Guide de l'utilisateur: Technologie de séquençage Pacific Biosciences - Centre d'expertise et de services Génome Québec
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MARCH 5, 2020
SERVICES DE SÉQUENÇAGE DE NOUVELLE GÉNÉRATION
Centre d’expertise et de services Génome Québec
Guide de l’utilisateur:
Technologie de séquençage
Pacific Biosciences
Version 5.1
© Copyright 2020 Centre d’expertise et de services Génome Québec
Tous droits réservés.
Table des matières
TABLE DES MATIÈRES ...................................................................................................... 2
DIRECTIVES GÉNÉRALES POUR LA PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS D’ADN ................ 3
CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES .................................................................................................... 3
SÉQUENÇAGE AVEC LA TECHNOLOGIE SMRT DE PACIFIC BIOSCIENCES .................................................... 4
CONSIDÉRATIONS IMPORTANTES SUR LA QUALITÉ DE L'ADN................................................................. 4
DIRECTIVES POUR LES AMPLICONS AVEC CODES À BARRES ................................................................... 7
QUANTITÉ D'ÉCHANTILLONS D'ADN À FOURNIR ................................................................................ 7
DÉTAILS POUR LA SOUMISSION ET L’ENVOI D’ÉCHANTILLONS ....................................... 8
FORMULAIRE DE DEMANDE DE SERVICE ET SOUMISSION D’ÉCHANTILLON (NOUVELLE DEMANDE) : ..................... 8
FORMULAIRE DE DEMANDE DE SERVICE ET LA SOUMISSION DE L'ÉCHANTILLON (REQUÊTE) .............................. 8
FORMATS REQUIS POUR L’ENVOI DES ÉCHANTILLONS D’ADN ................................................................ 8
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR ENVOI .............................................................................. 10
ADRESSES POUR L’ENVOI DES ÉCHANTILLONS ................................................................................ 11
PLAN D’ACCÈS DU CENTRE D’EXPERTISE ET DE SERVICES GÉNOME QUÉBEC ............................................. 12
2Directives générales pour la préparation des
échantillons d’ADN
Considérations générales
Les recommandations indiquées dans ce document ont pour but de vous permettre
d'obtenir des résultats de séquençage de la plus haute qualité possible et dans les
meilleurs délais. Tous les échantillons qui ne se conforment pas à ces recommandations
peuvent être refusés sans compensation.
Lorsque vous soumettez des échantillons d’ADN pour les technologies de séquençage nouvelle génération,
il est recommandé de:
• fournir des échantillons de la plus grande qualité et pureté possible. L’ADN de haut poids
moléculaire est idéal pour des librairies avec de longs inserts (pic ≥45 kb).
• L’ADN doit être éluée dans une solution neutre et tamponnée (par exemple : Tris 10 mM, pH 7.0
- pH 8.0). Ne pas utiliser d'eau (sans nucléase) ou des solutions non-tamponnées, car cela est
insuffisant pour la stabilisation de l'ADN à long terme. Évitez les tampons contenant de l'EDTA
pour prévenir une inhibition enzymatique au cours de la préparation de la librairie.
• ne pas resuspendre l'ADN dans des tampons contenant des détergents (ex. SDS) ou autres additifs
qui pourraient inhiber des réactions enzymatiques lors de la préparation de la librairie et/ou la
réaction de séquençage.
• Si vous soumettez des produits PCR : ils doivent être purifiés, sans produits non-spécifiques ou
bandes multiples.
• mesurer la concentration d’ADN en utilisant la méthode PicoGreen ou Qubit. Le Nanodrop ou
autres méthodes spectrophotométriques ont tendance à surestimer la concentration des
échantillons, rendant la quantité de matériel de départ inadéquate.
• s'assurer que la quantité et la concentration correspondent aux valeurs spécifiées dans la section
Quantité d'échantillons d'ADN à fournir.
• mesurer de façon précise les volumes d'échantillons contenus dans chaque puits et indiquer ces
valeurs dans le Formulaire de demande de service.
L'identification de chaque échantillon doit correspondre exactement à ce qui est indiqué dans le
Formulaire de demande de service.
Toute correspondance écrite concernant les services en cours ou complétés doit référer au numéro de
soumission (commençant par "SCI...") ou au nom du projet Nanuq.
