Suivi Immuno-Hématologique de la femme enceinte - HUEP - AP-HP Dr Agnès Mailloux UF de biologie du CNRHP
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Suivi Immuno-Hématologique de la
femme enceinte
Dr Agnès Mailloux
UF de biologie du CNRHP
Centre National de Référence en Hémobiologie Périnatale
Pôle de Biologie médicale et Pathologie
HUEP – AP-HP
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
INTRODUCTION
But du suivi Immuno-hématolique :
Intérêt Fœtal – diagnostic des IFM érythrocytaire
IFM érythrocytaire : situation obstétricale rare
= fixation Ac maternels circulants sur les Ag fœtaux
érythrocytaires correspondants
Gravité : Immuno-hémolyse fœtale et néonatale
Survenue d’une anémie
Hyper-production de bilirubine avec accumulation
post-natale et risque d’ictère nucléaire dès la première
semaine de vie
Incidence clinique 4/1000 naissances
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
PHYSIOPATHOLOGIE 1- Traversée trans-placentaire des anticorps maternels IgG via les récepteurs FcgRn dès le premier trimestre de la grossesse. Taux fœtal IgG à 20 SA : 10 % du taux maternel 2- Formation des immun-complexes Antigène-Anticorps sur le globule rouge foetal 3- Immuno-adhérence et érythrophagocytose par les macrophages spléniques 4- Survenue d’une anémie 5- Hyper-production de bilirubine avec accumulation post-natale et risque d’ictère nucléaire dès la première semaine de vie A Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
OUTILS BIOLOGIQUES
POUR LE DIAGNOSTIC ET LE SUIVI DES
INCOMPATIBILTES
FOETO-MATERNELLES
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
SUIVI DE GROSSESSE : Les RAI • RAI D’INTERET FŒTAL : Femme RH:1 : au 1er trimestre Femme RH:-1 ou RH:1 avec ATCD transfusionnels : au 1er, 2ème et 3ème trimestre (sauf si injt° d’IgRH) • RAI D’INTERET MATERNEL (transfusionnel) : en fin de grossesse A Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE
ALLO-ANTICORPS COURANTS ET RISQUE DE MALADIE HEMOLYTIQUE
Spécificité Spécificité Risque d’anémie fœtale Maladie
(nomenclature (nomenclature hémolytique
traditionnelle) numérique)
néonatale
Anti-D Anti-RH1 OUI après 15 SA OUI
Anti-Kell Anti-KEL1 OUI après 15SA OUI
Anti-c Anti-RH4 OUI après 20 SA OUI
Anti-E Anti-RH3 RARE (3ème trimestre) OUI
Anti-e Anti-RH5 Exceptionnel OUI
Anti-Fya Anti-FY1 Exceptionnel OUI
Anti-Jka Anti-JK1 Exceptionnel OUI
Anti-Kpa Anti-KEL3 Exceptionnel OUI
Anti-M Anti-MNS1 Exceptionnel OUI
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineDIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE
ALLO-ANTICORPS COURANTS ET RISQUE DE MALADIE HEMOLYTIQUE
Spécificité Spécificité Risque d’anémie fœtale Maladie
(nomenclature (nomenclature hémolytique
traditionnelle) numérique)
néonatale
Anti-A Anti-ABO1 NON OUI
Anti-B Anti-ABO2 NON OUI
Anti-C Anti-RH2 NON OUI
Anti-Fyb Anti-FY2 NON OUI
Anti-Jkb Anti-JK2 NON OUI
Anti-S Anti-MNS3 NON OUI
Anti-G Anti-RH12 NON OUI
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineDIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE
Paramètres de l’Ac influençant le risque hémolytique
Sa spécificité : déterminée par la RAI + IAI
Affinité : différente selon la spécificité
donnée par le titrage en Coombs indirect sur
hématies tests natives
Pouvoir d’activation des récepteurs Fc :
fonction de la sous-classe IgG1 ou IgG3 et de la glycosylation Fcg
