font des liposomes des matrices d'encapsulation de premier choix en thérapie. Ils
peuvent encapsuler des composés hydrophiles dans leur cœur aqueux ou bien des composés hydrophobes au
sein de la bicouche phospholipidique. Des molécules peuvent également être complexées avec les liposomes
pour mieux atteindre la cible tumorale.
        Les procédés conventionnels, utilisant des solvants organiques liquides, ne permettent pas de former des
nanoliposomes stables dans le temps. En revanche, des travaux récents menés au LM2P2 ont montré que des
liposomes de taille comprise entre 45 et 100 nm, et stables dans le temps, peuvent être obtenus en utilisant le
CO2 supercritique. Pour la première fois, des liposomes ont été élaborés par un procédé supercritique en
millifluidique. Un intérêt majeur est d’avoir ainsi un procédé plus économe en énergie et en matières premières.
Ce procédé en millifluidique développé au LM2P2 est robuste mais nécessite l’utilisation d’éthanol. Une étape
ultérieure de séparation solvant/produit fini est alors requise. L’utilisation de solvant pourrait être évitée en
utilisant un autre procédé, appelé procédé PGSS (Particles from Gas Saturated Solutions) impliquant un mode
de mise en contact des phases différent. Le Laboratoire M2P2 a acquis récemment un nouvel équipement qui
permettra d’étudier le procédé PGSS appliqué à la formation de nanoliposomes. Outre l’avantage de ne pas
utiliser de solvant, ce procédé PGSS nécessite une consommation de CO2 très significativement réduite par
rapport à celle généralement utilisée pour ce type de procédés.

        Le travail de thèse proposé ici consistera à mettre au point le procédé PGSS appliqué à l’élaboration de
nanoliposomes et de comparer son efficacité à celle du procédé en millifluidique en termes de rendements, de
consommation en énergie et en matières premières.
        L’objectif sera de former des liposomes utilisés comme vecteurs de médicaments pour des applications
en thérapie génique de maladies rares ou en thérapie anticancéreuse. Deux collaborations avec des laboratoires
de la Timone sont prévues. Les nanoliposomes chargés en médicaments y seront testés.

       La thèse comportera 5 volets principaux :

       1/ Etude bibliographique :
       Cette étude des articles de la littérature permettra de faire une revue exhaustive des procédés
d’élaboration de nanoliposomes afin de renforcer le positionnement des procédés développés au LM2P2.

       2/ Mise au point d’un procédé sans solvant (procédé PGSS) pour la formation des liposomes et étude
comparative avec le procédé en millifluidique :
       Cette partie expérimentale du travail de thèse fera appel à la Méthodologie de la Recherche
Expérimentale (MRE) comme outil pour comparer les résultats obtenus avec les 2 procédés.
       Les liposomes formés par les deux méthodes seront caractérisés en termes de taille, distribution de taille,
nombres de bicouches phospholipidiques, taux d’encapsulation et stabilité dans le temps. La détermination des
taux d’encapsulation demandera une attention particulière car pour chaque principe actif étudié, une méthode
analytique adaptée sera spécifiquement mise en place.

        3/ Etude des équilibres de phases haute pression :
        Afin de permettre une interprétation rigoureuse des résultats en particulier pour ce qui concerne la taille,
la distribution de taille et le taux d’encapsulation des liposomes, les équilibres de phases seront l’objet d’une
étude à part entière. Le LM2P2 est équipé de cellules Haute Pression de mesures d’équilibres de phases. Il a été
démontré dans des travaux antérieurs [5] que les caractéristiques des liposomes formés dépendent des
différentes étapes lors de leur formation et en particulier du type d’émulsions formées sous pression au cours du

procédé. Les caractéristiques des liposomes formés seront corrélées aux conditions opératoires suivies et à la
nature des différentes phases en présence au cours du procédé.

       4/ Encapsulation d’acides ribonucléiques pour une application en thérapie génique :
       Collaboration avec l’Equipe"Prénylation, vieillissement et cancer" (Catherine Badens, Nicolas
       Levy) UMR S 1251 Marseille Medical Genetics.

