TP 1 : Diagnostic bactériologique, ensemencements et observations microscopiques /1 10

UE9 - Agents Infectieux
MCU-PH à Bichat
Le     04/03/2019 de        14h à 15h30
Ronéotypeur : Gabriela Ostronoff
Ronéoficheur : Romane Bordernave

TP 1 : Diagnostic bactériologique, ensemencements
et observations microscopiques

Ronéo 7 - UE9 - TP n°1                              1/10

TP 1 : DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE
      ENSEMENSEMENTS
      OBSERVATIONS MICROSCOPIQUES

Plan et objectifs
-Bactéries de l’environnement et des flores
-Démarches du diagnostic bactériologique et de l’antibiogramme
-Réalisation et isolement d’un prélèvement à l’écouvillon de collet dentaire
-Isolement d’une urine sur glose CLED en méthode quantitative
-Ensemencement d’un antibiogramme à partir d’un isolement d’une souche bactérienne
-Observation microscopique avec l’objectif à l’immersion de frottis bactériens colorés par la
méthode Gram

I) Généralités sur les bactéries

• Les bactéries sont des procaryotes (êtres unicellulaires sans noyau). Les deux principales formes
  sont : les Bacilles (allongés), ou les Cocci (ronds). On divise les bactéries selon leur coloration
  Gram.

• Leur nomenclature est en latin, on note le genre en majuscule et l’espèce en minuscule.
Par exemple :
Famille : Entérobacteriaceae (entérobacterie)
Genre : Escherichia
Espèce : coli
note : E.coli s’appelle aussi colibacille (nom francisé)

Bactéries de l’environnement et des flores :
- il existe plus de 10^6 espèces de bactéries dans l’environnement/milieu extérieur ( eau, sol,
poussières..)
- plus de 10^5 espèces de bactéries commensales dans les flores humaines ( principales flores :
cutanée, oropharyngée, digestive, vaginale).
-on dénombre environ 10^2 espèces de bactéries pathogènes et on distingue les pathogènes
spécifiques (leur présence est systématiquement responsable d’une infection) des pathogènes
opportunistes (infection en cas de déficit immunitaire).
ex : Bacille de Koch (agent responsable de tuberculose) ou les shiguelles sont des pathogènes
stricts.

Lors du TP nous avons tenté de mettre en évidence les bactéries de l’environnement en laissant les
dépôts des poussières de l’air se déposer sur la gélose dans une boîte de Pétri « TSA ».

II- Diagnostic bactériologique direct et indirect

A- Diagnostic bactériologique direct

Diagnostic direct = recherche de la bactérie ou d’un de ses constituants.
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(microscopie, culture, recherche d’antigènes solubles, recherche d’ADN bactérien par PCR…)

Démarche du diagnostic bactériologique direct :
•       Le jour même :
               - prélèvement dans un récipient stérile et avant l’antibiothérapie
               - examen microscopique ( cytologie et coloration Gram)
               - diagnostic moléculaire / recherche d’antigènes bactériens
               - mise en culture ( A J0 le laboratoire informe sur l'aspect en coloration Gram des
bactéries)
•       Le lendemain :
               - Résultats des cultures ( la plupart des bactéries poussent en une douzaine d’heures)
               - Identification des colonies et Antibiogramme
•       Le surlendemain
               -Lecture de l’antibiogramme

1) Le prélèvement :

• Selon la symptomatologie (site)
– Fièvre élevée / frissons —> hémocultures
– Abcès, suppuration —> ponction ( Après désinfection cutanée au préalable/écouvillon)
– Signes d’infection urinaire —> ECBU
– Signes méningés —> LCR

• Tube, écouvillon, pots stériles (bouchon rouge)

Transport rapide au laboratoire selon le type :
- LCR ( +++ urgence, germes fragiles sensibles au froid)
- Urines ( éviter pullulation dans le pot, germes résistants au froid -> + 4 °C si délai )

2) Moyens de détection :

L'étude cytologique est réalisée grâce au microscope.

Recherche de polynucléaires neutrophiles (signe d’inflammation)

    Approche : - Quantitative si liquide (urines, LCR, pleural…)
il existe un seuil (nombre de cellules/mm3) à partir duquel on confirme une infection dans ce type
de prélèvement.