déterminée par des tests fonctionnels (type ADCC)
Concentration : très grande variation (de 1 ng à 100 µg/ml)
déterminée / dosage pondéral ou approchée / titrage
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineI- LA TECHNIQUE DE DOSAGE
PONDERAL
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineDIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE
Dosage pondéral des anticorps
anti-RH1, anti-RH4, Anti-RH5, anti-RH3, Anti-RH2
Dosage précis de la concentration en anticorps
Technique lourde
CV de la technique : 5 % à 20 %
Variante 2 temps : hématies tests traitées au préalable par broméline :
haut rendement de fixation (résultat proche de la concentration réelle)
Variante 1 temps : broméline introduite directement dans le circuit,
destruction des IgG3 (dosage des IgG1 de haute affinité)
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineII- LA TECHNIQUE DE TITRAGE A Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE
Titrage des anticorps
• Pour les autres anticorps : Titrage en technique de Coombs indirect
en tube (test indirect à l’antiglobuline-hématies tests normales-
lecture macroscopique des agglutinats)
• Lecture directe : IgM
• Addition de l’anti-IgG : lecture en test indirect à l’antiglobuline
• Réalisation en parallèle d’un témoin titrage
• Titrage comparatif / sérum précédent
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineTitrage tube et titrage en support solide :
Difficultés de corrélation
Spécificité des Nombre de Nombre de dilution d’écart pour la
anticorps spécimens technique gel par rapport à la technique
tube
Minimum Maximum Moyenne
Anti-RH1 65 0 +6 +3
Anti-RH1+RH2 31 0 +4 +3
Anti-RH1+RH2+RH3 3 0 +4
Anti-RH3 22 0 +5 +2
Anti-RH4 10 0 +6 +2
Anti-RH5 2 0 +4
Anti-RH8 2 0 +1
Anti-KEL1 7 (titre < 1/64) 0 -3 -2
3 (titre > 1/64) 0 +3
Anti-FY1 1 0 +1
Anti-JK1 4 0 -4 -2
Anti-MNS1 8 0 -3 -2
Anti-MNS3 1 +1 +2
Anti-MNS5 2 +3 +4
Grande dispersion des résultats quelque soit le titre.
Utilisation du support gel augmente de façon peu reproductible le titre des Ac.
SAUF Anti-KEL1, anti-MNS1, anti-JK1 : titres en support gel < titrage tube.
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine Etude CNRHP, SFTS 2011III- LA TECHNIQUE DE MICROTITRAGE DES ANTI-RH1 A Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
INTERET DU MICROTITRAGE
3 QUESTIONS
1- ANTICORPS TROUVE DANS
LE SERUM UNIQUEMENT
EXPLICABLE PAR ANTI-RH1
± ANTI-RH1 immun?)
PASSIF (±
2- EST-CE QUE LA QUANTITE D’ANTICORPS EST SUFFISANTE
POUR PROTEGER ?
Apport IgG anti-D ≥ à 20 µg/ml GR RH:1 efficacité 100%
3- EST-CE QU’UN DOSAGE PONDERAL EST NECESSAIRE ?
µT ≥ 24ng/ml
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineTECHNIQUE DE MICROTITRAGE
Technique simple d’hémagglutination en support gel
6 ng/ml 3 1.5 0.75 Pur 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32
STANDARD PATIENT
Concentration approchée = 8 x 1.5= 12 ng/ml
Concentration de la
Inverse de la dernière
X dilution du standard
Concentration en anti-D = dilution réactive de
avec la même
l’échantillon
intensité de réactionINTERPRETATION DU MICROTITRAGE
Concentration en anti-D comparée à la concentration théorique
½ VIE 3 SEMAINES DIMINUTION DE MOITIE TOUTES LES 3 SEMAINES
350
45 ng/ml
300
250 ANTICORPS TROUVE DANS LE SERUM
UNIQUEMENT EXPLICABLE PAR ANTI-D PASSIF
200 (ALLO-IMMUNISATION EN PLUS) ?
