Lab-on-chip: microsystème pour l'analyse biologique
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2007
Lab-on-chip:
2007 microsystème pour
l’analyse biologique
Claude Vauchier
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Microsystems for biology Claude Vauchier 1Domaines d’applications et compétences
Lab on a Chip In-vivo
In vitro Environment Life Science In vivo & Molecular
Diagnostics Monitoring Chemistry wearable Imaging
Development
µsystems for in µsystems for µsystems for Implanted of probes &
vitro environment in vitro devices instruments
diagnostics monitoring & pharmacology & Nanobiopsies for in vivo
homeland chemistry Smart textiles optical
security imaging
2007
l ic ati ons Optical Electrochemistry Instrumentation
Ap p detection
eten cies
Co m p
Biology
microtechnologies, Chemistry
Biochemistry Microfluidics Packaging
microelectronics © CEA 2006. Tous droits réservés.
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Microsystems for biology Claude Vauchier 2• Intérêts des microsystèmes pour la biologie
BIOLOGIE MICROELECTRONIQUE
Nouveaux
outils
CHIMIE MICROTECHNOLOGIE
* pas tout le temps *permet de figer des paramètres difficilement
2007 maîtrisables en macro
* pas une solution miracle
•pas adapté au dispositif •Meilleure sensibilité
unique de RF • Vitesse de réaction
• Intégration fonctionnelle
* Faible volume d’échantillons et de réactifs
* peut aider à créer de nouvelles fonctions
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* autorise la parallèlisation, le multiparamétrique
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Microsystems for biology Claude Vauchier 3Biopuces: applications en génomique,
protéomique et cellomique
Carte du génome
Activité Technologie
humain
ADN Génomique
pharmacogénomique
Biotechnologies
ARNm; ADNc
Diagnostic
Environnement
……. Protéines Protéomique
2007
Cellules Cellomique
Pharma Drug design
Cibles thérapeutiques Chimie combinatoire
Criblage
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Médicaments
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Microsystems for biology Claude Vauchier 4Ordre de grandeur des cellules
et de leurs constituants
2007 Diamètre moyen d'un cellule animale = 10-20 µm
Diamètre d'un globule rouge = 8 µm
Diamètre d'une bactérie = 1 à 10 µm (Escherichia coli = 2 µm)
Diamètre d'un virus = 15 à quelques centaines de nm
Protéine globulaire de 2 à 10 nm
Molécule d'ADN = 2nm d'épaisseur
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Microsystems for biology Claude Vauchier 5• Analyse biologique : les grandes fonctions
détection
préparation
échantillon
extraction réaction sur optique
échantillon mol.
solide RN
spécifique
,A io
n électro.
DN
action mécanique t
a
extract. ϕ solide ic
A u rif am
pli
p fic
at
2007 ion
liquide proté mass. spec.
ines
cell
vortex, impact u l es cult
u re
air détect. cell.
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Microsystems for biology Claude Vauchier 6• Principe de la puce à ADN
hybridation
Amplification
extraction de de l’ADN
l’ADN (PCR)
ou
Détection sur
puce à ADN
2007
Il n’existe pas de PCR pour copier les protéines! © CEA 2006. Tous droits réservés.
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Microsystems for biology Claude Vauchier 72 compétences fondamentales
Chimie de surface pour les microsystèmes
• Contrôle & reproductibilité des protocoles de
fonctionnalisation de surface
2007
Boîte à outil microfluidique
• Contrôle du déplacement des fluides
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Microsystems for biology Claude Vauchier 8Surface engineering for microsystems
Microtechnologies Biochip
fabrication
Surface
chemistry
µarrays substrate
Microfluidics circuit
for lab on a chip
2007
Silanisation step Functionalisation with Characterization
(silane grafting + spacer) biochemical compounds
Liquid phase or Gas phase Spotting or hydrodynamic flow Fluorescence or mass spectrometry
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Microsystems for biology Claude Vauchier 9Micro- & nano systèmes fonctionnels
Support solide Ö système fonctionnel robuste
ingénierie de surface X fonctionnalisation
modification de surface (~ Å à 100-500nm) & greffage covalent de molécules
synthèse organique X fonctionnalité
molécules de captures ou molécules activables
H Solgels, Solgels hybrides (précurseurs silylés) OH OH OH
Si M-O-C
N3 N3 OEt
EtO Si
Verre, pyrex, EtO O
Conducteurs, O O O
quartz, oxydes
semi-conducteurs Polymères
métalliques, oxydes
matériaux à surface organiques en bulk
2007
Si semi-conducteurs
Au, InP hydrogénée (« plastiques »), Si O Si O Si
M-TEPP Porphyrins nanofils Si,
matériaux denses,
résines (SU8, O O O
poreux,
N nanotubes de Ordy), etc.
