Test HPV en pratique C. PASQUIER - Laboratoire de Virologie, IFB CHU de Toulouse Oncomip 29/09/11

Test HPV en pratique

           C. PASQUIER
     Laboratoire de Virologie, IFB
          CHU de Toulouse

                                     Oncomip 29/09/11

Plan
 Physiopathologie  de l’infection
 Les Tests HPV : principes et intérets
 La situation actuelle : nomenclature et
  indications
 Mise en oeuvre d’un test HPV

Plan
 Physiopathologie  de l’infection
 Les Tests HPV : principes et intérets
 La situation actuelle : nomenclature et
  indications
 Mise en oeuvre d’un test HPV

Structure des HPV

 Petitvirus nu (55 nm),
 Capside icosédrique
 ≥ 200 types

 Virus   ubiquiste (commensal)

De multiples types d’HPV

Cutanéo-muqueux

                                Cutané

                           Cutané

                  Cutané

Le génome viral
                                           oncogénèse
  ADN db circulaire, 8 kb

                 L1-L2                     E1-E4 réplication

Capside
VLP (virus-like particles)

Les 2 formes du génome viral
                                oncogénèse
  Episome vs linéaire intégré

                 L1-L2          E1-E4 réplication

Capside
VLP (virus-like particles)

Réplication des HPV

                      Frazer, Nature Rev Immunol 2004

Différenciation cellulaire
                             Infection par HPV

                                       . Infection des cellules
                                       basales
                                       . Zones de jonctions
                                       épithéliales
                                       . Microlésions?

Infection récente
                virions

                             Asymptomatique ++
                             Condylomes acuminés
                             Koïlocytose

                             .Transmission ++ IST
                             .Délai d’apparition cours
                             .Récidives fréquentes
                             .HPV-6, 11 (BR>>HR)

                             . Evolution vers guérison
                  Episomes   . Evolution vers infection
                             persistante
Infection productive

Différenciation cellulaire
                             Evolution vers la guérison

                                        . Latence dans les cellules
                                        basales
                                        . Contrôle immunitaire
                                        . Immunité spécifique de type
                                        . Tests HPV négatif

Evolution vers infection
      persistante
                Dysplasie CIN I

                .Transmission faible
                . Délai d’apparition long
        E6/E7   . Récidives rares
                . Régression très fréquente
                . HPV-16, 18 (HR)

Infection persistante
              Dysplasie CIN II

              .Transmission faible
              . Délai d’apparition long
      E6/E7   . Récidives rares
              . Régression possible
              . HPV-16, 18 (HR)

Infection persistante
              Dysplasie CIN III

              .Transmission faible
              . Délai d’apparition long
      E6/E7   . Récidives rares
              . Régression rare
              . HPV-16, 18 (HR)

Infection persistante
              Cancer in situ / invasif

              .Transmission faible
              . Délai d’apparition long
      E6/E7   . Récidives rares
              . HPV-16, 18 dans plus de
              70% des cas (HR)

Carcinogénèse du col utérin
       Infection transitoire         Infection persistante

                               HPV-HR + Cofacteurs:
                               tabac, grossesses multiples,
                               immunodépression, …

                      Progression                             Invasion

Col                                     Lésions
              infection                                       cancer
sain                                précancéreuses
                       Régression
     Contrôle
   imunologique                         10-15 ans
     Clairance

Plan
 Physiopathologie  de l’infection
 Les Tests HPV : principes et intérets
 La situation actuelle : nomenclature et
  indications
 Mise en oeuvre d’un test HPV

Objectifs des tests HPV

 Détection    de l’infection à HPV

 Prédiction
           du risque de dysplasies et
 Cancers ??!
  Corrélation avec histologie

Les tests disponibles

 Détection   par PCR consensus ADN HPV ±
 typage

 Détection   ARNm E6-E7 HPV-HR

 Détection   ADN HPV-HR

PCR concensus

   Amplification
                région L1 (HPV-HR/BR)
   Typage des amplicons :

    séquençage +        Hybridation sur         Hybridation sur puce
     phylogénie           bandelette
Fragment long        Fragment court             Fragment court
Sensibilité ++       Sensibilité +++            Sensibilité +++
Typage exhaustif     25 à 37 types               24 à 35 types
                     Lecture ± automatisée      Lecture automatisée
Non commercialisé    Inno-Lipa HPV genotyping   CLART (Genomica)
                     (Innogenetics)             PapilloCheck (Greiner)
                     Linear Array HPV
                     Genotyping (Roche
                     Diagnostics)

Détection ARNm E6-E7

 Amplification ARNm E6 et E7
 Détection automatisée
 Nuclisens EasyQ HPV                  APTIMA HPV Assay
 (BioMérieux - Proofer)               (Gen-Probe)
 Discrimination des types : 16, 18,   Détection des 14 HPV-HR
 31, 33, 45

