Dévelopement de traitements pour la Dystrophie Musculaire de Duchenne - Jacques P. Tremblay - Jesse's Journey

Dévelopement de traitements pour la
Dystrophie Musculaire de Duchenne

           Jacques P. Tremblay

     Centre de Recherche du CHU de Québec
                 Université Laval
                Québec, Canada

La Dystrophie Musculaire de Duchenne est
due à l’absence de la protéine dystrophine

      Muscle sain         Muscle DMD

Pour bien comprendre les
 diverses thérapies que les
   chercheurs essaient de
développer, il faut des notions
   de biologie cellulaire et
        moléculaire.

Muscle fibers contain
 hundreds of nuclei
                  Nuclei

                                                      Nuclei

Longitudinal section                   Transverse section

                           https://neuromuscular.wustl.edu/pathol/centnucl.htm

Each of these nuclei
contain DNA coding for
       proteins
                                 Nucleic acids are in pairs:
                                 A-T, T-A, C-G or G-C

                                     A gene is a sequence
                                     of nucleic acids

       https://socratic.org/questions/how-do-nucleic-acids-control-protein-synthe

Génome humain 3.2
milliards de nucléotides

         La recette au complet
         3.2 milliards de
         nucléotides

         145 dictionnaires Larousse!

Exon = séquence d’ADN qui code pour une partie de protéine
Intron = séquence non codante

                                        Un gène est
                                        constitué de
                                       un ou plusieurs
                                           exons.

Le génome humain contient
       20000 gènes
 Ce sont des codes pour produire des protéines qui
  constituent nos cellules et qui sont responsables des
  activités cellulaires.

Homo sapiens frataxin (FXN)
   RefSeqGene on chromosome 9
NCBI Reference Sequence: NG_008845.2
          71616 nucléotides

Le gène de la dystrophine
 2.3 M de paires de base

 1/10 d’un dictionnaire Larousse

Pour produire une protéine à
         partir de l’ADN
     il faut d’abord faire
    un ARN messager.

Dans l’ARN l’uracile
remplace la thymine

L’ARN de la dystrophine
   contient 2,100,000
      nucleotides.

Ça prend 16 heures pour
   produire cet ARN!

Les protéines sont faites
par 21 acides aminés
différents.

Les changements (mutations)
de l’ADN sont responsables des
      maladies héréditaires
  Différentes sortes de mutations
  1) Mutation ponctuelle
    un seul nucléotide est changé
  2) Délétion
    un nucléotide
    jusqu’à des milliers de nucléotides
  3) Insertion
    un nucléotide
    jusqu’à des milliers de nucléotides

Mutation ponctuelle

Mutations
     dans les patients DMD
 1) 70% des délétions d’un ou plusieurs exons
 2) 30% changement d’un ou plusieurs nucléotides

C

  G

Pro

Codon     Codon d’arrêt
d’arrêt

Codon CAA   Codon UAA

  C A A        U A A

              Arrêt
  C U U

   Glu

MALADIES DONT LA TRANSMISSION LIÉE AU SEXE

       UNION ENTRE UN HOMME SAIN
       ET UNE FEMME PORTEUSE

       -1/4 d’avoir un garçon porteur du gène malade:
             - sujet atteint
       -1/4 d’avoir un garçon non porteur du gène malade
       - 1/4 d’avoir une fille porteuse du gène malade
       - 1/4 d’avoir une fille non porteur du gène malade

La protéine dystrophine est complexe:
        24 répétitions de type spectrine
Matrice extracellulaire

  Double couche
    lipidique

   Actine                     Dystrophine

                          Actine
Cytoplasme de la fibre
     musculaire

                                            23

Le gène de la dystrophine
            contient 79 exons
           14,000 nucléotides

Code pour la protéine dystrophine: 3685 acides aminés

Traitements
             pharmacologiques
              xxx à compléter
Ataluren (Translarna)
     -permet de passer outre à un codon d’arrêt
     -possible pour 10-15% des patients
Tamoxifen
Idebenone
Vamorolone
     nouveau stéroïde
Edasalonexent
     NF-kB inhibitor
Givinostat
Anti-myostatin

