A New Era in Prenatal Diagnosis: The Use of Cell-Free Fetal DNA in Maternal Circulation for Detection of Chromosomal Aneuploidies Une nouvelle ère ...

A New Era in Prenatal Diagnosis: The Use of
Cell-Free Fetal DNA in Maternal Circulation
for Detection of Chromosomal Aneuploidies

Une nouvelle ère dans le diagnostic prénatal :
la détection des aneuploïdies chromosomiques
par analyse de l'ADN foetal dans le sang
maternel
   Jennifer L. Shea, Moderateur1, Eleftherios P. Diamandis, Moderateur1,2,3,*, Barry Hoffman,
   Expert1,3, Y.M. Dennis Lo, Expert4, Jacob Canick, Expert5 et Dirk van den Boom, Expert6

Affiliations des auteurs
   1
     Département de médecine de laboratoire et de biopathologie, Université de Toronto, Toronto,
   Ontario, Canada ;
   2
     Département de biochimie clinique, Université Health Network, Toronto, Ontario, Canada ;
   3
     Département de pathologie et de médecine de laboratoire, Hôpital Mount Sinai, Toronto,
   Ontario, Canada ;
   4
     Institut des Sciences de santé Li Ka Shing, Université chinoise de Hong Kong, Hong Kong
   SAR, Chine ;
   5
     Division de dépistage médical et de tests spécifiques, Département de pathologie et de
   médecine de laboratoire, Hôpital Femme, Mère, Enfant, Alpert Medical School of Brown
   University, Providence, RI, USA ;
   6
     Sequenom, Inc., San Diego, CA, USA.

   * Adresse de correspondance pour cet auteur : Mount Sinai Hospital, 60 Murray St., 6 th Floor,
   Toronto, Ontario, M5G 1X5 Canada. Fax 416-586-8628 ; e-mail ediamandis@mtsinai.on.ca.

Le dépistage prénatal des aneuploïdies chromosomiques constitue une part fondamentale des soins
obstétricaux de routine dans la plupart des pays. En règle générale, l'âge maternel, le poids, l'origine
ethnique, les biomarqueurs sériques (y compris les dosages du PAPP A (pregnancy-associated
plasma protein A), de l’HCG (human chorionic gonadotrophin), de l’α-foetoprotéine, de l'inhibine
A et de l’oestriol), et les caractéristiques échographiques (notamment la clarté nucale) sont inclus
dans un algorithme de risque pour déterminer la probabilité que le fœtus soit affecté. Les femmes
enceintes identifiées comme à risque élevé au cours du dépistage prénatal peuvent ensuite être
soumises à des procédures invasives comme l'amniocentèse et le prélèvement de villosités
choriales, afin de confirmer le diagnostic. Les méthodes de dépistage prénatal actuelles sont
capables d'identifier environ 90 % des grossesses atteintes de la trisomie 21 (syndrome de Down)
avec un taux de faux positifs d'environ 5 %. La prévalence des aneuploïdies étant faible, 5 % de

faux positifs implique qu’un nombre important de femmes non affectées subiront un examen
invasif, ce dernier comportant un risque non négligeable de fausse couche. La découverte d'ADN
fœtal circulant dans le plasma des femmes enceintes il y a 14 ans a ouvert la voie à une possible
identification des anomalies chromosomiques à l’aide de méthodes non invasives après une
simple prise de sang. Environ 10 % de l'ADN circulant dans le sang maternel est d'origine fœtal.
Cette découverte a permis par la suite la détermination du statut rhésus D et du sexe du fœtus dans
le sang maternel. L’arrivée des séquenceurs de nouvelle génération a permis de développer la
détection des aneuploïdies notamment la trisomie 21 à partir du sang maternel. Pour simplifier, la
proportion d’ADN chromosomique issu du chromosome 21 présente dans le sang maternel est
directement évaluée. Lorsqu’elle dépasse un certain seuil, une trisomie 21 est établie. D’après
certaines études cliniques, comparée au caryotype par les moyens invasifs classiques, la
performance clinique de ce test prénatal non invasif est encourageante avec une sensibilité de
100 % et une spécificité de 98 %-99 %. En deuxième intention, cette analyse permet non
seulement de réduire sensiblement le nombre de femmes susceptibles d’être soumises à des
procédures invasives mais aussi de réduire considérablement les coûts. Dans cet article, 4 experts du
diagnostic prénatal non invasif rapportent leur opinion dans ce domaine en pleine évolution.

Pouvez-vous décrire brièvement comment le séquençage de nouvelle génération (SNG)7 a été
appliqué à la détection des aneuploïdies à partir d’ADN foetal circulant ? Existe-t-il d’autres
techniques permettant aussi ce type d’analyse ?

Barry Hoffman : Dans le cadre d’un diagnostic prénatal à partir de sang maternel, Le SNG permet
de détecter une aneuploïdie en déterminant la proportion relative d’ADN foetal anormale dans
l’ADN circulant total. Le séquençage massif en parallèle de millions de fragments d’ADN à une
profondeur de couverture appropriée permet de quantifier la variation infime de fragments de
chromosomes (augmentation ou diminution) responsable d’une aneuploïdie dans le sang maternel. 2
approches sont possibles, l’approche globale, non ciblée par séquençage aléatoire de l’ensemble de
l’ADN circulant ou alors une approche ciblée. Dans ce dernier cas, le chromosome cible susceptible
d’aneuploïdie est analysé en parallèle d’un autre chromosome. L’approche ciblée est moins lourde
car elle nécessite une analyse plus restreinte de l’ADN améliorant ainsi le nombre
d’échantillons analysables et le coût des réactifs nécessaires. Elle est cependant plus complexe
car elle nécessite de choisir judicieusement les régions d’intérêt. Certaines méthodes corrigent
les biais de calcul résultant de la disproportion existant entre la quantité d’ADN foetal et
maternel présents dans le sang circulant, l’ADN maternel représentant la majeure partie de
l’ADN circulant. Typiquement, l’ADN foetale constitue 10 % de l’ADN circulant total. Des études
ont aussi montré qu’on pouvait obtenir des résultats fiables avec des fractions de 3-4 %. Afin
d’enrichir la fraction d’ADN foetal, une autre approche basée sur la méthylation différentielle entre
l’ADN foetal et maternel a également été rapportée.