 Spécificité
           accrue, conservation des ARN
 Hors nomenclature

Détection ADN HPV-HR
 Amplification/ Hydridation
 Détection automatisée
Hybrid Capture II           Real-Time HR HPV           Cobas 4800 HPV (Roche)
(Digene - Qiagen)           (Abbott)

Hybridation ADN/ARN         PCR-temps réel             PCR-temps réel
Pas de discrimination des   Discrimination : 16, 18,   Discrimination : 16, 18,
types 13 HR                 autres 12 HR               autres 12 HR
(possible 5 BR)
Automatisation ++           Automatisation +++         Automatisation +++
                                                       Pot natif

Sensibilité ++              Sensibilité +++            Sensibilité +++
Long++

Autres tests

 Quantification: 16 et 18 (protocole ANRS),
  non commercialisé
 Détection ADN HPV intégré : non
  commercialisé

Plan
 Physiopathologie  de l’infection
 Les Tests HPV : principes et intérets
 La situation actuelle : nomenclature et
  indications
 Mise en oeuvre d’un test HPV

Situation actuelle
   CODE : ZZQP173 - 4127
   LIBELLE : papillomavirus humains (HPV) oncogènes :
    détection du génome viral (ADN)
   Code regroupement : ATM - Acte technique médical
   Prix de l'acte : 37,8 euros (B140, P139)
   Notes : Indication : selon les recommandations de bonnes
    pratiques Anaes 2002 (frottis ASC-US)
   Formation : spécifique : formation à la biologie moléculaire
   Environnement : spécifique : à réaliser dans les mêmes
    conditions que celles des laboratoires d'analyse de biologie
    médicale

Nomenclature ABM 2004
   Identification des ASC-US à risque (Atypical
    Squamous Cells of Undetermined Significance)

                         ASC-US

    Colposcopie          HPV HR                    FCV (6 mois)
    + biopsie
                                                   FCV (1 an)

                                                   FCV (routine)

Autres indications
 Suivi   post-conisation
     Quel test ?
 Dépistage primaire d’infections HPV
 persistantes
     Tests ADN HPV positifs (intervalle > 1 an)
     Très bonne valeur prédictive négative cancer du col
     Spécifique de l’infection HPV pas du cancer du col!
     Algorithme de dépistage (FCV)
 Expertise     médicale
     Typage nécessaire
     Comparaison de séquences

Plan
 Physiopathologie  de l’infection
 Les Tests HPV : principes et intérets
 La situation actuelle : nomenclature et
  indications
 Mise en oeuvre d’un test HPV

Mise en œuvre
 Laboratoire     de biologie moléculaire
     Gestion du risque infection
     Gestion du risque de contamination BM
     Validation de la méthode
     Gestion de la qualité des échantillons
     Gestion de la traçabilité

Référentiels
 GBEA
 COFRAC ISO 15189

Gestion du risque infectieux
 Faible   avec HPV
   Possible autres pathogènes associés : HSV,
    Chlamydiae, Gonocoques, Mycoplasma, HIV, …
   Milieux fixateurs

 PSM  pour manipulations préanalytiques
 Procédure de décontamination
     Surface de manipulation
     Laboratoire
     Exposition du personnel

Gestion du risque de
         contamination en BM
 Liéà la diffusion des amplicons
 Adaptation des locaux
     Classiques 3 pièces ou moins si automatisé
     Laboratoire(s) avec accès contrôlé (Sas)
 Conditions     de manipulation
     tenue, hotte PCR,…
     Procédure et mode opératoire, formation, …
 Décontamination
     KOH, NaOCL, HCL
 Aliquotage     et conservation des réactifs

Gestion de la qualité des
          échantillons
 Standardisation  des échantillons
 Cellularité des échantillons
 Contrôle d’un gène de ménage
 Absence d’inhibiteur de PCR (QC)

Validation de la méthode
 Contrôles   des performances sur sites
   Comparatif avec données du fabricant
   Comparatif avec la méthode précédente

   Spécificité
   Répétabilité/reproductibilité
   Sensibilité diagnostique
   Contamination

Gestion de la traçabilité
 Chaîne   d’information validée
   Lien patient – échantillon
   Lien entre les différentes de l’analyse
   Lien bidirectionnel avec l’informatique de labo

 Conservation   de l’échantillon (≥ 1 an) et du
 résultat (indéfinie)

Contrôles
 Contrôles    du fabriquant
     Témoin négatif / positif

 Contrôles    de qualité interne indépendant
 (CQII)
   Validation indépendante de la totalité process
   Validation des lots de réactifs

 Contrôles    de qualité externe (CQE)

Conclusions
 Physiopathologie   complexe

 Des   tests et des indications en évolution

 Une   nomenclature en retard

 Untest de biologie moléculaire automatisé
 avec une praticabilité en hausse