        Une alternative aux thérapies médicamenteuses conventionnelles utilisant des anti-inflammatoires, des
immunosuppresseurs ou des anti-cancéreux est actuellement en plein développement. Ce nouveau type de
thérapie consiste à utiliser des acides ribonucléiques interférents (ou petit ARN interférent, siRNA) pour
moduler spécifiquement une expression génétique ciblée. En effet, les siRNA permettent soit de dégrader les
ARN messagers (codant l'information génétique pour la synthèse des protéines dans les cellules), soit d'inhiber
leur traduction en protéines. Les siARN peuvent être utilisés pour traiter des maladies virales ou des maladies
liées à l'expression anormale d'un gène. Cependant, les siRNA sont des molécules fragiles qui peuvent être
rapidement dégradées in vivo par l'action des ribonucléases et les variations de pH. Ils ont besoin de protection
pour atteindre les cellules. Une possibilité d'encapsuler ces composés est l'utilisation de liposomes.
        Deux macromolécules seront encapsulées dans des liposomes par les procédés mis en œuvre :
- Un siRNA ciblé sur l'extrémité 3' du gène LMNA, une molécule hydrophile capable de moduler l'expression
du gène LMNA et qui constitue un nouveau type de thérapie pour le traitement du syndrome de Hutchinson-
Gilford Progeria (HGPS) ou d'autres maladies génétiques liées également à la production de lamine A mutante.
- L'atazanavir, un antirétroviral et un inhibiteur de protéase utilisé in vitro, pour reproduire l'effet toxique des
protéines mutantes dans le HGPS. Dans ce cas, l'application n'est pas thérapeutique mais sert à la réalisation
d'un modèle cellulaire de Progeria.

       L'efficacité des formulations obtenues avec les deux types de molécules sera évaluée in vitro sur des
cellules témoins ou de patients à l'aide de différents tests portant sur le niveau de sénescence. Les résultats
seront comparés à d'autres solutions commerciales couramment utilisées in vitro pour transfecter des cellules
par des siRNA.

       5/ Encapsulation de principes actifs pour une application en thérapie anti-cancéreuse :
       Collaboration avec l'équipe "SMARTc" (Joseph Ciccolini) à l'Unité Mixte Inserm UMR U1068
       CRCM, Aix Marseille Université.

        Les nanotechnologies connaissent un intérêt croissant depuis une trentaine d’année dans la thérapie du
cancer. Les propriétés les plus importantes attendues des nanovecteurs d’anti-cancéreux sont la protection des
médicaments contre la dégradation et l'optimisation de leur profil pharmacocinétique pour atteindre un meilleur
ciblage tumoral.
        Pour augmenter l'accumulation de médicaments dans les tumeurs, les liposomes doivent idéalement
combiner une petite taille et un long temps de circulation pour atteindre la tumeur, un ligand ciblant pour
distinguer les cellules cancéreuses des cellules de soutien et un vecteur correctement conçu pour la livraison
intracellulaire.
        Dans le cadre de la collaboration avec l’équipe SMARTc, des liposomes chargés de médicaments
cytotoxiques et présentant en surface des anticorps monoclonaux thérapeutiques seront élaborés par le LM2P2.
Leur efficacité sera dans un premier temps testée in vitro sur des modèles 2D et 3D puis chez l’animal porteur
de tumeur. Ces nouveaux complexes Anticorps-Nano Conjugué (ANC) devraient présenter une efficacité plus
élevée tout en réduisant les toxicités liées au traitement en raison d’une plus grande spécificité envers les
cellules malignes. Ces formulations innovantes seront développées dans le traitement des cancers du pancréas
et du sein.
        Les nanoliposomes obtenus au LM2P2 seront comparés à ceux formés en microfluidique. L’équipe
SMARTc a récemment acquis un équipement de paillasse permettant l’élaboration de liposomes en
microfluidique liquide (NanoPrecision System®).
        Un autre aspect innovant de ce travail sera de modéliser la pharmacocinétique mécanistique de ces
formulations en faisant appel à l’intelligence artificielle et au machine learning.

Références bibliographiques :
[1]    E. Badens, Mise en forme de principes actifs pharmaceutiques en phase supercritique, Les Techniques de l’Ingénieur, 2012.