Dennis Lo : La plupart des études publiées basée sur l'utilisation du SNG dans la détection des
aneuploïdies utilise le séquençage aléatoire (« shotgun »). Après localisation sur le génome humain
de référence, les données obtenues établissent une représentation proportionnelle de chaque
chromosome dans le plasma maternel. Dans le cas d’une une trisomie, le chromosome aneuploïde
sera « sur-représenté » dans le plasma maternel. D’autres études ont utilisé une approche ciblée.
Des séquences issues des chromosomes d’intérêt sont sélectionnées par capture puis amplifiées et
séquencées. Différentes du SNG, d’autres techniques de recherche d’aneuploïdie ont été rapportées
telles que l’étude de la méthylation différentielles de certains locus ADN ou l’analyse de ratio
d’allèles à partir de l’ARN. Néanmoins, Ces études n’ont pas atteints à ce jour la maturité en terme
de robustesse et d’analyse comparativement aux études basées sur le SNG.

Jacob Canick : La découverte fondamentale du professeur Lo en 1997, selon laquelle de l'ADN
foetal et maternel circule dans le sang des femmes enceintes a permis d'établir les bases biologiques
au développement du SNG pour la détection des aneuploïdies. Le séquençage en parallèle de
millions de fragments d'ADN permet l'identification de chacun des chromosomes d'origine à l'aide
d'outils informatiques. Par conséquent, la capacité à discerner une trisomie fœtale de l'ADN
maternel euploïde constitue un difficile exercice analytique. Un fœtus atteint de trisomie entrainera
une augmentation de 50 % de la contribution de ce chromosome à l'ensemble des fragments
séquencés. Mais cette augmentation sera pondérée par la proportion d'ADN foetal présent dans le
plasma maternel. L'augmentation réelle résultant de la trisomie foetale sera, en moyenne, la moitié
du pourcentage d'ADN foetal présent dans l'échantillon. D'autres techniques d'analyse réalisées avec
un certain succès mettent en jeu les variations épigénétiques qui existent entre l'ADN foetal et
maternel (telle que la méthylation) ou de l'ARN (transcription différentielle spécifique de la mère et
du fœtus). Néanmoins, ces variations épigénétiques sont différentes selon les populations. Il est
donc difficile d'appliquer ces méthodes à l’ensemble de la population.

Dirk van den Boom : Les principales questions suscitées par la publication de Dennis Lo de 1997
concernaient (A) le choix de l’analyte le plus approprié (ADN, ARN) afin de permettre un recueil
d'échantillon commercialement exploitable; (B) l'optimisation du rendement d'extraction de l'acide
nucléique; et (C) l’identification de la technologie la plus appropriée pour détecter de manière fiable
l’aneuploïdie fœtale à partir de l'analyte choisi, l'information recueillie dans le sang circulant ou le
plasma maternel étant essentiellement d'origine maternelle. Différentes méthodes ont été étudiées
parmi lesquelles les méthodes basées sur l'analyse de l'ARN, les méthodes reposant sur des
différences épigénétiques entre le génome maternel et fœtal, et différentes technologies de
détection, y compris la PCR digitale, la spectrométrie de masse et le séquençage. Le SNG est
actuellement la technologie de détection privilégiée, car il analyse une quantité massive de données
permettant la détection précise d'une trisomie fœtale. Au Centre de médecine moléculaire
Sequenom, nous avons choisi de mettre en œuvre une approche de séquençage « génome entier »
pour la détection d'une aneuploïdie fœtale. L'ADN est extrait du plasma maternel. La plupart de
l'ADN extrait est de nature apoptotique et fragmentée en petits morceaux (environ 150 pb). Ensuite,
une bibliothèque d'ADN représentative des génomes de la mère et du fœtus est préparée à partir de
ces fragments. Après amplification, les millions de fragments d'ADN obtenus à partir de la
bibliothèque sont séquencés en parallèle. Chaque composant de la bibliothèque permet d'obtenir une
séquence informative de 36 bases, suffisante pour identifier de manière spécifique l'origine
chromosomique de la séquence/fragment. Après séquençage, chaque fragment est localisé et
quantifié pour chaque chromosome dans le génome. Les données ainsi recueillies permettent de
calculer la représentativité relative de chaque chromosome par rapport à un ensemble de
chromosomes de référence. La valeur obtenue est corrélée étroitement à la taille du chromosome. Il
s'agit d'une mesure précise et stable basée sur l'analyse d'un grand nombre fragments (plusieurs
millions), chaque fragment constituant un marqueur indépendant. À partir de là, la détection d'une
trisomie fœtale, comme la trisomie 21, devient assez simple. L'ADN libre plasmatique d'une
femme enceinte portant un fœtus atteint de trisomie 21 aura une sur-représentation de fragments du
chromosome 21 par rapport à un ensemble de chromosomes de référence. Celle-ci sera identifiée au
cours de l'analyse informatique. Ce principe d'analyse dans le cadre de la recherche d'une trisomie
21 peut être généralisé à toute aneuploïdie. Bien que le test de laboratoire MaterniT21™ Plus
actuellement commercialisé par le Centre de médecine moléculaire Sequenom se concentre
actuellement sur les chromosomes 21, 18, et 13, notre approche génome entier est applicable à toute
recherche d'aneuploïdie sans modification de la méthode, les essais de validation clinique ayant
démontré ses performances analytiques. Le coût du SNG diminuant, ce test défini comme un
caryotype non invasif pourrait finalement remplacer les tests cytogénétiques invasifs actuels.