microstructurés &
carbone, fullerènes
N M N nanoparticules
DNA_ DNA_ DNA_
N N
Molécules NH NH NH
N Thiols Silanes
N insaturées
M-S M-O-C
M = Co, Fe, and Mn M-C / Si, Ge-C / C-C
Si O Si O Si
Polymères (fonctionnels, téflon, etc.) O O O
M-O-C
Si
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Microsystems for biology Claude Vauchier 10Micro- & nano systèmes fonctionnels
W Sécurité et environnement
Molécules de capture W Diagnostics in vitro X
W Microsystèmes in vivo X Molécules activables
Outils pour la pharmacologie X
O
Bioreconnaissance H3C BF-4
H
Actions thermique et lumineuse
ODN , Osaccharides H3C N+ O N
H3C Silane et polymères
Silanes fonctionnels
X
Liaison chimique (ions) Actions chimique et enzymatique
Éthers couronnes liquide ionique Smart probes
R
5
Cy
O
OH
2007 NH
O
O
OR
O
OR
X
O
Q
N O +
N M
RO
O
R' N
Cu2+ O
se
ida
tos
lac
ga
OH HO
β-
O
O O
5
Cy
O
N + + +
O
N
OR
M : N a et/ o u K
OR
X
H
Q
RO
silane
capture : silane capture : éther couronne activable : smart probes © CEA 2006. Tous droits réservés.
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Microsystems for biology Claude Vauchier 11Process, Covalent Grafting
(Glass, Pyrex, Quartz, SiO2, Si3N4, ITO, …)
16 × 24 mm2 ; 2400 Spots
(d = 150 µm) Step = 400 µm
Varaiblity Intra chip < 10 %
Variability Inter puce < 30 %
Exact MMC
2007
CY3 Target
10 nM
(Saturation)
2MMC MME
CY3 Target
1 pM (Low)
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Microsystems for biology Claude Vauchier 12« CEA2 » Process, Applications
Peptides Hybridization
(Alexa 532 Labelled) Area
Monoc. Antibody
zoom
3
PCR
rapport signal / tém oin
2,5
2
Outlets
1,5
1
N N N N N N O O O O O O O O
N N N N N N 0,5
0
0 5 10 15 20 25
Si O Si O Si O Si O Si O Si Si O Si O Si O Si O Si O Si Si O Si O Si O Si Si O Si O Si O Si
O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O concentration en pM
PCR
Immuno-Assay Inlets
Collaboration with CEA-DSV (SPI Saclay)
Digestion of Proteins by Immobilised Trypsin.
2007
Trysin is covalently bonded on Si/SiO2 columns.
Micro -colonnes
CY3 Target
10 nM
CY3 Target
Grafted fluorescent enzyme 1 pM © CEA 2006. Tous droits réservés.
