Mercodia C-peptide ELISA - Mode d'emploi 10-1136-01 Réactifs pour 96 mesures
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Mercodia
C-peptide ELISA
Mode d’emploi
10-1136-01
Réactifs pour 96 mesures
Ce kit est réservé à l’utilisation diagnostique in vitro dans l’UE/EEE,
au Royaume-Uni, aux États-Unis et au Canada
Modifications importantes apportées
dans cette version
Page 6 Collecte et manipulation des spécimens
Sérum et Plasma
Statut réglementaire dans le reste du monde:
Pour la recherche uniquement.
Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.
Fabriqué par
Mercodia AB
Sylveniusgatan 8A
SE-754 50 Uppsala
SuèdeExplication des symboles utilisés sur les étiquettes
Réactifs pour 96 mesures
∑ = 96
A utiliser avant
A conserver entre 2 et 8°C
N° de lot
Ce kit est réservé à l’utilisation
diagnostique in vitro
© Mercodia 2010-2021Utilisation prévue
Le test Mercodia C-peptide ELISA fournit une méthode de détermination des
quantités de peptide C humaine dans le sérum, plasma ou l´urine.
Résume et explication du test
L’évaluation qualitative et quantitative du fonctionnement des cellules ß du
pancréas n’est pas seulement utile dans l’étude pré- et post-diagnostique de
l’évolution du diabète sucré, mais également pertinente, dans une perspective
clinique, pour faciliter le choix du bon traitement. La mesure des niveaux
d’insuline périphériques ne permet pas d’évaluer le fonctionnement de ces
cellules, en raison de l’absorption forte et variable, par le foie, d’insuline prélevée
dans la circulation portale, et parce que les dosages ne distinguent pas l’insuline
endogène de l’insuline exogène.
Dans les cellules ß du pancréas, la proinsuline est clivée en une molécule de
peptide C et une molécule d’insuline. Le peptide C est ensuite excrété dans la
circulation, à une concentration équimolaire de celle de l’insuline. Contrairement
à celle-ci, le peptide C n’est libéré par le foie qu’en très petite quantité. Les
concentrations périphériques de peptide C reflètent donc, plus précisément que
l’insuline, la sécrétion des cellules ß.
L’excrétion urinaire de peptide C est corrélée avec ses niveaux plasmatiques,
mais son extraction varie fortement d’un individu à l’autre ; elle ne permet donc
pas d’évaluer avec précision le fonctionnement des cellules ß.
Principe de la procédure
Une caractéristique du test Mercodia C-peptide ELISA est le dosage
immunologique enzymatique à double site, en phase solide. Il repose sur une
technique de type ”sandwich direct”, dans laquelle deux anticorps monoclonaux
sont dirigés contre deux déterminants antigéniques distincts du peptide C. En
phase d’incubation, les molécules de peptide C de l’échantillon réagissent avec
les anticorps correspondants fixés aux puits de microtitration.
Après rinçage, on ajoute des anticorps anti-peptide C conjugués à la
peroxydase. Après la deuxième incubation, suivie d’un rinçage simple destiné
à éliminer les anticorps marqués non liés, le conjugué est détecté par réaction
avec la 3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine (TMB). Pour arrêter la réaction, on ajoute de
l’acide. Cette solution fournit un point d’évaluation colorimétrique, qui sera lu par
spectrophotométrie.
3Avertissements et précautions
• Ce kit est réservé à l’utilisation diagnostique in vitro dans l’UE/EEE, au
Royaume-Uni, aux États-Unis et au Canada.
• Statut réglementaire dans le reste du monde: Pour la recherche uniquement.
Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.
• Tous les spécimens patient doivent être traités comme des échantillons
contagieux.
• Chaque puits ne peut être utilisé qu’une seule fois.
• La Stop Solution contientMatériel nécessaire mais non fourni
• Prelever les volumes à l’aide de pipettes appropriées (pipettes à répétition
recommandées pour l’ajout de solution d’enzyme conjugate 1X, Assay Buffer,
Substrate TMB et Stop Solution)
• Tubes, béchers et éprouvettes cylindriques pour la préparation des réactifs
• Eau redistillée
• Agitateur magnétique
• Agitateur vortex
• Lecteur de microplaques (filtre de 450 nm)
• Agitateur secoueur de plaques (700-900 tours par minute, mouvement orbital)
• Dispositif de rinçage de microplaques en utilisant la fonction aspiration
verticale (recommandé mais pas obligatoire)
Réactifs
Chaque kit Mercodia C-peptide ELISA (10-1136-01) contient suffisamment de
réactifs pour 96 puits, soit une quantité permettant de traiter 42 échantillons et
une courbe d’étalonnage en double. Pour des séries de dosages plus importantes,
mélangez les réactifs de kits portant des numéros de lot identiques. La date de
péremption du kit figure sur l’étiquette apposée à l’extérieur. La température de
stockage recommandée est 2 à 8 °C.