Différentes plates-formes de SNG ont-elles été évaluées dans le but d’un diagnostic prénatal non
invasif ? Y a-t-il des différences notables ?

Barry Hoffman : Un certain nombre de plates-formes de SNG ont été évaluées pour le test prénatal
non invasif (TPNI), y compris ceux d'Illumina, Ion Torrent et Applied Biosystems. Les 3 plates-
formes amplifient par PCR clonale les fragments d'ADN, soit par PCR en émulsion soit par PCR en
pont avant séquençage. Ceci possède l'inconvénient d'introduire un biais de séquence adénine-
thymine (AT)/guanine-cytosine (GC) qui doit être corrigé ultérieurement. Les 2 premières plates-
formes utilisent le principe du séquençage par synthèse à l'aide d'une ADN polymérase, tandis que
la dernière utilise le principe de la synthèse par ligation à l'aide d'une ADN ligase. Les nucléotides
sont séquentiellement ajoutés à la matrice d'ADN simple brin par l'ADN polymérase ou l'ADN
ligase. Le séquenceur les identifie et établit la séquence. Dans le cas du Ion Torrent, les 4
nucléotides sont ajoutés successivement un par un de manière cyclique, et l’ion hydrogène qui se
dégage lorsqu’un nucléotide est incorporé puis détecté. Les 2 autres plates-formes utilisent des
nucléotides incorporant un fluorophore. Malgré ces différences, les études ont montré que les 3
plates-formes sont capables de diagnostiquer la trisomie 21 dans le sang maternel. Dans un avenir
proche, de nouvelles technologies se passeront d'amplification et de séquençage par synthèse pour
déterminer une séquence. Ces progrès permettront de réduire sensiblement les coûts des réactifs et
le délai d'exécution du test (TAT), facilitant ainsi l'application du SNG à la médecine clinique.

Dennis Lo : Jusqu'à présent, la plupart des publications ont fait état de l'utilisation de plate-forme
de séquençage par synthèse. Certaines publications de plate-forme de séquençage par ligation. Les
résultats obtenus grâce à ces plates-formes sont généralement comparables. Cependant, les
protocoles de séquençage et les analyses bio-informatique affectent le taux de résultat non
intérprétable « No-call » (aucun résultat possible) et posent la question de la nécessité de
renseignements cliniques supplémentaires (par exemple, l'âge gestationnel et l'âge de la mère) pour
l'interprétation. Ces 2 plate-formes utilisant la PCR, un biais de GC est observé. Pour la détection
des aneuploïdies impliquant les chromosomes particulièrement sujets à ce biais (par exemple, les
chromosomes 13 et 18), des algorithmes bio-informatiques spécifiques particulièrement efficaces
sont nécessaires pour les corriger. Deux publications récentes ont décrit l'utilisation d'un séquenceur
simple molécule ne nécessitant pas d'amplification à partir de sang maternel. Dans ce cas, le biais
GC ne semble plus être un problème. Il serait intéressant de tester un certain nombre de nouvelles
plates-formes de séquençage simple molécule ( (par exemple, le séquenceur nanopore) pour cette
application.

Jacob Canick : À ma connaissance, 2 plates-formes de SNG ont été testées et validées pour cette
application. L’étude la plus vaste a été réalisée en utilisant la méthode de séquençage par synthèse
sur la plateforme Illumina ( HiSeq 2000. Une étude de 2010, réalisée en utilisant le système
SOLiD™ 3 d'Applied Biosystems (séquençage par ligation), a démontré son efficacité.

Dirk van den Boom : Bien qu'il existe quelques publications décrivant des évaluations
préliminaires d'autres plates-formes de SNG telles que le système SOLiD™ ou le système
Heliscope (Helicos), nous avons choisi d’implanter le test développé en laboratoire MaterniT21
Plus sur la plate-forme Illumina HiSeq 2000. Les principaux moteurs de cette décision étaient la
grande qualité des données et la maturité de la technologie mises en évidence lors de notre étude de
validation clinique. Le caractère approprié du flux de travail dans un laboratoire clinique, la
capacité d'échantillonnage et les considérations de coût ont également été déterminants dans notre
choix.

Quel est le délai de rendu de résultat de cette méthode ? A quelle période de gestation ce test doit-
il être réalisé ? Où la situer en comparaison aux pratiques actuelles de dépistage sérique
maternel ?

Barry Hoffman : Les délais d'exécution des tests de SNG disponibles dans le commerce pour la
détéction de la trisomie sont typiquement de l'ordre de 1,5 à 2 semaines, un peu plus long que les
délais de 2 à 5 jours couramment réalisés par les dépistages sériques maternels classiques au cours
du premier ou du deuxième trimestre de grossesse. La vitesse du SNG dépend de la façon dont le
laboratoire d'analyse a automatisé, simplifié et harmonisé de manière efficace de « bout en bout »
les étapes distinctes nécessaires pour générer un résultat clinique (sélection de la cible, construction
d’une bibliothèque, préparation du modèle, séquençage, traitement des données et interprétation).
D'autres facteurs interdépendants qui influent sur la vitesse de traitement comprennent la rapidité
intrinsèque de séquençage de la machine, le nombre d'échantillons multiplexés qui peuvent être
combinés en un seul passage, la qualité et la longueur des séquences lues qui, à leur tour ont un
impact sur la profondeur requise de couverture et l'alignement avec le génome. Bien que la quantité
absolue et relative de l'ADN fœtal dans l'ADN libre circulant chez la mère est plus faible au début
de la gestation, les études ont montré que le TPNI peut détecter de manière fiable les trisomies
fœtales dès la 10e semaine de gestation. Une telle analyse à la fin du premier trimestre s'intègre
parfaitement dans la pratique obstétrique actuelle et l'émergence du concept de première visite de
routine à l'hôpital à la fin du premier trimestre de grossesse, au cours de laquelle la recherche
d'anomalies anatomiques et le dépistage de la trisomie chez le fœtus et d'une pré-éclampsie
d'apparition précoce sont réalisés.