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exemple de l'ECBU : ( il existe un seuil pour les urines confir;ant l'infection urinaire )

       - Qualitative si pus ( coloration de Gram) pour identifier le type de bactéries

La coloration au MGG (May Grunwald Giemsa) est utilisée pour colorer les cellules lors d’une
formule leucocytaire (dans du LCR par exemple). Grâce au techniquage nous arrivons à compter les
cellules. La connaissance des caractéristiques morphologiques des cellules permet de distinguer les
différentes populations sur une lame colorée. (ex : les leucocytes sont 20 fois plus gros que les
bactéries 20microns vs 1micron)

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Réalisation coloration de Gram :
Violet de gentiane —> décoloration (alcool + acétone) —> contre coloration rose (fuchsine) :
                 – Bactéries à Gram positif : colorées en violet
                 – Bactéries à Gram négatif : colorées en rose
Les bactéries Gram+ retiennent la coloration violette et ne se décolorent pas grâce à leur paroi
épaisse (peptidoglycanes). Ceci permet de donner des indications sur la famille de bactérie et
d’initier un traitement par antibiotiques à large spectre (antibiothérapie probabiliste) le plus
rapidement possible sans devoir attendre la poussée des cultures.

Particularités :
 Certaines bactéries sont invisibles au Gram. On utilise des colorations spécifiques pour les mettre
en évidence : -Mycobactéries —> BAAR : coloration de Ziehl
             -Spirochètes —> très fins : microscope à fond noir, forme spiralée
             -Mycoplasmes —>absence de paroi
             -Chlamydiae —>intracellulaires stricts

 Exemples de types de lames avec coloration Gram :
• Peu ou pas de polynucléaires, bactéries polymorphes —> Image évoquant
  une flore commensale

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• Polynucléaires neutrophiles (inflammation) + Bactéries monomorphes +/- Images de
phagocytoses
—> Image évoquant un processus infectieux
—> Possibilité de mettre en place une ATB probabiliste en
fonction de l’aspect des
bactéries (gram +/- et forme) évoquant une famille de bactérie.

Mise en culture du prélèvement et identification des bactéries :

• Milieux de culture et durée de culture selon les germes rechercheś :

– Mycobactéries : Milieux spéciaux, culture lente (quelques semaines à quelques mois)
– « Bactéries courantes » : (24-48 h)

• Si le prélèvement est normalement stérile (ex:LCR) :
Milieu « riche » et bouillon de culture (milieu liquide)
• Si prélèvement est normalement polymicrobien (ex:selles) Milieu sélectif
• Attention aux bactéries ne cultivant pas sur milieux usuels : Mycoplasmes, chlamydiae,
  tréponèmes…

Technique de l’isolement en quadrant :

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• Identification des bactéries ( uniquement si la culture est positive !!!)

Prélèvement d’une colonie isolée (pour n’avoir qu’un seul type de bactéries)
– Examen microscopique : E.F.(mobilité), coloration Gram
– Tests d’agglutination avec des anticorps (sérogroupage, sérotypage)
– Nouvelle méthode : spectrométrie de masse +++
– Tests biochimiques réalisés sur colonies : exemple : acidification ou non des
sucres contenus dans la bactérie (technique obsolète remplacée par la spectrométrie de masse)

• Antibiogramme

Le but : tester la sensibilité / résistance de la bactérie vis-à-vis de plusieurs antibiotiques par la
mesure du diamètre d'inhibition de la culture autour d'un disque imprégné d'antibiotique.

Lecture de l'antibiogramme : il faut attendre environ une journée pour que les bactéries poussent

Recherche d’antigènes solubles :

Ag solubles = morceaux de bactéries mortes (capsule, paroi)
Les Ag solubles sont recherchés dans les liquides biologiques (LCR, urines, ponction...) avec un
anti-sérum spécifique d’une bactérie
On obtient une bandelette d’immunochromatographie.

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Il s'agit d'un test de dépistage rapide. L'agglutination du complexe immun (antigène-anticorps) est
visible à l'oeil nu.

Surtout utilisé pour les pneumocoques responsables de pneumopathie —> recherche dans les urines
des Ag solubles (signe l’infection récente)
Aussi utilisé pour la legionelle qui est difficilement cultivable.

Recherche d’ADN bactérien (PCR) : biologie moléculaire

B- Diagnostic bactériologique indirect :

Il s'agit de la recherche de la réaction immunitaire de l'hôte contre la bactérie.
         - Sérodiagnostic (anticorps)
         - Intradermoréaction (immunité cellulaire)

III- Manipulations

1)Mise en évidence des bactéries de l'environnement :

but : nous illustrer la présence de bactéries sur les particules de l’air
de notre salle de TP. On tente ici de les mettre en culture pour qu’elles soient visibles sous forme
de colonies.

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2)Ensemencement d'un prélèvement de collet dentaire :

3)Ensemencement quantitatif d'un prélèvement d'urine

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4)Ensemencement d'un
                         antibiogramme :

                         on peut comparer les
                         concentrations
                         minimales inhibitrices
                         (Cmi)
                         de chaque antibiotique
                         pour sélectionner
                         l'antibiotique ayant la
                         Cmi plus basse
                         =plus efficace)

                                 Puis nous avons
                                 observe des
                                 lames au MO.

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