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Microsystems for biology Claude Vauchier 13A microfluidics toolbox
3 ways for fluid handling architecture:
Monophasic Droplets in Discrete
microfluidics channel microfluidics
Technology Microfluidics circuits with Microdroplets are actuated
Microfluidics circuits
etched channel. Specific on
(glass or PDMS)
packaging steps (low T°C) microelectodes pathway
2007
Microfluidics Mono-phasic Di-phasic diphasic (air/water;
oil/water; air/ionic liquid)
Hydrodynamics force Hydrodynamics Electrostatic, SAW
Fluid
electro-osmotic force
actuation
Thermopneumatic actuation; External pump No need
Valve or
passive valves;
pump
mechanical;
architecture
Capillaries, wells Capillaries Integrated tanks
dispensing
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Microsystems for biology Claude Vauchier 14DIAGNOSTIC IN-VITRO
APPLICATIONS
2007
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Microsystems for biology Claude Vauchier 15Le challenge de l’intégration
Microtechnologies & microfluidiques doivent permettre de miniaturiser
et d’intégrer toutes les étapes d’un protocole d’analyse biologique
Collecte
Collectede
del’échantillon
l’échantillon Extraction
Extraction purification
(sang, purification
(sang, eau, air,biopsie…)
eau, air, biopsie…)
Reconnaissance
Reconnaissance Analyse
Analyse
Detection
Detection
moléculaire
moléculaire données
données
2007
Miniaturisation Fabrication collective, petit volume d’échantillon et de réactifs,
Reproductibilité, sensibilité …
Intégration Réactions séquentielles et/ou parallèles
Automatisation Système automatisé Æ « point of care » ou borne d’analyse
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Microsystems for biology Claude Vauchier 16POC : fonctions de base à intégrer
Collecte Préparation
Analyse
échantillon
10ml à 10µl
AIR m3
Liquide
2007
en litre
Sang en
ml ou µl
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Microsystems for biology Claude Vauchier 17Analyses médicales du sang
Concentration
Purification, Protocole
détection
stabilisation d’analyse
Collecte Centrifugation
2007
Difficulté d’integration : discontinuité
disversité de volume d’échantillons
remplacer la centrifugation
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Microsystems for biology Claude Vauchier 18Point Of Care : fonctions de base à intégrer
Sang
Sang
Plasma Globules blancs Globules rouges
Diagnostic par Point of care:
2007 Deux types de prélèvement adressant différents besoins :
Petit volume : 50µl
Collecte + fractionnement du sang
+ stabilisation de la fraction
Grand volume : 2ml
fractionnement du sang
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+ stabilisation de la fraction
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Microsystems for biology Claude Vauchier 19e-lab on card:
diagnostic card & optronic hybridisation detection
Detection by chemiluminescence:
- no more optical scanner
Hybridisation
Hybridisation
++enzymatic
enzymatic detection
detection Data
Dataanalysis
analysis
labelling
labelling scanner Æ
- sensibility = fluorescence
- APS chip: low cost
- toward reader integration
2007
Specific detection
10 pM
APS optosensor
Enzymatic labelling,
luminescence,
Hybridisation from 50 fM to 10 nM,
dynamic = 1000 Plastic card (credit© CEA
card foramt)
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Microsystems for biology Claude Vauchier 20Point of care: analyse génomique
Amplification
Amplification Hybridation Détection
Détection
Hybridation Analyse de données
ADN (PCR) + +MARQUAGE
ADN (PCR) MARQUAGE sur puce
sur puce
( fluorescence)
( fluorescence) Analyse de données
Amplification « in-chip » DNA chip
PCR (Polymerase Chain Reaction) Résistance chauffante DNA chip
Spotting des sondes
sortiet
CY3
cible 10 nM
PCR
entréet CY3
Puce sur PCB
Cible 1 pM
Module thermique (TCS)
2007 Plateforme In-
check™APPLICATIONS
lecteur
Canaux enterrés (3 µl)
Maladie infectieuse (H5N1, septis…)
Agro-alimentaire
MICROFLUIDIQUE
Injection échantillon
sécurité
vétérinairel
lecteur
MST