Dennis Lo : Le délai d’exécution est d'environ 7-10 jours. Le test peut être effectué dès la dixième
semaine de gestation. Ce délai est tout à fait compatible avec les pratiques actuelles d'analyse du
sérum maternel. Par exemple, les femmes enceintes peuvent d'abord être examinées par
échographie pour l'évaluation de la clarté nucale du fœtus et par test sérique maternel au premier
trimestre. Les femmes à haut risque dépistées par ces tests peuvent ensuite subir le test de SNG en
utilisant l'ADN plasmatique maternel. De même, le délai est également compatible avec un
dépistage sérique maternel au cours du second trimestre.

Jacob Canick : Dans une étude dans laquelle le centre de médecine moléculaire Sequenom a testé
en temps réel près de 2000 échantillons en 9 semaines, le temps d’exécution a été de moins de 10
jours pour 18 des 20 dernières séries de 90 échantillons. Cette durée est similaire au délai
d’exécution typique pour l'analyse d’un caryotype à partir de liquide amniotique et de villosités
choriales. Le temps dévolu à la technologie de SNG et à l'analyse bio-informatique devrait diminuer
au cours des prochaines années. Le dépistage sérique maternel (avec ou sans échographie fœtale) a
en théorie un délai de rendu moyen de 2-3 jours ouvrables. Cependant, dans la plupart des cas, une
fois l'échantillon dans le laboratoire, le rendu du résultat est réalisé généralement en un jour.

Dirk van den Boom : Dans notre centre, nous avons en moyenne actuellement un délai d’exécution

rapport aux marqueurs biochimiques actuellement utilisés.

Ce test est-il actuellement commercialement disponible ? Si c’est le cas, quel est son coût ?

Barry Hoffman : Le TPNI de l'ADN fœtal libre dans le plasma maternel pour la détection des
trisomies 21, 18 et 13 est actuellement proposé commercialement aux États-Unis par un certain
nombre d'entreprises, y compris le centre de médecine moléculaire Sequenom (MaterniT21 Plus®),
Ariosa Diagnostics Inc. (Harmony Prenatal Test®) et Verinata Health (Verifi®). Ces tests sont
destinés à des grossesses à haut risque de trisomie 21 et sont disponibles sur demande après
prescription médicale. Un test apparenté pour l’aneuploïdie touchant les chromosomes sexuels (XO
et, récemment, XXY, XXX, et XYY) est disponible dans certains cas, tout comme l’assignation de
genre. Le coût du test de la trisomie varie de 795 $ à 2760 $. En Asie et en Europe, différents
accords de commercialisation ont été obtenus pour fournir des tests similaires. Au Canada, le test
Harmony est commercialisé depuis janvier 2013.

Dennis Lo : Le test est maintenant commercialement disponible. Les coûts ont été estimés à 1000 $
à 3000 $ par test.

Jacob Canick : Oui. Comme indiqué ci-dessus, aux États-Unis il y a actuellement 3 laboratoires
commerciaux offrant une recherche d'aneuploïdie dans le plasma maternel LifeCodexx AG de
Konstanz, en Allemagne, offre maintenant un test dans les pays européens germanophones , de
mêm en Chine, l'Institut de génomique de Beijing et la société Berry Genomics acceptent des
échantillons. Natera, Inc., de San Carlos, en Californie, a annoncé son intention de proposer des
tests fin 2012. Les prix pour les tests proposés aux États-Unis varient de 795 $ à 2700 $, et, dans
certains cas, une prise en charge par une assurance santé est possible.

Selon vous, pensez-vous que ce test sera finalement disponible dans la plupart des laboratoires
cliniques, ou pensez-vous qu’il sera uniquement proposé par les centres spécialisés ?

Barry Hoffman : Actuellement, le TPNI de la trisomie 21 en Amérique du Nord est disponible
uniquement dans des laboratoires nationaux ou régionaux spécialisés exploités par des entreprises
commerciales et le resteront probablement encore dans un avenir proche. . Cependant, comme le
test évolue, on peut envisager le développement de services clé en main de tests génétiques
prénataux, automatisés de bout en bout et ciblés sur un certain nombre d'anomalies, facile à utiliser
pour des laboratoires souhaitant offrir ce type de service. Le transfert de cette analyse des
entreprises commerciales vers des laboratoires d'analyse nécessiterait l'achat de licences et de kits
propriétaires. La diffusion de ces tests à des centres locaux ou régionaux peut se discuter d'autant
plus qu'elle correspond bien à la nécessité d'un court délai du rendu de résultat et à l'existence de
centres spécialisés déjà existants ayant des spécialistes compétents permettant d’assure un
diagnostic prénatal de qualité. Cette infrastructure possède les moyens de conseils pré- et post-
nataux nécessaires, le suivi au cours et après le test non invasif, la prise en charge globale de la
patiente et notamment son information mais aussi l'établissement d'analyses statistiques permettant
d'évaluer les performances du tests par rapport aux tests référents. Une telle exigence exclut
cependant son utilisation dans la plupart des laboratoires d'analyse.