3Séquençage avec la technologie SMRT de Pacific Biosciences
Contrairement aux autres technologies de séquençage nouvelle-génération, la technologie de Pacific
Biosciences (PacBio) Single Molecule Real Time Sequencing (SMRT) ne requiert pas d'amplification lors de
la préparation de la librairie. Pour cette raison, la qualité de l'ADN de départ aura une influence directe sur
la qualité des résultats de séquençage. Tout dommage à l'ADN génomique (présence de coupures
sur un brin, de sites abasiques, de bases modifiées ou de "crosslinks") pourrait nuire au
séquençage avec cette technologie. Si vous avez des petits plasmides ou petits éléments extra-
chromosomiques dans vos échantillons, SVP noter qu’ils pourraient être sous-représentés ou peuvent
même ne pas être détectés avec la technologie PacBio puisque la préparation de la librairie cible les
fragments de ~ 20kb.
Considérations importantes sur la qualité de l'ADN
Afin de maximiser la taille de lecture et la qualité des séquences, il est recommandé que l'ADN:
• est sous forme double-brin puisque l'ADN simple-brin n'est pas compatible avec le processus de
préparation de librairies.
• n'a pas subi plusieurs cycles de gel-dégel.
• n'a pas été exposé à de hautes températures (ex., >37 °C pendant 1 heure peut causer une
baisse détectable de la qualité des séquences) ou à des pH extrêmes (< 6 ou > 9). Il est préférable
de sécher les culots à l’air libre plutôt qu’un séchage thermique. Évitez de sursécher l'ADN
génomique. Ne pas chauffer lors du séchage dans un speed-vac.
• a un ratio DO260/DO280 de 1.8 à 2.0.
• ne contient pas de particules insolubles.
• ne contient pas d'ARN.
• n'a pas été exposé à des agents intercalants ou à des rayons ultraviolets.
• ne contient pas d'agents chélateurs (ex., EDTA), d'ions métalliques (ex., Mg2+), d'agents
dénaturants (ex., sels de guanidinium, phénol), ou de détergents (e.g., SDS, Triton-X100).
• ne contient pas de contamination provenant du tissu dont il a été extrait (hème, acide humique,
polyphénols, polysaccharides, etc.).
Avant l’extraction d’ADN:
• Éviter l’incubation dans des milieux complexes ou riches.
• La récolte de plusieurs cultures (réplicats) au début/milieu de la phase logarithmique de
croissance est préférable.
• L'extraction de petits volumes est préférable à de grandes quantités afin d'éviter
l'accumulation de fortes concentrations de composants secondaires potentiellement
inhibant.
•
4Options pour l’extraction d’ADN:
• Qiagen® DNeasy kits
• MoBio® UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit
• Promega Wizard Genomic DNA Purification kit
• Qiagen® MagAttract® HMW kit (100-200 kb) (Product Information)
• Qiagen Genomic-tip kit (50-100 kb) (Product Information)
• Qiagen Gentra® Puregene® kit (100-200 kb) (Product Information)
• extraction Phenol-chloroform (PacBio SampleNet Protocol)
Assurez-vous que le phénol est frais et non oxydé; utilisation dans les trois mois suivant
l'ouverture du flacon.
Indications pour l’extraction et la purification de l’ADN:
• Si une purification par gel est nécessaire, éviter d'utiliser des méthodes de visualisation
basées sur le bromure d’éthidium ou l’UV. Une alternative est d'utiliser le SYBR ® Safe
(Invitrogen) et de visualiser avec une lumière bleue.
• Pour aider la resuspension de l'ADN, inverser soigneusement le tube plusieurs fois après
l'ajout du tampon et/ou tapoter le tube doucement. Éviter, si possible, le vortex pour
mélanger l’ADN génomique car cela peut provoquer la fragmentation de l'ADN. Il est
également recommandé d'utiliser des embouts à pointe large durant la manipulation des
échantillons.
• Alternativement, laisser l’ADN se resuspendre dans le tampon à 25 °C durant la nuit.
• Une surchauffe peut introduire des dommages à l'ADN. Inactiver la DNAase tel que
recommandé par le fournisseur. Il est préférable d'éviter l'inactivation par la chaleur lorsque
possible. Une alternative est la purification par billes AMPure ®.
• Conditions d'entreposage de l’ADN: 4 °C (à court terme); -20 °C / -80 °C (long terme).
Recommandations pour la purification de l’ADN si la présence de réactifs résiduels de l’isolement
de l’ADN génomique est soupçonnée :
• Purification de l'ADN avec les billes AMPure ® (recommandation par défaut pour tous les
utilisateurs).
❖ Assurez-vous qu'il n'y a pas de billes résiduelles avec les échantillons. Cela inhibera
les enzymes utilisées dans les étapes ultérieures et affectera en particulier la liaison
de la polymérase, étape critique pour une lecture des séquences de qualité.