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Microsystems for biology Claude Vauchier 21Concentration module based on magnetic beads
Microcomponent for sample concentration
volume reduction: from 1O µl to 0.1 µl
Fluidic functions: handling magnetic microbeads, filling, Agitation, Anti-diffusion
Applications:Fast analysis tools, multichannels and portable
¾ Biosensors, Immunosensors
¾ DNA chip
¾ µTotal Analysis System
FLUX
1 2 3 Small chamber 4
Agitation by thermo
Pneumatic valves
Magnet Magnet
2007
0.1µl
10µl
magnet
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Microsystems for biology Claude Vauchier 22ENVIRONMENT MONITORING
2007
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Microsystems for biology Claude Vauchier 23Discret microfluidics: EWOD on a chip
EWOD: ElectroWetting On Dielectric
Fluid handling by electrowetting
2007
Droplet volume : 10nl to 2µl
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Microsystems for biology Claude Vauchier 24Microfluidique en goutte: réacteur mobile
Principe: Electrowetting on Dielectric « EWOD »
capot espaceur
huile goutte Couche
V diélectrique Surface
électrodes hydrophobe
capot
goutte V=0V
V huile
Surface
hydrophile
capot
V goutte V = 80 V
bus
stoc
2007
Sto
ck
kage
age
100n
10
Input / output
0 nl
l
Fonction de base: dispense Microprocesseur fluidique
de gouttes à partir
d’un réservoir
Fonctions fluidiques de base:
déplacer, mixer des gouttes de qq nl à 2µl © CEA 2006. Tous droits réservés.
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Microsystems for biology Claude Vauchier 25Balise de détection de pathogènes sur site
(PCR en temps réel)
n cycles
Lecteur de fluorescence Démonstrateur intégré pour DNA
Extraction
l’analyse génomique basée
sur l’électromouillage RT PCR
« Real Time PCR »
ou quantitative PCR FLUORESCENT
DETECTION
rd
Boa
C
rP
e su
c
Pu
ADN humain
Partie thermique
Biosoc
goutte
Tube
4 cycles 20
Réservoir
Échantillon ADN Analyse en goutte par RT PCR
2007 (1) (2)
Zone de détection 34 40
Déplacement de la goutte en boucle 1300000
sur des zones thermiques ( PCR cycles)
Fluorophore FAM
cyclage thermique: 1000000
5-10 copies / goutte
• Activation 10 min. à 95°C
• 40 Cycles 60 min.: 700000
1 goutte ( 60 nl)
92°C – 30’’, 60°C – 30’’
• déplacement dans l’huile
Poubelle Réservoirs: PCR r2ACTIFS pendant la PCR 400000
(1 ABI SNP kit per pathogen) 0 10 20 30 40
PCR cycles
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Microsystems for biology Claude Vauchier 26Microsystème pour l’analyse de métaux lourds dans l’eau
Application: Constellation de capteurs
Objectifs: Surveiller, détecter, alerter
pour le suivi d’un réseau d’eau
Rapidité, fiabilité, aide à la décision
Extralab capteur
Central
capteur
Æ Stabilisation physique des interfaces
Æ Extraction concentrante
Æ Détection par spectrophotomètre portable à fibres optiques capteur
Æ Application à la détection de métaux lourds dans l’eau
Æ objectif: réalisation d’un capteur autonome sur site
Microcomposant Si/verre Microfluidique diphasique
Principe de la microextraction concentrante
Entrée eau 1,5cm
à analyser
Fibre optique Sortie eau
110µm
Source UV-visible
Source UV 110µm Fibre optique vers
visible (fibre) Ligne de pilier détecteur UV visible
Microcanal diphasique Stabilisation diphasique portable
2007 Phase organique: boucle d’extraction concentrante
Piliers stabilisateurs
des 2 phases
non miscibles Phase aqueuse Phase organique
Eau + fluorescéine
Eau polluée Complexant spécifique
du plomb Débit Q1= 1 µl/min
Pb2+
(macrocycle type calixarène) 0,20
Pb2+
0,15 -1
1 mg.L
Pb
0,10
0,05
0,00
2
3 Chloroforme
4
-0,05
-1
Absorbance / cm
X X -0,10
-0,15 Débit Q2= 2 µl/min
X O S O O S O X -0,20
NH HN O S O -0,25
O S O -0,30
O NH
NH OMe O -0,35
O
O O O -0,40
Complexant
O du plomb de type Calixarène
O O OMe
O -0,45
O O X = CF3, Ph, PhMe, dansyl -0,50
O
O O
Écoulement diphasique
-0,55
O
Vue des entrées NH -0,60
HN -0,65
-0,70
du composant cavitands O S O
O S O 400 450 500 550 600 650 700 750
X X longueur d'onde / nm
calixarènes © CEA 2006. Tous droits réservés.