Dennis Lo : Le SNG étant coûteux et nécessitant un support bio-informatique considérable, je crois
qu'il serait plus simple qu’il soit offert par les centres spécialisés, chacun desservant une région
géographique particulière.

Jacob Canick : Cette nouvelle technique nécessite des besoins coûteux en séquenceur, en bio-
informatique, en stockage des données informatiques et en recueil des échantillons ainsi qu'un
personnel spécifiquement formé et spécialisé afin de s'assurer tant d'un résultat de qualité que d'un
résultat en un temps déterminé. En outre, les questions de propriété intellectuelle ont conduit à un
certain nombre de procès entre les entités commerciales. Bien que dépendant de l'issue de ces
actions en justice, il semble peu probable que dans un avenir proche de nombreux laboratoires
cliniques valident et offrent ce test. Finalement, les progrès en bio-ingénierie vont sans aucun doute
simplifier, accélérer et réduire les problèmes de coûts, de sorte que ces méthodes et d’autres
méthodes génomiques encore plus complexes deviendront possibles pour la plupart des laboratoires.

Dirk van den Boom : À ce stade, la réalisation des tests de SNG est encore complexe en termes
de flux de travail et de besoins en infrastructures informatiques et bio-informatiques, nécessitant des
investissements importants. Une validation analytique et clinique adéquate des tests de SNG pour
le diagnostic prénatal n'est pas triviale et nécessite de grandes collections d'échantillons. Par
conséquent, je crois que seuls les centres spécialisés devraient offrir cette technologie jusqu'à ce que
des systèmes simples d’utilisation de ces tests et qui ne compromettent pas l'exactitude soient
disponibles.

Une prise de position récente publiée par l’International Society for Prenatal Diagnosis (ISPD)
en 2011 a déclaré que l'utilisation de SNG pour le dépistage avancé de la trisomie 21 doit être
effectuée uniquement sur les populations à haut risque. Quels progrès ont été faits l'année
dernière pour soutenir la généralisation du dépistage sur les populations à faible risque ?

Barry Hoffman : Lorsque l’ISPD a publié ses recommandations, elle a était prudente, dans la
mesure où les études cliniques à ce stade n'avaient validé le test que dans les grossesses à haut
risque pour le syndrome de Down. Depuis, de nombreuses études sur les grossesses à haut risque
ont confirmé que le TPNI de l'ADN libre dans le plasma maternel peut détecter > 99 % des
grossesses avec trisomie 21, avec un taux de faux positifs < 1 %, mais la performance de dépistage
des trisomies 18 et 13 a été moins robuste. L’ISPD a également reconnu que ce n'est pas parce que
le test montre des performances quasi parfaites sur les populations à haut risque que la même
performance serait nécessairement obtenue dans une population normale . Fin novembre 2012, la
première étude a été évaluée la performance du dépistage de la trisomie 21 et de la trisomie 18 par
séquençage ciblé sur une population de 2049 femmes sans risque connu. L'étude a conclu que le
TPNI de l'ADN fœtal libre dans le plasma maternel d'une population sans risque connu était aussi
performante que dans une population à risque. D'autres études sur des populations de femmes sans
risque connu sont actuellement en cours et les résultats sont attendus dans les 6-12 prochains mois.
La validation du test dans les populations sans risque connu simplifiera la décision des femmes et
des soignants dans leur choix analytique pour le dépistage prénatal de l'aneuploïdie.

Dennis Lo : Le principal déterminant biologique de l'exactitude des tests d’aneuploïdie fœtale
utilisant le séquençage d'ADN à partir de plasma maternel est la concentration relative d'ADN fœtal
dans le plasma maternel. Pour autant que je sache, il n'existe aucune preuve que les femmes
classées à haut risque par les tests de dépistage classiques aient une concentration d'ADN fœtal

différente de celle des femmes à faible risque. Ainsi, je suis convaincu que le test de SNG a la
même performance analytique sur les populations à faible risque. La question est plus d'ordre
économique, car il y a beaucoup plus de femmes à faible risque qu’à haut risque. Espérons qu'avec
la réduction future du coût du séquençage et des processus associés, cette contrepartie économique
sera moins un problème. Je pense donc de manière optimiste qu’à moyen et long termes, le test
d'ADN à partir de plasma maternel pour le dépistage de l'aneuploïdie deviendra un test de première
ligne.

Jacob Canick : La question du dépistage basé sur l'ADN proposée à toutes les femmes enceintes
devrait être abordée en se posant deux questions : existe-t-il une base biologique/scientifique
permettant d'attendre des performances différentes sur la population générale par rapport à la
population à haut risque, et y a-t-il des raisons plus pragmatiques et non scientifiques d'attendre
avant la mise en place d’un dépistage basé sur la population ? Nous avons examiné s'il existe des
covariables pour ce type de test (variables indirectes qui ont un impact sur les résultats), dont un
certain nombre est lié à la question des différences entre les grossesses à faible et à haut risque, et la
réponse a toujours été non. Par exemple, le fait d'être à haut risque ne change pas la fraction fœtale
ou le résultat du test (score z) qui est attribué aux patientes avec une trisomie 21 ou euploïdes. En
outre, les marqueurs phénotypiques spécifiques qui sont actuellement utilisés (à savoir les différents
marqueurs sériques et le marqueur de l'échographie fœtale, la clarté nucale) ne sont pas ou peu
associés à la fraction fœtale ou au score z. Actuellement, les raisons les plus importantes pour ne
pas utiliser le SNG sur la population générale sont d’ordre pratique : coût excessif et délai
d’exécution, incertitudes concernant le remboursement de l'assurance maladie et nombre insuffisant
de laboratoires effectuant le test.

