ON-LINE EYPLOITATION TOOLS FOR THE QUANTITATIVE ANALYSE OF METABOLIC REGULATIONS IN MLCROBLAL CULTURES
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ON-LINE EYPLOITATION TOOLS FOR THE QUANTITATIVE
ANALYSE OF METABOLIC REGULATIONS IN MlCROBlAL
CULTURES
PRÉSENTEEAU DEPARTEMENTDE CHIMIE
ÉCOLE POLYTECHNIQUE FÉDÉRALEDE LAUSANNE
POUR L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR ÈS SCIENCES TECHNIQUES
PAR
Christoph HERWIG
Diplom-lngenieur Maschinenbau, RWTH, Aachen
de nationaiité allemande
acceptée sur proposition du jury.
Prof. U. von Stockar, directeur de these
Prof. D. Bonvin, rapporteur
Dr 1. W. Marison, rapporteur
Dr P. Niederberger, rapporteur
Prof. J. Nielsen, rapporteur
Lausanne. EPFL
2001Summary Generally applicable on-line tools, which allow the consistent quantification of bioprocess performance, were developed. The work parîicularly focnssed on dynamic metabolic regulations in aerobic sugar metabolism in microorganisms. A sophisticated biopmcess environment including multiple on-line analysis techniques was installed. T'bis set-up allowed to measure the principal substrates and metabolites of yeast and E. coli with a frequency of at least six analyses per hour. Furthermore, the acquired data were collected in a state-of-the-art process management tool which allowed process automation and real-time data exploitation. On-line monitoring, as the first tool, was used to analyze carbon catabolite repression of invertase expression and respiration in S. cerevisiae. The high frequency analysis of glucose and sucrose during batch cultures on mixed substrates could determine derepression thresholds for monosacchatides and reveal a hitherto undescribed regulatofy state of invertase expression in the wild type strain S. cerevisiae CEN.PK113-7D. Repression, derepression thresholds and the regulatory state could be validated hy a kinetic mode1 which was based on only four parameters. HXK2 or REG1 deletion in the strain S. cerevisiae CEN.PKI13-7D was found to alleviate carbon cataholite repression of invertase expression and respiration. An analysis of the complete on-Une data set could propose a d e of the protein Hxkl to exert a remaining repression function in the HXKZ deletion mutant. Furthermore, an inverse correlation of respiratory capacity and substrate uptake rate, which could hold for al1 strains and al1 cultures with different initial mixtures of sugars, was discovered. The analysis of the same deletion mutants in steady state and transient state conditions confjrmed the alleviated repression of respiration with the consequence that higher oxidative dilution rates could be reached. No decrease in respiratory capacily was observed at super-critical dilution rates. However, upon a sudden glucose excess, metabotite formation was not reduced in the deletion mutants although the oxidative capacity increased quicker to higher levels. It was found that this effect was due to an initially more pronounced metabolic uncoupling of anabolism and catabolism in the deletion mutants compared to the wild type. Hence, on-line monitoring is a powemil tool to identify metabolic regulations as long as the tvtality of data is considered for interpretation. The second tool used in this work was the transformation of raw data into on-line stoichiometry ushg a black-box description of the biological reaction. A method was developed which allows to check the consistency of the acquired on-line data and to calculate reconciled volumettic conversion rates for dynamic process conditions. Therefore, cumulated mass balances and elemental constraints were used. The method could follow highly dynamic metabolic regulations, such as transient metabolic uncoupling. It was demonstrated that the metabolic state could be reliably identifiai by this method while interpretation of raw data could be misleading. In addition, the method was refmed to reflect sudden metabotic events such as excess or depletion of substrates, using automated decision-making upon quantification of the carbon dioxide derivative. Finally, a control concept was developed in which the method was used to operate fed-batch processes at optimum biomass yield and productivity. This concept was equally applicable to S. cerevisiae and E. coli and used only gas analysis and base addition as on-line sensors.