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Microsystems for biology Claude Vauchier 27LIFE SCIENCE APPLICATIONS
2007
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Microsystems for biology Claude Vauchier 28De nouveaux outils pour l’analyse des protéine par
spectrométrie de masse
Digestion separation
separation Mass spec Analyse de
Digestion peptides Electrospray Mass spec
protéines peptides Electrospray Analyse de
protéines détection données
détection données
Séparation des peptides
sur µcolonne (nano LC chip) 2,8 kV
Interface LC ESI Chip
Plume électrospray
avec spectromètre de masse
intégrée (ESI)
20 bar (Trap Thermo MS)
Injection de la
solution
2007
peptidique Biochiplab® test espray2 111005 d 196 (3.893) Cm (40:271)
100 785.70
TOF MS ES+
6.13e4
786.23
%
1,5 µm
786.73
UL072011(0.478)Cm(10:20) TOFMSES+
779.37 1.65e4
100
584.75
634.33 787.23
792.44
781.44
585.26
0 m/z
780 781 782 783 784 785 786 787 788 789 790 791 792
%
678.32 780.39
454.23
648.81
Spectre de la GFP (Glu-
Structure interne du microréacteur
595.76604.28 649.32 799.84
454.74
injection du mix protéines
803.91
451.72 536.28 606.76
656.33
679.33 735.81 762.43 806.42
Fibrinopeptide)
pour l’application chromatographie.
455.25 810.84 907.48
409.97 700.33 856.87
478.23 516.32 536.94578.97 867.96
908.51 971.16
0
5 pmol/µl in ACN/H2O/FA
(phase C18 hydrophobe greffée
UL069418(0.776)Cm(10:20) TOFMSES+
735.83 1.80e4
100
Microréacteur pour la digestion de protéines débit : 200 nl/min
sur les micropiliers)
(digeste de cytochrome C ; 10pmol/µl; débit: 80nl.min-1)
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Microsystems for biology Claude Vauchier 29LC chip with integrated ESI nozzle
MS Fluidic pattern for LC separation
1,5 µm
2007
≈1mm
5X50µm2
3 wafers Technology
800µm
slit
5x50 µm2
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Microsystems for biology Claude Vauchier 30Objectifs: intégration et réponse aux
applications spécifiques
Intégration d’un système d’analyse du plasma pour
le diagnostic du cancer: Loccandia (EU)
Mélange de Peptide Diagnostic
Échantillon
protéines spectrogrammme information
sang
Préparation Lab-on-chip & technologie
échantillon sang spectromètre de
de masse l’information
BIO NANO INFO
Material flow Information flow
2007
En développement : microréacteurs génériques fonctionnalisés selon
l’application & amélioration des performances avec les nano
matériaux
Micro concentrateur
Nouvelle génération de
réacteur avec Nanotube
de carbone in-situ
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Microsystems for biology Claude Vauchier 31DNA Chip with in-situ syntheses: YAMATAKE
polymer masking step using ink-jet printer
colorimetric detection
81 probes per chip
marketed in Japan since June 2006
at
2007
e form
s slid
Glas
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Fabrication process Toute reproduction totale ou partielle sur quelque support que ce soit ou utilisation du contenu de ce document est interdite sans l’autorisation écrite préalable du CEA
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Microsystems for biology Claude Vauchier 32• Application pour le in-vivo
2007
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Microsystems for biology Claude Vauchier 33Outil pour le clinicien: PROTOOLTM
Global Proteomic Identification
Clinical-Biological question Analysis
Molecular
Purification
Functional annotation
masses (Da)
300 400 500
20 00 00 00
3
00
20 A
Peak intensity (arbitrary units)
1
0 A
**
30
2 B 20
* *
1 10 ** ** *
0 0 * * *
1000 1500 2000 2500
Le concept “Nanobiopsie Sampling Contact entre
l’outil et le tissu
protéomique” concept rod
(∅ 800µm) Imprint
Guide window (2cm)
(∅ 1mm)
2007
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Collaboration LETI / Inserm U318 (CHU Grenoble)
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Microsystems for biology Claude Vauchier 34Outil pour le clinicien: PROTOOLTM
Technologie LETI:
Guide
∅= Tige de
1mm capture Microsystème silicium
∅ = 800µm
Surface micro structurée => efficacité de la capture de protéines
HYDROPHILIC HYDROPHOBIC
- - - + + + AROMATIC
HYDROPHILIC HYDROPHOBIC
+ + + - - - AROMATIC
2007
WY
WY
WY
WY
WY
WY
WY
WY
WY
WY
WY
WY
WY
WY
WY
autres...