Dirk van den Boom : L'utilité du SNG a été largement validée chez les femmes enceintes à haut
risque d'aneuploïdie fœtale. Cela comprend les femmes d'âge avancé, les antécédents familiaux
d'aneuploïdie fœtale, les résultats de dépistage sérique positif ou les résultats de l'échographie. En
plus de l’ISPD, le Collège américain des obstétriciens et gynécologues et la Société de médecine
fœto-maternelle ont émis un avis conjoint recommandant que le test d’ADN fœtal libre soit offert
aux patientes à risque élevé d'aneuploïdie. Le forum d'évaluation technologique de Californie a
récemment terminé une évaluation indépendante et a recommandé l'utilisation de l'ADN fœtal libre
comme test de dépistage prénatal de l'aneuploïdie fœtale des trisomies 21 et 18 chez les femmes à
haut risque répondant à 5 critères de sécurité, d’efficacité et d'amélioration des résultats pour la
santé. Une première étude combinant SNG et approche ciblée pour la détection de la trisomie fœtale
a été publiée récemment. Cette étude a inclus un nombre limité de femmes à faible risque, et je crois
que d'autres études de validation seront nécessaires avant qu'un tel test ne soit généralisable. À ce
stade, les approches de dépistage sérique actuellement disponibles restent plus rentables pour la
population générale/à faible risque en dépit de leur mauvaise performance. Ils peuvent par ailleurs
identifier des complications au cours de la grossesse non détectables par l'analyse de l'ADN foetal
circulant

Cette technologie a-t-elle été appliquée à des aneuploïdies chromosomiques autres que la trisomie
21 ? Qu'en est-il des maladies résultant de mutations ponctuelles ?

Barry Hoffman : Les études publiées ont démontré le potentiel du SNG pour détecter un large
spectre d'anomalies moléculaires dans l'ADN fœtal libre circulant, y compris les aneuploïdies, les
délétions, les insertions, les polymorphismes « simple nucléotide », et les variants du nombre de
copies. La technologie doit être optimisée afin d'identifier chaque type d'anomalie, et doit résoudre

des problèmes tels que la longueur des transcrits séquencés, et le développement d'algorithmes de
bio-informatique spécialisés, ces derniers influençant fortement la qualité et la fiabilité des résultats.
Il est concevable de penser que le SNG remplacera les puces d'hybridation pour la détection des
anomalies fœtales, et il n'y a aucun obstacle au développement de plates-formes de séquençage
« multimodales » capables de détecter de manière fiable toutes sortes d'anomalies moléculaires
d'ADN et de variants en un seul passage. Actuellement, la technologie est réalisée à l'aide de kits
commerciaux pour la détection d'aneuploïdies des chromosomes sexuels, telle que les syndromes de
Turner (monosomie X) et de Klinefelter (XXY), et pour la recherche de l'incompatibilité Rhésus.

Dennis Lo : En plus de la trisomie 21, la technologie a été appliquée aux trisomies 13 et 18, ainsi
qu’au syndrome de Turner. Il existe également des données montrant que le séquençage peut être
utilisé pour détecter le syndrome de Down résultant d'une translocation robertsonienne, ainsi que
des microdélétions chromosomiques. Pour ces dernières, la profondeur de séquençage devrait être
augmentée. Nous avons montré que l'approche de séquençage peut être utilisée pour le diagnostic
prénatal non invasif de maladies monogéniques (par exemple les β-thalassémies), y compris les cas
produits par des mutations ponctuelles. Pour de telles applications, une approche de séquençage
ciblée semble être plus rentable.

Jacob Canick : Il est intéressant de noter que la trisomie 21, l'aneuploïdie la plus fréquente à la
naissance, semble également être la plus facile des aneuploïdies cliniquement importantes à être
identifiée par SNG à partir de l'ADN plasmatique maternel. Il a été plus difficile initialement de
dépister les trisomies 18 et 13, et la monosomie X que la trisomie 21. Actuellement, l'analyse est
suffisamment fiable pour permettre d'évaluer l'utilisation clinique de SNG dans ces indications.
Cependant, pour établir un diagnostic définitif de trisomie 21, il est systématiquement nécessaire de
confirmer un test non invasif positif par un test invasif afin d'éliminer les faux positifs (détection
des fœtus euploïdes faussement rendus positifs).

Dirk van den Boom : L'étude clinique de validation pour le test MaterniT21 Plus a inclus les cas
de trisomies fœtales 18 et 13, en plus de la trisomie 21. Les deux ont été détectés avec une précision
diagnostique élevée En outre, notre technologie pour la détection des aneuploïdies fœtales utilise
une approche qui en principe peut évaluer le génome entier. Comme les échantillons de trisomies
fœtales autres que 21, 18 ou 13 deviennent disponibles pour la validation clinique, la performance
du test actuel en utilisant le SNG peut être évaluée, et un résultat rendu si ces autres trisomies
venaient à être signalées. Les premiers résultats pour la détection des aneuploïdies sexuelles fœtales
par SNG, par exemple, ont également été publiés récemment. Plusieurs groupes de recherche ont
publié des études démontrant la possible mise en évidence par une recherche ciblée de mutations
ponctuelles de l'ADN fœtal libre, en particulier pour les cas indiqués par les antécédents familiaux
et/ou le statut de porteur des parents. Dennis Lo et son équipe ont été les pionniers dans l'évaluation
de la détection de mutations ponctuelles par le séquençage du génome fœtal entier à partir d'ADN
fœtal libre. Bien que ce travail soit très intéressant et plein de promesse, la mise en œuvre
commerciale potentielle va nécessiter une réduction des coûts de séquençage et, bien sûr, une
validation analytique et clinique en sus de ce qui a été accompli à ce jour.