The third tool developed in this work was the on-line execution of stoichiometric metabolic flux models to quantify transient growth in microorganisms. Volumetnc conversion rates, delivered from the method described in the previous paragraph, were fed to metabolic flux models of different complexity. A model consisting of seven reactions for growth of S. cerevisiae could identify the role of transieut acetic acid production as a result of a limitation elsewhere than in oxidative phosphorylation during a shifi-up in dilution rate from oxidative to oxido- reductive growth regime. Moreover, the model could distinguish behveen glucose nptake and glycolytic activiîy and identify the latter as the triggering element for carbon catabolite repression of respuatory functions in iransient growth conditions. The comparison of transient adaptation of S. cerevisiae, S. kluyveri and K. luctis with the same metabolic model could reveal that the delayed increase in glycolytic flux was responsible for the delayed ethaml production in S. khyveri and K. lactis. Furthermore, the latter strains differed from S. cerevisiae in such a way that the anabolic activity was sustained d e r the shift-up, suggesting that non-nimgen conîaining biomass constituents must have k e n formed. This difference led to a classification of yeast strains for transient growth conditions with respect to the utilization of glucose for energy or carbon. Transient growth of E. coli showed complex metabolic regulations and differed depending on initial and target conditions of the transient experiment. The metabolic model could demonstrate that the FTS system was a possible regdator of the glucose influx. Furthermore, the model could point ta slow activation kinetics of the TCA cycle as the responsible element for prolonged metabolic uncoupling of anabolism and catabolism in shift-up experiments. The multivariate analysis of data obtained from metabolic models of different complexity in transieut growth conditions showed that complex metabolic models could not boost data variability in the mathematical sense. Hence, stoicluometcic metabolic flux models c m therefore not be used as a tool to mathematically identify new metabolic regulations, but are very useful to understand complex regnlations when inuinsic fluxes are arranged in yield coefficients and can be used to identify idependent metabolic regulations. The pcesent work linked on-line monitoring to real-time exploitation tools. This approach is time efficient for execution of stnin characterization and bio-process development tasks, because experiments can be judged immediately for their validity and the key parameters are available on-screen. Furthermore, the developed tools allow to elucidate new metabolic regdations and to understand what physiological information can be obtained h m transient experiments. On-line exploitation tools linked to a new experimentll design with integrated transieut experiments will enable R&D laboratories to significantly reduce labor costs and the "time-to-market".
Version Abrégée Des outils en ligne qui s'appliquent de façon générale et permettent la quantification cohérente de la performance des bio-procédés ont été développés. Le travail s'est concentré en particulier sur les régulations métaboliques dynamiques du sucre dans des microorganismes en condition d'aérobie. Un environnement de bio-procédé sophistiqué, incluant de multiples techniques d'analyse en ligne, a été installé. Ce montage a permit de mesurer les principaux substrats et métabolites de la levure et de l'E. coli avec une fréquence d'au moins six analyses par heure. De plus, les données ainsi obtenues ont été regroupées grâce a un outil de gestion des procédés à la pointe de la technologie. Ceci a permit l'automation des procédés et l'exploitation des données en temps réel. Le premier outil, le monitoring en ligne, a été utilisé pour analyser la répression catabolique de l'expression d'invertase et de la respiration, dans la lewre S. cerevisiae. L'analyse fréquente du glucose du saccharose dans les cultures batch sur substrats mélangés a permit de déterminé les limites de la dérépression pour les monosaccharides. Elle a aussi permit de révéler un état régulateur de l'expression d'invertase dans la souche sauvage de la S. cerevisiae CEN.PK113-7D, qui n'avait pas été décrit jusqu'alors. Les limites de la répression et dérépression ainsi que l'état régulateur ont pu &trevalidés par un modèle cinétique basé seulement sur seulement quatre