Coated Plate 1 plaque 96 puits Prête à l’emploi
Anticorps Monoclonal murin anti-peptide C Bandes de 8 puits
Les puits de microtitration non utilisés peuvent être conservés pendant 2 mois entre
2-8°C après les avoir replacés dans leur emballage hermétiquement fermé à l’aide de
papier adhésif.
Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 fioles 1000 µL Lyophilisé
Code couleur jaune Ajoutez 1000 µL
Conc. a déclaré sur l’étiquette. d’eau redistillée
Stockage après reconstitution: 2-8°C pour 1 semaine. par fiole.
Pour le stockage des Calibrators reconstitués pendant plus d’une semaine, les diviser
en aliquotes et les conserver à -20°C. Les Calibrators divisés en aliquotes sont stables
pendant 6 semaines à -20°C.
Calibrator 0 1 fiole 5 mL Prête à l’emploi
Code couleur jaune
Assay Buffer 1 fiole 6 mL Prête à l’emploi
Code couleur rouge
Enzyme Conjugate 11X 1 fiole 1.2 mL A préparer,
Peroxidase conjugé monoclonal murin anti-peptide C voir ci-dessous
Enzyme Conjugate Buffer 1 fiole 12 mL Prête à l’emploi
Code couleur bleu
Wash Buffer 21X 1 fiole 50 mL Diluez avec 1000 mL
Stockage après dilution: d’eau distillée pour
2-8°C pour 2 mois préparer la solution
de wash buffer 1X
Substrate TMB 1 fiole 22 mL Prête à l’emploi
Solution incolore
Remarque! Cette solution est sensible à la lumière!
Stop Solution 1 fiole 7 mL Prête à l’emploi
0.5 M H2SO4
5Préparation la solution d’enzyme conjugate 1X
Préparez la solution d’enzyme conjugate 1X nécessaire en diluant 11X l’Enzyme
Conjugate (1+10) dans l’Enzyme Conjugate Buffer, en suivant les indications du
tableau ci-dessous. Lors de la préparation la solution d’enzyme conjugate 1X pour
une plaque entière, transférer tout le tampon du Enzyme Conjugate Buffer dans le
flacon du Enzyme Conjugate 11X. Mélangez sans agiter.
Enzyme Enzyme
Nobre de bandes Conjugate 11X Conjugate Buffer
12 bandes 1 fiole 1 fiole
8 bandes 700 μL 7 mL
4 bandes 350 μL 3.5 mL
Stockage après dilution: à température comprise entre 2 et 8°C pendant 1
semaine.
Collecte et manipulation des spécimens
Sérum
Collectez le sang par ponction veineuse, attendez la coagulation, puis isolez le
sérum par centrifugation. Les échantillons de sérum doivent être conservés à
2-8°C avant l’analyse, avec un temps de conservation le plus court possible.
Pour des périodes plus longues, conserver les échantillons à –80°C. Evitez de les
congeler et de les décongeler plusieurs fois.
Plasma
Collectez le sang par ponction veineuse dans des tubes contenant de l’héparine
ou de l’EDTA comme anticoagulant et isolez le plasma par centrifugation.
Les échantillons de plasma doivent être conservés à 2-8°C avant l’analyse, avec
un temps de conservation le plus court possible. Pour des périodes plus longues,
conserver les échantillons à –80°C. Evitez de les congeler et de les décongeler
plusieurs fois.
Urine
Collectez les urines de 24 heures (sans conservateur). Conservez le spécimen à
une températurecomprise entre 2 et 8°C. Enregistrez le volume total du spécimen
et retenez une aliquote bien dosée pour l’analyse. Stockez les échantillons à
une température comprise entre 2 et 8°C pendant 24 heures au maximum avant
dosage. Pour une conservation plus longue, congelez les échantillons d’urine à –70
°C jusqu’au moment de réaliser le dosage. Evitez de congeler et de décongeler les
échantillons à plusieurs reprises. Les débris cellulaires doivent être retirés avant le
dosage, soit par filtrage, soit par centrifugation.
Préparation des échantillons
Les échantillons urinaires de valeurs supérieures au Calibrator 5 doivent être
dilués au 1/10 dans le Calibrator 0. Les échantillons de serum et de plasma ne
nécessitent pas de dilution normalement. Cependant si la valeur est au dessus du
Calibrator 5, les échantillons doivent être dilués dans le Calibrator 0.