Cette technologie peut-elle s’appliquer aux jumeaux ? Qu’en est-il pour les grossesses par
fertilisation in vitro avec donneur ?

Barry Hoffman : La grossesse multiple est actuellement une contre-indication au TPNI d'ADN

fœtal libre dans le plasma maternel et doit être absolument exclue par échographie avant la
prescription du test. Lorsque des jumeaux sont détectés, une alternative à cette analyse est le
dépistage classique à l'aide des biomarqueurs biochimiques et d'imagerie, même si il est bien établi
que les performances du dépistage traditionnel pour une grossesse multiple sont moindres que pour
les grossesses simples. Cependant, il n'y a aucune raison a priori pour que l'analyse moléculaire
d'ADN fœtal libre circulant pour détecter une trisomie 21 dans le plasma maternel ne puisse pas
être appliquée aux grossesses multiples. Indubitablement, la validation du test dans ces grossesses
sera entravée par la rareté des fœtus atteints et la complexité liée à la mono- et la dizygosité, mais il
devrait y avoir plus d’ADN fœtal par rapport à l'ADN maternel, augmentant ainsi la fraction fœtale
et la fiabilité de l'analyse, en particulier dans le cas de jumeaux monozygotes qui possèdent un
même ADN et des placentas communicants. En outre, la zygosité des jumeaux sera confirmée par
ce test. En principe, l'analyse de l'ADN fœtal libre dans la circulation maternelle doit donner d’aussi
bons résultats pour les grossesses avec donneur que pour les conceptions spontanées. Des données
limitées sont maintenant disponibles provenant de l’essai MELISSA récemment publié et
confirmant ces observations. Les 36 grossesses obtenues par reproduction assistée incluses dans
cette étude prospective afin de vérifier la précision du test Verifi ont toutes été correctement
évaluées.

Dennis Lo : La technologie peut être appliquée aux jumeaux. Nous avons montré que la
technologie peut également nous permettre de déterminer la zygosité des grossesses gémellaires. En
outre, pour les jumeaux dizygotes, le séquençage de l'ADN du plasma maternel peut permettre de
mesurer la quantité d'ADN libéré par chacun des jumeaux, ce qui pourrait avoir des applications
cliniques et de recherche intéressantes. La technologie peut être appliquée à des grossesses par
fécondation in vitro avec donneur.

Jacob Canick : Une étude de notre groupe et une étude du groupe de Diana Bianchi indiquent que
le test de SNG pour les aneuploïdies permettra d'identifier les grossesses gémellaires dans lesquelles
un ou deux fœtus sont touchés. Bien que ces résultats soient basés sur moins de cas que la littérature
portant sur les grossesses simples, il semble que les grossesses gémellaires aient, en moyenne, une
fraction fœtale plus élevée que les grossesses simples, contribuant à une meilleure performance du
test. Bianchi et ses collègues ont brièvement abordé la question des grossesses obtenues par
fécondation in vitro et n’ont trouvé aucune différence en termes de performances, même si aucune
donnée n'a été communiquée.

Dirk van den Boom : Oui, le concept de la technologie sous-jacente de l'essai MaterniT21 Plus est
approprié pour une application dans les grossesses gémellaires. La capacité de détecter une trisomie
fœtale dans le plasma maternel est principalement due à la quantité relative d'ADN fœtal par rapport
à l’ADN maternel. Dans les études de validation publiées, la fraction fœtale moyenne est d’environ
13 %, le principal composant étant presque toujours de nature maternelle. Dans les grossesses
gémellaires où une seule des grossesses est trisomique, la surabondance du chromosome respectif
est encore détectable tant que la fraction fœtale efficace est au-dessus du seuil de détection. Le
fœtus non trisomique ajoute seulement une petite quantité au composant maternel euploïde. Nous
avons fait état de plus de 700 grossesses gémellaires. Comme avec les jumeaux, le test MaterniT21
Plus peut être appliqué à des grossesses de fécondation in vitro avec donneur. L'analyse de la
représentation chromosomique sous-jacente dans le cadre de la détection non invasive de la trisomie
dans le plasma maternel n'est en principe pas touchée par le don d'ovules.

À votre avis, voyez-vous ce test éventuellement comme un test de diagnostic « unique » pour le

dépistage prénatal remplaçant le dépistage de sérum maternel ? Ou sera-t-il simplement un
complément aux procédures de dépistage actuelles ?

Barry Hoffman : Bien évidemment le TPNI d'ADN fœtal libre dans le plasma maternel est un test
bien supérieur à celui du dépistage de la trisomie traditionnel qui utilise des biomarqueurs
biochimiques et d'imagerie. Cependant, le premier est également considérablement plus coûteux.
On peut s'attendre à ce que les personnes qui peuvent se permettre de payer un test moléculaire, de
manière privée ou par le biais de leur assurance, l’utiliseront comme premier choix. Cependant, il
est peu probable que les programmes de dépistage prénatal financés par le gouvernement auront les
fonds nécessaires pour payer pour l'application universelle du test moléculaire à toutes les femmes
soumises au dépistage prénatal. Une solution économiquement neutre à ce dilemme est le test
contingent, où le dépistage traditionnel est réalisé en premier et le test moléculaire offert
uniquement aux dépistages positifs. La performance d'un tel dépistage se rapproche de celle du test
moléculaire seul et le délai d’obtention d’un résultat final devrait être acceptable si le délai entre le
test de dépistage et le test moléculaire est suffisamment court. Dans l’Ontario, une analyse
financière préliminaire a montré que le dépistage contingent est de coût neutre lorsque le taux
positif de dépistage initial classique est fixé à 5 %. La valeur arbitraire du taux positif peut être
augmentée lorsque le coût des tests moléculaires baisse.