22 ng/ml
150
100 11 ng/ml
6 ng/ml
50
3 ng/ml
0
28 30 32 34 36 38 40 42
Terme SAIV- LES TECHNIQUES DE
GENOTYPAGE FOETAL
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineDIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUES
le génotypage fœtal par PCR
INVASIF
Liquide amniotique ou villosités choriales :
RHD, RHc, RHE, KEL1…
Méthodes validées
Indications : immunisations sévères anti-KEL1 ou anti-RHc avec
géniteur hétérozygote
NON INVASIF
Sang maternel (ADN plasmatique) : RHD (2004), KEL1(2010), RH4
(2015)
Méthode validée, accréditée pour le RHD et le KEL1
Indications : toutes immunisations anti- D ou anti-Kell avec géniteur
RHD ou KEL1 positif
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineLE GENOTYPAGE RHD FŒTAL NON INVASIF
Free DNA Fetal Kit® RhD
Kit de génotypage foetal RHD à partir d’ADN fœtal libre du sang
maternel (Technique PCR Temps réel)
Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD et ADN Maïs :
- EXON 10 (plus sensible mais moins spécifique)
- EXON 7 (plus spécifique mais moins sensible)
- EXON 5 (permet de génotyper le fœtus chez une mère possédant
un variant silencieux Dpsi)
Amplification positive Amplification négative
FŒTUS RHESUS D POSITIF FŒTUS RHESUS D NEGATIF
Car : Absence de séquence du gène RHD (diagnostic par défaut)
chez la mère RH1 négatif Ou amplification défectueuse
PERMET DE LEGITIMER UNE Ou concent° très faible d’ADN fœtal
SURVEILLANCE ANTENATALE
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineGENOTYPAGE RHD FOETAL
INDICATIONS
Femme immunisée Femme RH1 négatif non-immunisée
anti-RH1
Avant amniocentèse Prophylaxie systématique de
la 28ème semaine
Réalisation à partir de 12 SA Réalisation 8-15 jours avant Réalisation avant 26 SA
le geste
Foetus RHD+ Fœtus RHD- Fœtus RHD+Fœtus RHD- Fœtus RHD+Fœtus RHD-
exemption de
Incompatibilité exemption de injection IgRH évite injection injection
aussitôt après IgRH à 28 SA prévention et
fœto-maternelle d’IgRH
surveillance amniocentèse surveillance
légitime
(40%)
surveillance lourde
Besoins:
Besoins:
- certitude des positifs
- certitude des négatifs
- certitude des négatifs
- diagnostic avant 26SA
- diagnostic précoceGENOTYPAGE KEL1 FŒTAL NON INVASIF
KEL2 (Thr) KEL1 (Met)
Mutation de substitution
(transversion)
…AAC CGA ACG CTG AGA… …AAC CGA ATG CTG AGA…
…TTG GCT TGC GAC TCT… …TTG GCT TAC GAC TCT…
Examen basé sur
1- PCR allèle KEL1 spécifique en temps réel (SyberGreen)
réalisé en triplicate (91 pb)
⇒ mise en évidence d’ADN foetal KEL1
2- PCR de l’exon 7 du gène ABO en temps réel (SyberGreen)
réalisé en simplicate (128 pb)
⇒ représentation de la quantité d’ADN maternelle
3- PCR d’un ADN traceur (Maïs) en temps réel (TaqMan)
⇒ Validation de l’étape d’extraction
Tous les résultats doivent être confirmés sur un 2ème prélèvement réalisé plus
tard au cours de la grossesse.
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineGENOTYPAGE KEL1 FOETAL
INDICATION
-Risque d’anémie fœtale sévère fonction du
Femme immunisée titre de l’anticorps anti-KEL1 maternel et l’âge
anti-KEL1 gestationnel : risque d’anémie fœtale sévère
dès 16 SA
-Surveillance clinique spécifique démarrée à
partir d’un titre supérieur au 1/32 (50 % des
patientes)
- Réalisation à partir de 13 SA
- Proposé lorsque titre en anti-KEL1 > au 1/32
- Conjoint hétérozygote KEL1/KEL2
Fœtus KEL1 + Fœtus KEL1 - Besoins:
Incompatibilité fœto- - certitude des positifs
maternelle exemption de
- certitude des négatifs
légitime surveillance surveillance
- diagnostic précoce
lourdeDIAGNOSTIC ET SUIVI BIOLOGIQUE
EN PRATIQUE
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineANTICORPS
DANS LES CAS D’ANEMIE FŒTALE SEVERE
Anti-D (RH1) Anti-c (RH4) Anti-Kell (KEL1)
Détection 1er trimestre. Tjs au 1er Tjs au 1er
parfois limite trimestre trimestre
de détection Titre en TIA
d’emblée très
élevé
GR test Détection Détection très Aucun intérêt
enzymatique facilité facilité
Pièges Confusion Titre en TIA Agglutination