6Procédure de test
Tous les réactifs et échantillons doivent être mis à température ambiante avant
utilisation. Préparez une courbe de Calibrator pour chaque dosage. Ce dosage a
été optimisé et validé sans film de protection.
1. Préparez solution d’enzyme conjugate 1X et solution de wash buffer 1X.
2. Préparez un nombre suffisant de puits de microplaques pour y loger les
Calibrators de contrôles et les échantillons en double.
3. Pipetez 25 μL de Calibrators, de contrôles et d’échantillons dans les puits
appropriés.
4. Ajoutez 50 μL de Assay Buffer dans chaque puits.
5. Laissez incuber sur un agitateur secoueur de plaques (700-900 rpm)
pendant 1 heure à température ambiante (entre 18 et 25°C).
6. Lavez 6 fois avec 700 µL solution de wash buffer 1X par puit avec un laveur
de plaques automatique en utilisant la fonction aspiration verticale. Après le
dernier rinçage, retournez la plaque et appuyez-la fermement sur du papier
absorbant. Evitez l’étape de trempage dans la procédure de lavage.
Ou lavez manuellement:
Jetez le volume réactionnel en retournant la plaque au-dessus d’un évier.
Ajoutez 350 µL solution de wash buffer 1X dans chaque puit. Jetez la
solution de wash buffer 1X, tapez fermement plusieurs fois sur un papier
absorbant pour ôter l’excès de liquide. Répétez 5 fois. Evitez les trempages
prolongés pendant l’étape de lavage.
7. Ajoutez 100 μL la solution d’enzyme conjugate 1X dans chaque puits.
8. Laissez incuber sur un agitateur secoueur de plaques (700-900 rpm)
pendant 1 heure à température ambiante (entre 18 et 25°C).
9. Lavar comme indiqué au point 6.
10. Ajoutez 200 μL de Substrate TMB.
11. Laissez incuber pendant 15 minutes sur le banc à température ambiante
(18 et 25°C).
12. Ajoutez 50 μL de Stop Solution dans chaque puits.
Placez la plaque sur un agitateur secoueur pendant environ 5 secondes, afin
que le mélange s’effectue bien.
13. Lisez la densité optique à 450 nm et calculez les résultats.
La lecture doit être réalisée sous 30 minutes.
Note: Porter une attention particulière à ne pas contaminer le Substrat TMB avec
la solution de l’enzyme conjugué
7Contróle qualité interne
Les contrôles disponibles dans le commerce, tels que le Mercodia Diabetes
Antigen Control (référence 10-1134-01/10-1164-01), ou les mélanges de sérums
internes dont la concentration en peptide C est faible, moyenne ou élevée,
doivent systématiquement être soumis à un dosage, comme des mélanges de
concentration échantillions, et les résultats doivent être reportés sur un graphique
journalier. C’est une bonne pratique pour un laboratoire d’enregistrer les données
suivantes pour chaque dosage: numéro de lot du kit, dates De dilution et/ou
de reconstitution des composants, valeurs OD du blanc, des Calibrators et des
contrôles.
Les laboratoires soivent suivre la règlementation en vigueur ou les exigences
des accréditations en ce qui concerne la fréquence du contrôle de qualité.
Calcul des résultats
Pour calculer la concentration en peptide C, réduisez les données d´absorbance
des Calibrators, à l´exception du Calibrator 0, comparées à la concentration, en
appliquant une équation de régression de la spline cubique.
Exemple de résultats
Conc. moy.
Puits Identité A450 nm pmol/L
1A–B Calibrator 0 0.072/0.070
1C–D Calibrator 1* 0.146/0.149
1E–F Calibrator 2* 0.340/0.339
1G–H Calibrator 3* 1.128/1.113
2A–B Calibrator 4* 1.878/1.939
2C–D Calibrator 5* 2.977/2.951
2E–F Échantillon 1 0.311/0.321 316
2G–H Échantillon 2 0.991/0.959 1065
3A–B Échantillon 3 1.737/1.766 2172
*Concentration a déclaré sur l’etiquette du flacon.
8Exemple de courbe d´étalonnage
La courbe présentée est une courbe d´étalonnage type. Ne l’utilisez pas pour
déterminer les résultats des dosages réels.
10
A450 nm
1
0.1
10 100 1000 10000
C-peptide (pmol/L)
Limites de la procédure
Comme pour tous les tests de diagnostic, le diagnostic clinique définitif ne doit
pas reposer sur les conclusions d’un seul test : il doit être effectué par le médecin
après évaluation de tous les résultats cliniques.