Fonctionnalisation chimique / spatialisation de la tige => specificité
Avantages: sensibilité & specificité de capture de
protéines, reproductibilité & simplicité du protocole,
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Microsystems for biology Claude Vauchier 35• CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
2007
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Microsystems for biology Claude Vauchier 36• Perspectives: Exemples d’applications des
nanotechnologies
Capteurs moléculaires
2007 Cantilevers arrays fonctionnalisés Détection sur Nanofils
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Microsystems for biology Claude Vauchier 37Perspectives:
ROADMAP DES LAB ON A CHIP
POUR LE DIAGNOSTICS AU CEA LETI 2015
Détection sans marquage
Objectif pour le futur: (nanofils….)
Haute sensibilité et spécificité 2010
Détection sans marquage Full integration
2007
Détection ADN et protéines sur Lab on chip
des plateformes identiques
Intégration préparation
échantillons (sang, air, eau..)
2006
Parallèlisation réactions séquentielles
2005
réactifs embarqués
2004 PCR temps réel
2007 en goutte
2003
Intégration detection APS
chimieluminescence
2001
Intégration PCR + puce ADN
In silicon chip
1999 Lecteur bas coût
fluorescence © CEA 2006. Tous droits réservés.
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puce ADN Microsystems for biology Claude Vauchier 38• Les moteurs possibles de la croissance et opportunités
¾Vieillissement de la population:
demande croissante des pays industrialisés
- Les coûts des soins médicaux demandent des solutions
- diagnostic « au lit du malade » POC
- drug discovery: trouver de nouveaux médicaments
(effet des génériques)
- Home « wellness »: marché potentiel?
¾ Biodéfense, biosécurité:
- réponse au bioterrorisme
- réponse aux impacts des infections:
- légionnelle (fort impact sur les populations)
2007
- salmonelle (impact économique)
- Menace émergente: SRAS, grippe aviaire…..
¾ Multidisciplinarité entre science et engeneering:
- point clé pour développer de nouveaux concept de biocapteurs
- croisement microbiologie, MEMS et microfluidique:
fort potentiel mise en œuvre aux USA, Japon et Europe
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Microsystems for biology Claude Vauchier 39Innovation
for industry
2007
“les biopuces”, X.Gidrol, S.Baghdoyan, Y.Roupioz; Techniques de l’ingénieur, 9-2004, RE 17-1
“puces à ADN”, P.Soularue, X.Gidrol; Techniques de l’ingénieur, 06-2002, RE 6-1
Revue spécialisée: “Lab on a chip” http://www.rsc.org/is/journals/current/loc/locpub.htm
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Microsystems for biology Claude Vauchier 40You will be welcome to the
7th Leti Annual Review,
2007
18 and 19 June 2007 at Minatec
For more information :
http://www.leti.fr
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Microsystems for biology Claude Vauchier 41Vous pouvez aussi lire
