Microfluidic Stickers* - Vincent Studer Denis Bartolo (PMMH ESPCI) Maxime Dahan (LKB ENS)
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Microfluidic Stickers*
Vincent Studer
Denis Bartolo (PMMH ESPCI)
Maxime Dahan (LKB ENS)
Mathieu Morel (LKB ENS)
*autocollants microfluidique
Plan • Introduction : microfluidique et biologie cellulaire • Technologies microfluidiques • Physique des écoulements microfluidiques • Composants microfluidiques • Biologie cellulaire quantitative
Introduction : microfluidique
Microfluidique : science et technologie de la manipulation de fluides dans
des réseaux de canaux de dimension 5-500 µm
100µm
1nL
1pL 10µm
Réduction des dimensions et des
volumes, intégration, parallélisation
Laboratoire sur puce (1990->…)
Lab on a chip • Diagnostique (génétique, protéomique) • Criblage • Capteurs • … Peu de systèmes commercialisés investissement technologique important (Agilent, Motorola, Philips…)
Microfluidique et biologie
cellulaire
~2000 : Développement de méthodes simples de microfabrication : la
microfluidique est à la portée des laboratoires de biologie
Taille adaptée à l’étude de la cellule
(1-10µm)
La compréhension des mécanismes
cellulaire nécessite de nouveaux
outils :
-croissance, adhésion, signalisation
-biologie de la cellule unique
Plan • Introduction : microfluidique et biologie cellulaire • Technologies microfluidiques • Physique des écoulements microfluidiques • Composants microfluidiques • Biologie cellulaire quantitative
Techniques de microfabrication
légères.
Techniques de réplication (à partir d’un moule)
1) Fabrication du moule :
-Micro-usinage (100 µm-1mm)
-Lithographie optique (1-100 µm)
-Lithographie électronique (50nm-5µm)
2) Réplication dans un materiau polymère
-Lithographie molle
-autocollant microfluidiques
Lithographie molle Whitesides, Delamarche (1998) PDMS (PolyDiMéthylSiloxane), élastomère transparent. Moule : lithographie optique (ou autre) Le PDMS natif hydrophobe (groupes méthyl en surface). Rendu hydrophile par plasma air ou O2 (-SiOH en surface) Collage irréversible avec verre ou PDMS (Si-O-Si). Simple, rapide mais matériau unique (ou presque)
µPS : Micropatterned Stickers Collaboration avec Denis Bartolo (PMMH-ESPCI) Bartolo D., Degré G., Studer V. (Brevet CNRS) Bartolo D., Nghe P.,Degré G., Studer V. Microfluidic Stickers soumis à lab on a chip)
µPS : Micropatterned Stickers ASSEMBLAGE
µPS : Micropatterned Stickers
• Méthode simple et rapide
• Applicable à un grand choix
de matériaux (durs,
élastiques, hydrophiles,
hydrophobes)
• Collage aisé et résistant,
même en milieu aqueux
• Empilables (réseaux 3D)Plan • Introduction : microfluidique et biologie cellulaire • Technologies microfluidiques • Physique des écoulements microfluidiques • Composants microfluidiques • Biologie cellulaire quantitative
Ecoulements laminaires,
nombre de Reynolds
Equation de Navier Stokes
Nombre de Reynolds
ρ=1g/cm3 (eau)
U0 ~1um/s-1cm/s, L0 ~1-100 um
Re= 10-6 à 10
ReEcoulements de Stokes Q : débit volumique R : résistance hydrodynamique
Resistance hydrodynamique
PDMS
Microfluidic StickerDiffusion, advection et mélange
Diffusion, advection et mélange Issu de Kamholtz et al. 1999 Advection/Diffusion = nombre de Péclet L~100 um U~100 um/s Petite protéine : Pe=250 , Z~2,5mm Gamme accessible Pe=0.1~1000, mélange ou structuration des écoulements
Plan • Introduction : microfluidique et biologie cellulaire • Technologies microfluidiques • Physique des écoulements microfluidiques • Composants microfluidiques • Biologie cellulaire quantitative
Flow focusing
Ps
H2 O
La largeur du jet dépend du
FITC ratio Pi/Ps
Pi
WfminGénération de gradients
Dertinger et al. Analytical Chemistry 2001, 73 1240-1246
C=50%
C=0 C=100%
V=nombres de concentrations différentes ~ B
Gradient stable spatialement et temporellementµPS: Génération de profils de
concentration complexes
Superposition de 3 autocollants microfluidiques interconnectés.