• DNeasy PowerClean Pro Cleanup Kit (pour les échantillons fortement contaminés) (Product
Information)
❖ Certaines modifications apportées au protocole sont proposées pour maintenir l'ADN
à un haut poids moléculaire et minimiser les dommages: voir le document PacBio
Guidelines - SMRTbell Libraries v1.0.pdf
❖ AVERTISSEMENT: la récupération de l'ADN est faible suite à cette procédure,
l'utiliser si nécessaire. Un échantillon d'ADN génomique de 10 µg par colonne résulte
en une récupération de 30-50%. Un échantillon pour lequel la quantité de départ
est inférieure se traduira par une meilleure récupération, tandis qu'une quantité de
départ supérieure résultera en une récupération inférieure.
5• PacBio recommande le protocole de nettoyage au phénol-chloroforme à haut sel pour les
échantillons susceptibles d'être contaminés en raison des caractéristiques de couleur
inhabituelles de l'échantillon ou en cas de contamination par des polysaccharides.
6Directives pour les amplicons avec codes à barres
Un ensemble de 384 codes à barres, chacun composé de 16 pb, est conçu sur mesure pour le système
PacBio. En ajoutant ces codes à barres aux amorces PCR, les utilisateurs peuvent effectuer un
séquençage parallèle ou multiplex en utilisant SMRT Analysis v1.4 ou une version ultérieure. Cet
ensemble de codes à barres est conçu pour une discrimination optimale avec la technologie SMRT
Sequencing.
Reportez-vous au document PacBio Barcodes for SMRT Sequencing pour plus d'informations sur le
design des amorces PCR avec codes à barres.
Quantité d'échantillons d'ADN à fournir
Les échantillons ayant des valeurs de concentrations inférieures à celles indiquées dans le tableau
doivent être concentrés par le client. Le volume minimal acceptable par échantillon est de 30 µL. Le
volume maximal ne doit pas dépasser 100 µL car c'est la limite supérieure pour certains protocoles
de fragmentation de l'ADN.
Si le volume est inférieur à 30 µL, le Centre d'Innovation se réserve le droit de diluer
l'échantillon au volume requis ou de refuser l'échantillon. Si le volume de l'échantillon est
supérieur à 100 μl, il y aura un supplément pour la concentration de l'échantillon.
Tableau 1. Quantités d'ADN requises pour la construction des librairies PacBio
Source d'Acide
Type de librairie Quantité (µg) Concentration (ng/µL)
Nucléique
Fragments courts:
ADNg, ADNc,
Séquence circulaire ≥2 µg ≥50 ng/µL
amplicons
consensus (CCS)
Standard: ≥6 µg ≥50 ng/µL
ADNg Fragments longs (~20kb) Multiplex: ≥4 µg
chacun Idéalement: 150-200 ng/µL
L’ADN doit être haut poids moléculaire et de qualité élevée.
Le client sera informé des résultats du contrôle qualité et pourra soumettre des échantillons de
remplacement.
Les remplacements doivent avoir la quantité totale requise. Les remplacements partiels (« top-ups »)
seront refusés.
Des frais supplémentaires de QC s'appliqueront à chaque échantillon de remplacement.
Le client peut décider de procéder avec une quantité sous-optimale d'échantillon, mais accepte les risques
inhérents.
Pour des détails supplémentaires, voir le document PacBio Guidelines - SMRTbell Libraries v1.0.pdf
7Détails pour la soumission et l’envoi d’échantillons
Formulaire de Demande de service et soumission d’échantillon (nouvelle
demande) :
Les nouvelles fonctionnalités du Formulaire de Demande de services sont utilisées pour les nouveaux
projets seulement.
• Connectez-vous à votre compte Nanuq ici.
• Dans la section Requête, cliquez sur Ajouter une nouvelle requête et suivez les instructions.
• Ne pas utiliser le bouton retour de votre navigateur pour revenir aux pages précédentes.
Utilisez le menu sur le côté gauche de l'écran.
• Le Formulaire de Demande de service est terminé lorsque le bouton « Soumettre » est utilisé,
sinon, son statut restera comme Brouillon.
• Les nouvelles Requêtes incomplètes seront accessibles lors des futures sessions, en utilisant
Liste de requêtes.
• Le travail en laboratoire ne débutera que lorsque tous les documents requis sont fournis.
Formulaire de demande de service et la soumission de l'échantillon (Requête)
• Connectez-vous à votre compte Nanuq ici.
• Dans la section Requête, cliquez sur Liste des requêtes.
À utiliser lorsque:
1) De nouveaux échantillons ou des remplacements d’échantillons sont soumis dans le cadre
d'un projet existant.
2) Pour continuer à entrer de nouvelles informations dans une requête en cours (brouillon).