Traitement 1: La transplantation de myoblastes
Traitement possible pour toutes les mutations

                   Essai clinique de phase I
                   26% des fibres musculaires ont exprimé
                   la dystrophine dans un muscle de DMD
                   1 mois après la transplantation
                   de myoblastes normaux
                       collaboration avec Dr. Bouchard

                   Nous commençons un essai clinique Phase I/II
                   En collaboration avec
                       Dr. Craig Campbell (London)
                       Dr. Jack Puymirat (Quebec)

70% des cas de Duchenne sont dus à une délétion
d’un ou plusieurs exons conduisant à un décalage
 du cadre de lecture et à l'absence d'une protéine
                   dystrophine

Sujet normal

          Délétion de l’exon 50

                                  Codon d’arrêt

 Patient DMD
          L'exon 50 supprimé ne contient pas
          un multiple de 3 nucléotides.           27

Dystrophie de Duchenne:
délétion de un ou plusieurs exons
    change le cadre de lecture

               La délétion de l’exon 50 n’est
               pas un multiple de 3 nucléotides:
               changement du cadre de lecture

Dystrophie de Becker:
délétion de un ou plusieurs exons
ne change pas le cadre de lecture

            La délétion est un
            multiple de 3 nucléotides:
            pas de changement du cadre de lecture

Traitement 2: le saut de 1 ou plusieurs
 exons permet de rétablir le cadre de
  lecture pour un patient Duchenne

                                             Saut de l’exon 51

L’exon 50 contient 109 nucléotides.
L’exon 51 contient 233 nucleotides.
Le saut de l’exon 51 fait en sorte que la délétion totale est 342 nucléotides
un multiple de 3 nucléotides

Des oligonucléotides chimiquement
modifiés permettent le saut d’exon
 Sarepta therapeutics a développé deux produits COMMERCIALISÉS
     Exondys 51 TM : eteplirsen

    Vyondys 53 TM : golodrisen

 Ces médicaments doivent être pris de façon répétitive
 Coût annuel: XXX
 Effectif pour 30% des patients DMD
 Le niveau de dystrophine exprimé est faible et n’est peut-
  être pas suffisant pour ralentir la progression de la
  maladie

 Ces médicaments ne sont pas disponibles au Canada

Traitement 3: livraison du gène
    de la micro-dystrophine
          par un AAV

Virus Associé à l’Adénovirus
           (AAV)
                            20 nm

              Ne peut contenir que 4,800 nucléotides

Production des AAVs
dans des bioréacteurs

La thérapie génique est un
    traitement possible
   pour de nombreuses
  maladies héréditaires

Exemples de succès
    de la thérapie génique
        chez l’humain
Immunodéficience (ADA-
SCID)
  enfants bulles
  traitement avec des cellules
  souches hématopoïétiques
  corrigées génétiquement

Exemples de succès
  de la thérapie génique
      chez l’humain
L’Amaurose congénitale de
Leber
  cécité héréditaire
  affecte une personne sur 80,000
  injection d’un AAV codant pour
  RPE65 dans l’oeil
  rétablissement de la vue

Les AAV ne peuvent contenir
   que 4800 nucléotides
 La dystrophine contient 3,685 acides aminées.
 Ça prend 3 nucléotides pour coder chaque acides
  aminées

 Donc ça prendrait 11,055 nucléotides
 Trop de nucléotides pour un AAV
 Il faut donc faire une micro-dystrophine
 Quelles parties de la dystrophine peut-on enlever?

Micro-dystrophine
 1990: Le concept d’une mini ou micro-dystrophine
 2018: injection systémique d’AAV codant pour la micro-
  dystrophine

Différentes versions de la micro-dystrophine

Différentes versions de la micro-dystrophine
             en essais cliniques

Résultats préliminaires de l’essai clinique
         conduit par Dr. Mendell
              et Sarepta Inc.
 19/6/2018
 La micro-dystrophine a été détectée dans les fibres
  musculaires

 Réduction de la créatine kinase
 Pas d’effets adverses sévères

3 essais cliniques en cours
 Sarepta Inc.
 Solid biosciences Inc.
   la micro-dystrophine permet l’attachement de nNOS

 Pfizer Inc.