paramètres. On a découvert que a suppression des gènes HXK2 ou REG1 dans la S. cerevisiae CEN.PK113-7D diminuait la répression catabolique de l'expression d'invertase et de la respiration. D'autre part, une analyse de la totalité des données en ligne fait penser que la protéine Hxkl pourrait jouer un r61e dans l'expression d'une fonction de répression restante dans la suppression du mutant HXK2. Une corrélation inverse entre la capacité respiratoire et le taux de conversion du substrat a également été découvert. Cette corrélation etait valable pour toutes les souches et toutes les cultures quel que soit le mélange de sucres de dépan. L'analyse de ces memes mutants, dans les conditions stationnaires et transitoires, a c o n f m é une répression diminuée de la respiration avec comme conséquence des taux de dilution oxydative supérieurs. Aucune baisse de la capacité respiratoire n'a été observée aux taux de dilution supercritiques. Toutefois, la formation de métabolites n'a pas diminué lorsque les mutants ont été exposés à un soudain excès de glucose, bien que leur capacité oxydative ait augmenté plus rapidement que dans la souche sauvage et à un niveau plus élevé. On a découvert que ce phénomène etait dû à un découplage métabolique entre l'anabolisme et le catabolisme plus prononcé à l'origine chez les mutants que dans la souche sauvage. Par conséquent, le monitoring eu ligne est un outil puissant pour identifier les régulations métaboliques, dans la mesure où la totalité des données est prise en compte pour l'interprétation. Le deuxième outil utilisé dans ce travail est la transformation des données brutes eu valeurs stœchiométriques en ligne en utilisant une boîte noire pour décrire la réaction biologique. Une méthode, qui permet de vérifier la cohérence des données obtenues en ligne et de calculer les taux de conversion volumétrique réconciliées, a été développée pour &treutilisée dans des conditions de procédés dynamiques. Pour cela, des bilan de masse cumulé et des contraintes élémentaire ont été utilisé. Cette méthode a été en mesure de suivre des régulations métaboliques hautement dynamiques, tel que le découplage métabolique transitoire. ll a été démontré que I'état métabolique pouvait etre identifié de manière fiable par cette méthode, tandis que l'interprétation des valeurs
brutes pouvait entraîner des erreurs. De plus, la méthode a été affinée ~m de refléter des événements métaboliques soudains, tel que l'excès ou la dispaition de substrats, au moyen d'un processus de décision automatique lié à la quantification du dérivé de dioxyde de carbone. Finalement, un concept de contrôle a été mis au point, dans lequel la méthode a été intégrée, de manière à ce que les procédées fed-batch soient opérés à des niveaux de rendement et de productivité de biomasse optimales. Ce concept, en utilisant seulement l'analyse de gaz et l'addition de base comme senseurs en ligne, a également été appliqué à la S. cerevisiae et I'E. coli. Le troisième outil utilisé dans ce travail a été I'exdcution en ligne de modèles de flux métaboliques stœchioméuiques pour quantifier la croissance transitoire des microorganismes. Les taux de conversion volumétxiques, obtenus grâce à la méthode décrite dans le paragraphe précédant, ont été utilisés dans des modèles de flux métaboliques de différentes complexités. Un modèle de sept réactions a déterminé que la production transitoire de l'acide acétique était dû à une limitation de flux métabolique, à l'exception de la phosphorylation oxydative. D'autre part, le modèle a pu distinguer l'assimilation du glucose de l'activité glycolytique, et identifié cette dernière comme élément déclencheur de la répression catabolique de la capacité respiratoire, dans des conditions de croissance transitoire. La comparaison de l'adaptation transitoire entre les S. cerevisiae , S. kluyveri et K. lactis par le même modèle métabolique a révélé que l'adaptation retardée du flux glycolytique était responsable de la production, également retardée, d'éthanol dans le cas des S. kluyveri et K. lactis. De plus, ces deux dernières souches étaient différentes la S. cerevisiae dans la mesure où leur activité anabolique était soutenue, ce qui laisserait supposer que des constiîuants de biomasse ne contenant pas d'azote aient été formés. Cette différence a été à l'origine de la classification des souches de levure dans des conditions de croissance transitoire, selon si elles convertissent le glucose en énergie ou en carbone. La croissance transitoire de