anti-D passif souvent faible parfois faible
Réactivation non prédictif Grande variabilité
fréquente d’une atteinte du titrage inter-
sévère laboratoire
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineDIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE
Schéma de Titrage- Dosage
Anti-RH1 Anti-RH4 Anti-Kell Anti-RH3 Autres
Dosage / + sur GR + sur GR + sur GR NON
Titrage de natifs natifs natifs
référence
Dosage ≥1/8 ≥1/4 NON ≥1/8 NON
pondéral sauf public
RH2 RH5
Réactivat° Fréquente Fréquente Rare Rare Rare
ts trim ts trim 3ème trim 3ème trim 3ème trim
Fréquence 2 sem 2 à 4 sem Tous les 6è, 7è et 8è 3è et 8è
dosages mois mois mois
Taux 250 UCHP 500 UCHP 1/32 700 UCHP
critiques titre≥1/4 titre≥1/8
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineDépistage et surveillance des incompatibilités foetomaternelles
au cours de la grossesse
RAI positive
Identification
Anti-RH1, anti-RH4, anti-RH3, Anti-FY1, FY2, Anti-JK1, Anti-LE1, LE2, Anti-P1,
Anti-KEL1 Anti-JK2, Anti-MNS3, Anti- Anti-H, Anti-HI, auto-
MNS4, Anti-MNS1, Anti-RH2 anticorps froid, auto-
papaïne
Risque d’anémie fœtale sévère in Risque de maladie
Pas de risque de
utéro hémolytique postnatale
maladie hémolytique
1- Phénotyper procréateur 1- Phénotyper procréateur
Si phéno-incompatible : Si phéno-incompatible :
2- Génotypage fœtal 2- Titrage et dosage pondéral
3- Titrage et dosage pondéral à 3 et 8 mois Pas d’examen
toutes les 2 à 3 semaines complémentaire
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineGrossesse avec allo-immunisation anti-RH1
Schéma de prise en charge
RAI positive au premier trimestre
Identification = Anti-RH1
Génotypage RHD fœtal sur sang maternel Titrage ET Dosage
à partir de 12 SA
Si fœtus RHD négatif Si fœtus RHD positif
sur 2 prélèvements
Anti-RH1 < 1 µg/ml Anti-RH1 > 1 µg/ml
Surveillance levée (250 UCHP/ml)
- Surveillance échographique standard - Surveillance hebdomadaire dès 18 SA
- Dosage + titrage anti-RH1 tous les 15 écho + vélocimétrie doppler
jours à partir de 18 SA - Dosage + titrage anti-RH1 tous les 15 jours à
partir de 18 SA
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineGrossesse avec allo-immunisation anti-KEL1
Schéma de prise en charge
RAI positive au premier trimestre
Identification = Anti-KEL1
Génotypage KEL fœtal sur sang maternel Titrage
à partir de 13 SA
Si fœtus KEL1 négatif sur Si fœtus KEL1 positif
2 prélèvements sur 2 prélèvements
Surveillance levée Anti-KEL1CAS CLINIQUES
PROBLEME DE SUIVI DES
PATIENTES RH:-1
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineMme L. RH1 négatif, 2ème geste
Un accouchement à terme 8 ans auparavant. A reçu sa prophylaxie rhésus du post-partum
• 8 SA : Première RAI dans un laboratoire privé ⇒ RAI positive ⇒ laboratoire centralisateur:
identification anti-RH1 et titrage au ⇒ CNRHP biologique: titrageMme L. RH1 négatif, 2ème geste
110
• 37 SA: consultation hebdomadaire 100
systématique 90
80
– anomalies du RCF
70
PSC (cm/s)
– accélération de la vitesse cérébrale 60
⇓ 50
• Extraction par césarienne en urgence 40
d’un petit garçon 30
– Bonne adaptation mais pâle et jaune 20
avec hépatosplénomégalie; 10
– Au cordon: 0
16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
• Bili: 84 µmoles/l ;
âge gestationnel (SA)
• Hb: 9 g/dl avec 350 000
réticulocytes/mm3
⇒ Transfusion CGR à J0 et photothérapie
intensive
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineMme M. RH1 négatif, 3ème geste
Une grossesse 14 ans auparavant, et une fausse couche
• 7 SA: RAI négatives mais métrorragies ⇒ injection Rhophylac® 200
• 11 SA: métrorragies
– ⇒ RAI + injection N°2 de Rhophylac® 200
– ⇒ RAI positives ⇒ CNRHP: identification anti-RH1 et microtitrage :6-
12ng/ml; µtitrage compatible avec l’injection à 7 SA
• 13 SA et 18 SA: RAI positives ⇒ EFS X: anti-RH1 « résiduel »
• 25 SA: RAI positives ⇒ Laboratoire centralisateur: anti-RH1 identifié de
titreMme M. RH1 négatif, 3ème geste