Traitement 4: modification
du gène de la dystrophine
   avec la technologie
        CRISPR

Le système CRISPR
 Clustered Regularly Interspaced Short-Palindromic
  Repeat

 Un système utilisé par certaines bactéries pour
  s’immuniser des infections par des phages.

Le système CRISPR

           ADN
        génomique

                                Séquence ciblée

                                   ARN guide

https://www.mirusbio.com/applications/genome-editing-using-crispr-cas/overview

CRISPR system

https://www.mirusbio.com/applications/genome-editing-using-crispr-cas/overview

Dr. Olson utilise le système CRIPSR pour modifier le
  début de l’exon 51 pour l’enlever pour rétablir le
     cadre de lecture pour un patient Duchenne

                                              Saut de l’exon 51

 L’exon 50 contient 109 nucléotides.
 L’exon 51 contient 233 nucleotides.
 Le saut de l’exon 51 fait en sorte que la délétion totale est 342 nucléotides
 un multiple de 3 nucléotides

La structure de la protéine
dystrophine est importante

Approche dans mon laboratoire:
    formation de l’exon hybride 47-58
 Expérience avec les souris hDMDΔ52:
   formation de l’exon hybride 47-58 in vivo

                       X

                                                Duchêne et al.
                                                Mol Ther 2018

Correction of the dystrophin gene
      with CRISPR/Cas9 technology
 Experiment in hDMDΔ52 mice:
   formation of hybrid exon 47-58 in vivo

                       X

                                             Duchêne et al.
                                             Mol Ther 2018

Injection intraveineuse d’AAV codant
   pour SaCas9 et 2 ARN guides
    à des souris hDMDdelta52

H e·art
  1
          Diiaphragm   Gastronemius   Quadriceps   Abdominal
                                                    muscle

Intravenous injection of AAV
          coding for SaCas9 and 2 sgRNAs
                to hDMDdelta52 mice

H e·art
  1
              Diiaphragm   Gastronemius   Quadriceps   Abdominal
                                                        muscle

Nouveaux progrès de la technologie CRISPR:
        édition   d’une seule base!
           (red immunohistochemistry)

         59

C

  G

Pro

Codon CAA   Codon UAA

  C A A        U A A

              Arrêt
  C U U

   Glu

La technologie ‘PRIME editing’ dérivée de CRISPR
   permet la modification d’un seul nucleotide.
            Anzalone Nature Oct 2019

     La protéine Cas9 est fusionnée avec une transcriptase inverse.
     Un pegRNA spécifie quel est le nucléotide à changer!

Plusieurs mutations
    d’un seul nucleotide
sont responsables de la DMD

Ces mutations peuvent être corrigées par
 une variante de la technologie CRISPR
        appelée PRIME editing.

                       Correction
                       of mutation
                           CC
                       by PRIME editing

Projet subventionné par
         Jesse’ journey
 Correction de 29 mutations ponctuelles observées
  dans des patients DMD canadiens

Cette nouvelle technologie va
permettre en principe de corriger
   des mutations ponctuelles
 responsables de 7000 maladies
         héréditaires !!!

FIN

Autres sujets
 Utrophine
 Base editing

Plusieurs milliards
    de cellules
 chez un humain

Reticulum
                         endoplasmique   Noyau
        Microfilamment                      Complexe de Golgi

         Mitochondrie

            Lysosome
                                                     Nucleole
         Chromatine

  Reticulum
endoplasmique                                    Microtubule
      Vésicule                              Membrane

1 mm = 1000 μm
1000 μm   Une cellule = 40 μm

L’ADN est une longue hélice double
brin formée de 4 nucléotides
  A: adénine
  T: thymine
  C: cytosine
  G: guanine
Le génome humain est fait de
3.3 milliards de nucléotides:
un long fil de 30 mètres dans
un petit noyau de 10 microns!

Permet la reproduction du code
génétique durant la division cellulaire