[2]     E. Badens, Y. Masmoudi, A. Mouahid, C. Crampon, Current situation and perspectives in drug formulation by using
        supercritical fluid technology, 134, 2018.
[3]     J. Wang, J.D. Byrne, M.E. Napier, J.M. DeSimone, More Effective Nanomedicines through Particle Design, Small, 7, 2011.
[4]     W. Bigazzi, N. Penoy, B. Evrard, G. Piel, Supercritical fluid methods: An alternative to conventional methods to prepare
        liposomes, Chemical Engineering Journal, 383, 2020.
[5]     L. Lesoin, C. Crampon, O. Boutin, E. Badens, CO2/water/surfactant ternary systems and formation of liposomes using
        supercritical CO2: a review, Colloids and surfaces A : Physicochemical and Engineering aspects, 377, 2011.

Détail du Programme finançant la recherche :
L’équipe « Procédés &Fluides supercritiques » bénéficie de fonds propres pour réaliser cette étude.

Directrice de thèse HDR proposée :
Nom - Prénom : Badens- Elisabeth
Corps : PU
Laboratoire : LM2P2, UMR CNRS 7340, Equipe « Procédés & Fluides Supercritiques »
Adresse mail : elisabeth.badens@univ-amu.fr
Choix de cinq publications récentes (souligner éventuellement les étudiants dirigés co-signataires) :

P1.     C. Dufour, C. Crampon, C. Delbecque, P-P. Garry, and E. Badens, Sclareol Purification Using
        Supercritical Fractionation Process: A Modelling Case Study, The Journal of Supercritical Fluids, 159,
        2020.
P2.     K. Ongkasin, Y. Masmoudi, C. Weithermmer, A. Hillnmayer, K. Eibl, E. Badens, Supercritical fluid
        technology for the development of innovative ophthalmic medical devices: Drug loaded intraocular
        lenses to mitigate posterior capsule opacification, accepted for publication in the European Journal of
        Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 149, 248-256, 2020.
P3.     K. Ongkasin, Y. Masmoudi, T. Tassaing G. Lebourdon, E. Badens, Supercritical loading of gatifloxacin
        into hydrophobic foldable intraocular lenses - Process control and optimization by following in situ CO2
        sorption and polymer swelling, accepted for publication in the International Journal of Pharmaceutics,
        581, 2020.
P4.     S. Clercq, A. Mouahid, G. Peppe, E. Badens, Prediction of crystal-solvent interactions in a supercritical
        medium: A possible way to control crystal habit at high supersaturations with molecular modeling,
        Journal of Crystal Growth and Design, 20,10, 6863-6876, 2020.
P5.     M. Martino, A. Mouahid, P. Trucillo, E. Badens, Elaboration of lutein-loaded nanoliposomes using
        supercritical CO2, European Journal of Lipid Science and Technology, 2021, In Press.

Thèses encadrées ou co-encadrées au cours des quatre dernières années

Nom : CLERCQ Sébastien
Intitulé : Etude des mécanismes de cristallisation en milieu supercritique
Type d'allocation : Bourse MESR
Date de début de l'allocation de doctorat : 2014
Date de soutenance prévue : 30/11/2018
Programme finançant la recherche : Fonds propres
Pourcentage de participation à l'encadrement : 50 %
Situation actuelle du docteur : Créateur et dirigeant de l’entreprise CRISTOLAB

Nom : ONGKASIN Kanjana
Intitulé : Elaboration de systèmes à libération contrôlée de principes actifs pharmaceutiques en milieu supercritique
Type d'allocation : Bourse du gouvernement thaïlandais
Date de début de l'allocation de doctorat : 1er janvier 2016
Date de soutenance prévue : 11/12/2019
Programme finançant la recherche : Fonds propres
Pourcentage de participation à l'encadrement : 50 %
Situation actuelle du docteur : Enseignant-chercheur, Université Ubon Ratchathani, Thaïlande

Liste des thèses en cours : 4 thèses en cours (une soutenance est prévue en septembre 2021)

Nom : MARTINO Mathieu
Intitulé : Etude d’un procédé d’encapsulation d’acides nucléiques en milieu supercritique

Type d'allocation : Bourse MESR
Date de début de l'allocation de doctorat : 1er octobre 2017
Date de soutenance prévue : Septembre 2021
Programme finançant la recherche : Fonds propres
Pourcentage de participation à l'encadrement : 50 %