I'E. coli a montré des régulations métaboliques complexes, qui varient en fonction des conditions initiales et finales de l'expérience transitoire. Le modèle métabolique a montré que le système FTS était un régulateur possible de l'assimilation du glucose. En outre, ce modèle a indiqué qu'une lente activation cinétique du cycle TCA était responsable du découplage métabolique prolongé entre anabolisme et catabolisme. L'analyse à variation multiple des données obtenues par les modèles métaboliques de complexité différente et dans des conditions de croissance transitoire a montré que des modèles métaboliques complexes ne pouvaient pas augmenter la variabilité des données dans le sens mathématique. En conclusion, des modèles métaboliques stœchioméMquesn'ont pas pu être utilisés comme un outil pour identifier de façon mathématique des régulations métaboliques nouvelles. Toutefois, ils sont très utiles pour comprendre des régulations complexes si les flux internes sont combinés comme coefficients de rendement. Ce présent travail a lié le monitoring en ligne avec des outils d'exploitation en temps réel. Cene approche est rapide et efficace pour caractériser des souches et développer des bio-procédés parce que la validité des expériences peut être évaluée immédiatement et les paramètres clés sont disponibles sur l'écran. Enfin, les outils développés permettent de découvrir de nouvelles régulations métaboliques et de comprendre quelles informations physiologiques peuvent être obtenues des expériences transitoires. Les outils d'exploitation en ligne liés à une conception expérimentale nouvelle iniégrant des expériences transitoires permettront aux laboratoires de recherche et développement de réduire leurs coûts de travail et les délais de mise à disposition sur les marchés (* time-Io-market ») de façon significative.
Table of Contenls
Table of Contents
Preface ..................................................................................i
Summary ................................................................................ iii
Version Abrégée ...........................................................................v
Tableofcontents .........................................................................vü
2) Regulation of aerobic sugar metabolism in microorganisms ....................................9
3) Integration of multiple on-line monitoring techniques in a sophisticated bioprocess environment ....27
CHAPTER 4 Tool On-line monitoring ....................................................... 47
4.1) Quantitative analysis of the regulation scheme of invertase expression in Saccharomyces cerevisiae .49
43) Quantitative analysis of the impact of HXK2 and REG1 deletion in S.cerevisiae on invertase expression
andrespkation ........................................................................... 71
4.3) Quantitative analysis of the oxidative meîaboiism in HXKZ- and REG1-deletionmutants ofS.cerevisiae
85
CHAPTER 5 Tool On-line sîoicbiometry ....................................................109
5.1) On-line stoichiometry and identification of metabolic state under dynamic process conditions ....111
5.1A) Documentation Metabolic Balance analyzer (MBA) ...................................... 128
53) O p ü m i t i o n of the sensitivity of cumulated mass balancing to rapid metabolie changes .........149
5.3) A generaliy applicable fed-batch control concept based on the detection of metabolic state by on-line
balancing .............................................................................. 169
CHAPTER 6 Tool On-iine Metabolic Flux Analysis ........................................... 189
6.1) A small metabolic flux mode1 to identify transient metabolic regulations in S. cerevisiae .........191
6.2) Quantitative cornparbon of transient growth of S. cerevisiae. S. kluyveri and K. lactis ...........209
6.3) Quantitative analysis of transient growth of Escherichia coli ushg on-üne metabolic flux analysis .227
6.4) Variabiiity analysis of transient growth of yeast in stoichiometric metabolic nehvorks ...........243
6.4A) A stoichiometric MFA mode1 with 31 reactions for aerobic growth of yeast on glucose .........258
7) Conclusions ......................................................................... -267
8) Outlook .............................................................................. 270
Publications ............................................................................ 273
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