• Pour soumettre de nouveaux échantillons, allez à la section Soumission d'échantillons.
De là, vous pouvez:
- Télécharger des fichiers modèles vides pour soumettre de nouveaux échantillons.
- Réviser les soumissions d'échantillons précédentes.
- Ajouter des commentaires au sujet de vos échantillons.
Ne pas ajouter de nouveaux échantillons ou des remplacements d’échantillons dans un fichier
existant.
Ne pas utiliser le bouton retour de votre navigateur pour revenir aux pages précédentes. Utilisez le
menu sur le côté gauche de l'écran.
Formats requis pour l’envoi des échantillons d’ADN
Les échantillons pour du séquençage sur PacBio peuvent être soumis en tubes de 1.5ml si vous soumettez
seulement quelques échantillons (Seulement deux types de plaques sont acceptés:
• Eppendorf twin.tec, Full Skirt, Cat# 951020401 ← PREMIER CHOIX
• Corning Thermowell GOLD, Full Skirt, Cat# 3752 ← SECOND CHOIX
Nous recommandons les films adhésifs suivants (si vous utilisez un scellant en aluminium, assurez-
vous de prendre les précautions nécessaires pour qu'il ne soit pas accidentellement percé lors du
transport par déplacement de contenu ou pression externe, surtout si plusieurs plaques sont
empilées):
• Life Technologies MicroAmp® Clear Adhesive Film, Cat# 4306311
• VWR Aluminum Foils for PCR and Cold Storage, Cat# 60941-074
Nous pouvons fournir ces plaques et scellants sur demande. SVP informez-vous auprès du Bureau de
Gestion des Clients lors de la soumission de la documentation.
Les échantillons provenant de plusieurs projets ne doivent pas être combinés dans une seule plaque.
Une plaque différente doit être utilisée pour chaque projet. Toutes les plaques devraient être identifiées
clairement avec le numéro de soumission, le nom du chercheur principal (PI) et la date d'envoi.
9Préparation des échantillons pour envoi
• Les envois doivent inclure une copie du bordereau d’expédition de la Demande de service.
• N'envoyez que des aliquots de vos échantillons. Ceux-ci seront conservés pendant environ 6
mois après que le service demandé ait été complété et seront détruits par la suite à moins
que le client ait mentionné au Bureau de Gestion des Clients son désir de les ravoir. Les frais
d'expédition encourus seront la responsabilité du client.
• Les plaques ou tubes devraient être scellées dans un sac de type Ziploc. Si vous envoyez de
nombreux tubes, ils ne doivent pas être simplement libres dans un sac, mais doivent être bien
organisés dans un rack ou une boîte.
• Portez une attention particulière afin que les plaques/tubes contenant les échantillons ne soient
pas écrasés durant le transport.
• Les échantillons peuvent être amenés directement au Centre, mais ces envois devraient être
coordonnés avec le personnel autorisé avant la livraison.
• Les échantillons devant traverser la frontière canadienne devraient être envoyés en début de
semaine puisque des délais aux douanes sont fréquents. Toutes les documentations requises
doivent être incluses avec le colis. L'utilisation de phrases claires telles que: “Non-biohazardous
biological sample”, “Purified DNA from [species]”, “For research use only”, et “Of no commercial
value” aidera à accélérer le dédouanement, évitant ainsi des délais qui auraient pu être évités et
des risques de dégradation des échantillons.
• Si l'expédition est faite à partir du Canada: expédition de nuit ou le jour même sur Ice-Pack si
l'échantillon n'est pas déjà congelé (minimiser les cycles de gel-dégel), sinon, si l'échantillon est
déjà gelé, envoyer sur glace sèche.
• Si l'expédition est faite à partir de l'extérieur du Canada: Toujours envoyer sur glace sèche.
10Adresses pour l’envoi des échantillons
Par la poste:
Centre d’expertise et de services Génome Québec
Local 6.7.31 (6ème étage, bloc 7)
5750, Chemin Hudson
Montréal, Québec, CANADA
H3S 2G5
En personne (voir plan d’accès à la page suivante):
Centre d’expertise et de services Génome Québec
3175, Chemin de la Côte-Sainte-Catherine
Local 6.7.31 (6ème étage, bloc 7)
Montréal, Québec, CANADA
H3T 1C5
11Plan d’accès du Centre d’expertise et de services Génome Québec
● Via l’entrée principale, prendre l’ascenseur 1, 2, 3 ou 4 et descendre à l'étage A.
● Suivre le couloir jusqu’au bloc 7. Prendre l’ascenseur 11 ou 12 et monter à l’étage 6.
● Le local 6.7.31 se trouve à droite près des ascenseurs.
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