Profile complexe avec seulement deux entrées et une sortie.
µPS ->Réseaux microfluidiques 3DPlan • Introduction : microfluidique et biologie cellulaire • Technologies microfluidiques • Physique des écoulements microfluidiques • Composants microfluidiques • Biologie cellulaire quantitative
Approche systémique Mesure quantitative de la réponse d’une cellule à une stimulation chimique contrôlée spatialement et/ou temporellement. - sur un grand nombre de cellules individuelles (données statistiques) en parallèle. -avec un nombre important de conditions -Mesure reproductible et robuste -La réponse peut être chimique, phénotypique, mécanique…
Chimiotaxie des neutrophiles
Jeon et al. Nature Biotechnology 20, 826-830 (2002)
Méchanisme peu ou mal
compris.
Hypothèse : ils sentent la
concentration en
chimioattractant à différents
endroits de la cellule
Position µm
->gradient à l ’échelle de la
cellule (10µm)
Microfluidique : gradient à
l’échelle subcellulaire / stable
dans le tempsChimiotaxie des neutrophiles Hertzmark et al. PNAS 104, 33, 13349-13354 (2007) Hypothèse : Réponse~∆C/C Stimulation : gradient exponentiel de chimioattractant Mesure CI=déplacement dans le sens du gradient / déplacement total Conclusions : Prise de décision ~ ∆C CI ~ ∆C/C
Guidage Axonal
Etudier la réponse du cône de croissance d’un neurone à
un gradient de chimioattractant avec une très grande
sensibilité.
Problème : culture de neurones délicate et longue.
->difficile à réaliser dans un système microfluidique
Collaboration avec Maxime Dahan et
Mathieu Morel (LKB ENS)µPS pour la biologie cellulaire M. Morel, D. Bartolo, M. Dahan and V. Studer (2007) Microfluidic Stickers for quantitative studies of cultured cells Proceedings Micro Total Analysis Systems 2007, Paris.
Cellular and multicellular samples
To demonstrate the feasibility of this technique we have sealed simple co-flow
device onto different cellular and multicellular systems, from model HeLa cells
to primary neurons, explants or drosophilae pupae tissues.
50µm
Confluent HeLa cells in a
200µm channel. Selective detachment in a trypsin
co-flow.
100µm
8 DIV interneurons in a 1 mm Drosophila pupa dorsal tissue near a
channel. channel border with Sensory Organ
Precursor expressing GFP (green)Hydrodynamic subcellular focusing
Reconstructed 60X fluorescence and phase contrast
microscopy (white dashed box).
Fluorescein was
Using a three inlets added at the FM 4-
microcircuit we have 64 inlet to visualize
focused a subcellular the focusing flow.
flow of FM 4-64 (red) Membrane and
on cultured HeLa intracellular vesicles
cells transfected are labeled in red by
with eGFP (green) . the lipidic dye.Guidage Axonal Génération de gradients stables et controlés d’espèces chimiques sur des neurones en culture
µPS pour la biologie cellulaire
• culture, marquage, transfection (plasmide, RNAi) : peuvent
être utilisés avant de rajouter le circuit
• La qualité optique est excellente, très faible
autofluorescence : détection optique ultrasensible jusqu’à
la limite de la molécule individuelle
• Circuits microfluidiques 3D : profils de concentration
complexes
• autocollants microfluidiques peuvent être déposés sur des
cultures de neurones ou sur des systèmes multicellulaires
(tissus, tranches, explants,…) très difficiles à manipuler
dans les circuits microfluidiques traditionnels.Conclusion Microfluidique : outil simple et efficace pour • Stimuler chimiquement à l’échelle cellulaire et subcellulaire et de façon quantitative des cellules en culture . • Observer la réponse de chaque cellule/neurone de façon quantitative à l’échelle cellulaire ou subcellulaire • Effectuer en grand nombre de mesure en parallèle Ouvre de nouvelles perspectives en biologie cellulaire
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