Nom : NUMA Vénicia
Intitulé : Utilisation de technologies vertes pour la valorisation en cosmétique de différents co-produits végétaux
Type d'allocation : Bourse CIFRE en collaboration avec la société SYMRISE
Date de début de l'allocation de doctorat : 1er avril 2020
Date de soutenance prévue : Mars 2023
Programme finançant la recherche : CIFRE et contrat d’accompagnement
Pourcentage de participation à l'encadrement : 50 %

Nom : SCHNEIDER Matthieu
Intitulé : Elaboration en milieu supercritique d’implants intravitréens à libération prolongée d’inhibiteurs de facteurs de
croissance endothéliaux (anti-VEGF)
Type d'allocation : Bourse CIFRE en collaboration avec les Laboratoires THEA
Date de début de l'allocation de doctorat : 1er octobre 2020
Date de soutenance prévue : Septembre 2023
Programme finançant la recherche : CIFRE et contrat d’accompagnement
Pourcentage de participation à l'encadrement : 50 %

Nom : GUTIERREZ Alejandra
Intitulé : Vers une meilleure valorisation d’Arthrospira platensis (Spiruline) : contribution à l’optimisation de sa culture et
de son fractionnement »
Type d'allocation : Bourse du gouvernement mexicain
Date de début de l'allocation de doctorat : 1er Janvier 2021
Date de soutenance prévue : Décembre 2023
Programme finançant la recherche : Contrat d’accompagnement (CEA)
Pourcentage de participation à l'encadrement : 50 %

Autre directeur proposé :
Nom - Prénom : MOUAHID - Adil
Corps : MCU
Adresse mail : adil.mouahid@univ-amu.fr
Laboratoire : LM2P2, UMR CNRS 7340, Equipe « Procédés & Fluides Supercritiques »

Choix de cinq publications récentes (souligner éventuellement les étudiants dirigés co-signataires) :

P1.     S. Clercq, A. Mouahid, G. Peppe, E. Badens, Investigation of crystallization mechanisms for
        polymorphic and habit control from the Supercritical AntiSolvent process, The Journal of Supercritical
        Fluids, 141, 29-38, 2018.
P2.     S. Clercq, A. Mouahid, G. Peppe, E. Badens, Prediction of crystal-solvent interactions in a supercritical
        medium: A possible way to control crystal habit at high supersaturations with molecular modeling,
        Journal of Crystal Growth and Design, 20,10, 6863-6876, 2020.
P3.     A. Mouahid, K. Seengeon, M. Martino, C. Crampon, A. Kramer, E. Badens, Supercritical CO2
        Extraction of Neutral Lipids from Nannochloropsis maritima and Nannochloropsis salina: Influence of
        drying pretreatments and of experimental conditions on extraction kinetics and yield, The Journal of
        Supercritical Fluids, 165, 2020.
P4.     M. Martino, A. Mouahid, P. Trucillo, E. Badens, Elaboration of lutein-loaded nanoliposomes using
        supercritical CO2, European Journal of Lipid Science and Technology, 2021, In Press.
P5.     A. Mouahid, I. Bombarda, M. Claeys-Bruno, S. Amat, E. Myotte, J.P. Nisteron, C. Crampon, E.
        Badens, Supercritical CO2 Extraction of Moroccan Argan (Argania spinosa L.) oil: Extraction Kinetics
        and Solubility Determination, Journal of CO2 utilization, 2021, In Press.

Thèses encadrées ou co-encadrées au cours des quatre dernières années*

Nom : CLERCQ Sébastien
Intitulé : Etude des mécanismes de cristallisation en milieu supercritique
Type d'allocation : Bourse MESR
Date de début de l'allocation de doctorat : 2014
Date de soutenance prévue : 30/11/2018
Programme finançant la recherche : Fonds propres
Pourcentage de participation à l'encadrement : 50 %
Situation actuelle du docteur : Créateur et dirigeant de l’entreprise CRISTOLAB

Liste des thèses en cours : 1 thèse en cours

Nom : MARTINO Mathieu
Intitulé : Etude d’un procédé d’encapsulation d’acides nucléiques en milieu supercritique
Type d'allocation : Bourse MESR
Date de début de l'allocation de doctorat : 1er octobre 2017
Date de soutenance prévue : Septembre 2021
Programme finançant la recherche : Fonds propres
Pourcentage de participation à l'encadrement : 50 %