L’hémolyse, l’ictère ou la lipémie n’affectent pas le dosage.
Valeurs moyennes
La déontologie incite chaque laboratoire à établir sa propre gamme de valeurs.
Les résultats suivants peuvent servir de guide jusqu’à ce que le laboratoire ait
rassemblé suffisamment de données provenant de ses propres sources.
Un test de sérum à jeun sur 136 individus apparemment sains donne une
moyenne de 742 pmol/L (2.2 μg/L), une valeur médiane de 628 pmol/L (1.9 μg/L) et
une étendue de 343 pmol/L à 1803 pmol/L (1.0–5.4 μg/L) (95 % des observations,
valeurs extrêmes exclues).
9Caractéristiques de performances
Limites de détection
La limite de détection est définie en tant que capacité de détection selon la norme
ISO11843-Partie 1. La capacité de détection doit être considérée en tant que partie
d’une méthode de validation, plutôt que comme la concentration la plus basse
pouvant être mesurée. La limite de détection est de 25 pmol/L comme déterminé
par la méthode décrite dans la norme ISO11843-Partie 4. La concentration
concernant les échantillons ayant une abso bance en dessous de celle du
Calibrator 1 ne doit pas être calculée, mais exprimée comme inférieure ou égale à
(≤) la concentration indiquée sur le flacon du Calibrator 1.
Récupération
Sérum:
La récupération après ajout donne une valeur comprise entre 96%-108%
(moyenne 102%).
La récupération après dilution donne une valeur comprise entre 97%-107%
(moyenne 102%).
Hook effect
Le kit permet d’effectuer des mesures sur des échantillons d’une concentration
maximale de 1 750 000 pmol/L sans donner de faux résultats bas.
Précision
Chaque échantillon a été analysé en 4 exemplaires à 7 occasions différentes.
Coefficient de variation
Échantillon Valeur moyenne Répétabilité%* Entre laboratoire %**
pmol/L
1 304 4.8 6.8
2 818 3.1 5.4
3 1803 2.9 3.0
*Pendant du dosage variation
**Total les dosages variation
Spécificité
Les réactions croisées ci-dessous ont été identifiées:
InsulineÉtalonnage
Le kit spécial Mercodia C-peptide ELISA est étalonné à l’aide du réactif
International Reference Reagent for C-peptide, IRR C-peptide 84/510.
Facteur de conversion
1 μg/L correspond à 331 pmol/L
Garantie
Les données de performances présentées dans ce document ont été obtenues
lors de tests respectant la procédure indiquée. Tout changement ou modification
dans la procédure, non recommandé par Mercodia AB, est susceptible d’affecter
les résultats. Si la procédure n’est pas respectée, Mercodia AB décline toute
responsabilité concernant les garanties exprimées, légales ou implicites, y compris
la garantie implicite relative à la qualité marchande et à la conformité d’usage de
ce kit.
Mercodia AB et ses distributeurs agréés ne sauront être tenus pour passibles de
dommages indirects ou immatériels si la procédure décrite n’est pas respectée.
Références
Gaines-Das RE and Bristow AF (1988) WHO international reference reagents for
human proinsulin and human insulin C-peptide. J. Biol Stand 16:179-186
Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B (2004) Supplementation with
trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulineamia in obese men:
close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019
Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF (2004) Reduced hepatic insulin extraction
in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin
secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of
type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359-65
De plus amples informations sont disponibles sur notre site web: www.mercodia.com
11Résumé du protocole
Mercodia C-peptide ELISA
Ajoutez les Calibrators, les
25 μL
contrôles* et les échantillons
Ajoutez l’Assay buffer 50 μL
1 heure à 18-25°C sur un secoueur
Laissez incuber
de plaque, 700-900 rpm
Rincer la plaque avec la solution
700 µL, 6 fois
wash buffer 1X
Ajoutez la solution enzyme
100 μL
conjugate 1X
1 heure à 18-25°C sur un secoueur
Laissez incuber
de plaque, 700-900 rpm
Rincer la plaque avec la solution
700 µL, 6 fois
wash buffer 1X
Ajoutez le Substrate TMB 200 μL
Laissez incuber 15 minutes à 18-25°C
50 µL
Ajoutez la Stop Solution Agitez pendant 5 secondes pour
effectuer un mélange correct.
Mesurez A450 nm Évaluez les résultats
*Non inclus Pour plus de détails voir page 7
Pour le support technique contacter: support@mercodia.com
31-3122
Version 15.0
2021-02-05Vous pouvez aussi lire