• 32 SA: Consultation à la maternité pour
« Cholestase gravidique »
– Anomalies du RCF sur J1
– Anasarque sur J1 avec accélération
des vitesses cérébrales
⇒ Extraction en urgence
• Deux jumelles anémiques et ictèriques
avec mauvaise adaptation et détresse
respiratoire
– J1→ Hb:2,9g/dl et bili:100µmoles/l ⇒
TNN+EST
– J2 → Hb:7,9g/dl et bili:120 µmoles/l
⇒ EST
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineECHEC DE LA PRISE EN CHARGE D’UNE FEMME
ENCEINTE IMMUNISEE
• Obstétricien n’avait aucun moyen de mettre en doute le résultat
donné par le laboratoire, pas de connaissance sur :
techniques à réaliser
sensibilité des techniques
transmission des examens à laboratoire de référence
ROLE DU BIOLOGISTE EST ESSENTIEL
• RAI positive dans un contexte d’injection d’IgRHD
Erreur d’interprétation : anti-D faussement étiqueté comme
passif résiduel
Seul le dosage des anti-RH1 permet de se prononcer
INTERET DU MICROTITRAGE
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineCAS CLINIQUES
PROBLEME DE SUIVI DES
PATIENTES RH:1
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineMme A. RH1 positif
• DDG : fin juin 2013
• Pas de RAI au 1er trimestre
• 37 SA ½ : 12/03/14
RAI positive, identification d’un Anti-RH4 (Labo CH)
1er titrage/dosage envoyé au CNRHP
Titrage : saline 1/16 TCI 1/32
Dosage pondéral : 2 temps : 8360 UCHP/ml
1 temps : 2680 UCHP/ml
• Alerte le 18/03/14 par le CNRHP biologique 17H00
• Césarienne en urgence le 18/03/14
A Mailloux,, CNRHP, Hôpital St Antoine Région Ile de France⇒ Naissance en urgence sans information pédiatrique ni anticipation
transfusionnelle d’un enfant avec une anémie hémolytique sévère
3100g
Groupe : O DCcee Kell neg
TCD 4+ (QI pour l’élution avant la transfusion)
Au cordon: bilirubine totale 69 µmol/L, Hb 5,5g/dL
- J0 ⇒ Transfusion (⇒
⇒ 14,5 g/dL)
- J0 ⇒ Photothérapie intensive dès H6
- J1 ⇒ Perfusion d’albumine
- J2 ⇒ IgIV pour éviter EST
- J 3 ⇒ Photothérapie en discontinu
Immunisation connue en 2007 anti-RH4
Dosage pondéral : 2 temps : 60
1 temps :Mme G. RH1 positif
• DDG : en août 2013
• Pas de RAI pendant la grossesse
• 35 SA fin mars 2014 : MFIU
RAI positive : identification d’un anti-RH4 + anti-RH3 (EFS X)
31/03/14 : prélèvement envoyé au CNRHP :
Titrages : Anti-RH4: saline• Réception des sérothèques de Toxoplasmose pour dosages pondéraux
rétrospectifs :
• 7 prélèvements
Date Titre Titre TCI 2 temps 1
saline temps
21/08/13Mme M. RH1 positif
•DDG : mi-octobre 2012
•28 SA : RAI positives 24/04/13
laboratoire privé Laboratoire centralisateur
Identification : anti- RH4, Titrage• Mauvaise adaptation initiale transfert Hôpital X
Anémie à 5g/dL et détresse respiratoire sévère transfert en
réanimation dans nouvel Hôpital Y
J0 : Transfusion en urgence vitale immédiate en O RhD neg car la
mère n’a pas le même nom que l’enfant et absence de notion de RAI chez
la mère.
• RAI de l’accouchement du 09/07/13: anti-RH4 identifié à l’EFS X prévient
l’Hôpital Y mais la 1ère transfusion a déjà eu lieu.
• 11/07/13 : 1er prélèvement CNRHP : anti-c (RH4)
Anti-RH4 : Titrage 1/16
Dosage pondéral : 2 temps : 1650 UCHP/ml
1 temps : 1000 UCHP/ml
• Absence de surveillance adaptée d’une immunisation anti-RH4.
• Retard à la prise en charge adaptée à la maladie hémolytique.
• Absence de connaissance de cette femme au niveau des EFS régionaux
délivrant les produits : conséquences transfusionnelles pour l’enfant.
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineSUVI IMMUNO-HEMATOLOGIQUE
DE LA FEMME ENCEINTE
• Diagnostic des IFM : purement biologique
• Pathologie rare dépistable si respect du calendrier des RAI
• Diagnostic biologique spécialisée : Existence d’un Centre de
Référence avec une biologie et une clinique périnatale de
référence
- Biologie donne l’alerte pour le déclenchement d’un
suivi spécifique
- Interactions étroites entre
biologiste / biologiste de référence / clinicien
A Mailloux, CNRHP, Hôpital St AntoineVous pouvez aussi lire