Dennis Lo : Pour le dépistage dans le sérum maternel du syndrome de Down, je pense que le test de
séquençage est nettement supérieur et devrait sans doute remplacer l'approche classique par la suite.
Cependant, comme discuté ci-dessus, pour le court terme, en raison des dépenses liées au test de
séquençage ; il serait peut-être plus rentable de réaliser un dépistage classique d'abord, puis
d’orienter les femmes à haut risque détectées par ce dépistage vers le test de séquençage.

Jacob Canick : Je m'attends à ce que le SNG devienne un test de première ligne offert à toutes les
femmes enceintes. Il est clair que pour les trisomies communes, le test a déjà une performance
supérieure aux méthodes de dépistage prénatal actuelles. Le taux de détection est proche de 100 %,
et le taux de faux positifs est sensiblement inférieur à 1 %, avec un taux d'échec relativement faible.
Comme test de première ligne, la valeur prédictive positive pour le syndrome de Down serait
proche de 50 %. C'est-à-dire qu'une procédure de diagnostic invasive sur 2 aboutirait à
l'identification d'un fœtus atteint du syndrome de Down. Les valeurs prédictives seraient plus
faibles pour les autres trisomies, car leur prévalence dans la population est plus faible. Il reste la
question des tests non informatifs pour les échantillons qui ont, par exemple, une fraction fœtale
trop faible ou suite à des défaillances méthodologiques, mais ces patients peuvent se voir offrir
comme alternative un dépistage standard. Je pense que la mise en place de ce test comme test de
première ligne dépend de l'amélioration continue du débit de traitement et du coût au cours des
prochaines années.

Dirk van den Boom : L'utilisation d'ADN fœtal libre offre une sensibilité et une spécificité de
diagnostic qui peuvent être supérieurs au dépistage sérique actuel pour l'aneuploïdie fœtale.
Cependant, les dépistages biochimiques à partir de sérum maternel pour des indications autres que
l'aneuploïdie fœtale ne pourraient pas, en principe, remplacer le dépistage sérique maternel. En
outre, et tout aussi important, il y aura toujours besoin d’évaluer les anomalies du tube neural fœtal
qui ne peuvent actuellement pas ou ne sont pas abordés par le SNG.

L’article de 2012 publié dans Nature par Fan et al. et l’article de 2012 publié dans Science

Translational Medicine par Kitzman et al. décrivent la détermination non invasive du génome
fœtal provenant à partir du sang maternel. Selon vous quelles implications cette découverte va-t-
elle mettre en lumière ? Comment cela va-t-il influencer les pratiques cliniques actuelles ?

Barry Hoffman : Cibler l'analyse moléculaire de l'ADN fœtal libre dans la circulation maternelle à
une anomalie spécifique, ou même un ensemble limité d'anomalies, est assez simple en termes de
pratique clinique actuelle et des normes éthiques. Lorsque le nombre d'anomalies incluses dans le
test moléculaire augmente, alors la difficulté de présenter de manière cohérente les résultats au
médecin prescripteur, au conseiller en génétique, au(x) parent(s), au fœtus (éventuellement), et à la
famille proche augmente aussi. Mais, le séquençage de façon non invasive du génome fœtal entier
est le test flexible ultime, sans doute un tour de force technique passionnant, mais tout à fait
dévastateur, dans la mesure où l'application de l'information clinique nécessitera un tout nouveau
cadre éthique, éducatif, technique et de délivrance aux médecins, qui n'est actuellement pas en
place. Il faudra du temps, des ressources, de nouvelles idées et beaucoup de travail avant que le
potentiel de SNG au niveau du génome entier puisse être pleinement réalisé dans le domaine
clinique.

Dennis Lo : En utilisant une approche basée sur le génotypage paternel, l’haplotypage maternel et
le séquençage de l'ADN de plasma maternel, Kitzman et ses collègues ont confirmé notre approche
et montré que la méthode est robuste et évolutive, même lorsqu'elle est appliquée à un niveau plus
profond de séquençage. L’article de Fan et ses collègues a également confirmé le concept général,
mais a introduit une question supplémentaire à savoir si le génotypage de l'ADN du père pourrait
être évité et si l'on pourrait en déduire directement les allèles fœtaux hérités du père absents du
génome de la mère à partir des données de séquençage d'ADN issues du plasma maternel.
Ensemble, ces articles démontrent la faisabilité du séquençage non invasif du génome fœtal. Si cette
évolution est technologiquement et scientifiquement très intéressante, pour les applications
cliniques, il pourrait être plus rentable d'effectuer un séquençage ciblé pour des loci génomiques
choisis impliqués dans des maladies monogéniques courantes dans une population donnée, comme
cela a été récemment réalisé. Ceci faciliterait le soutien psychologique et permettrait de réduire la
complexité éthique liée à l'introduction d’un tel test clinique.

Jacob Canick : Les deux publications, montrant que les génomes fœtaux et maternels peuvent être
entièrement séquencés à partir d'échantillons de plasma maternel, se basent sur une étude de preuve
de concept de Dennis Lo et ses collègues de 2010. Ils ont montré que les génomes de la mère et du
fœtus sont présents sous forme d'ADN fragmenté dans la circulation maternelle, et que ces
fragments sont présents en une proportion relative constante. L'implication de ces découvertes est
claire. Le potentiel ici est d'identifier un grand nombre de maladies monogéniques dans le fœtus, à
la fois héritées et nouvellement formées, sans avoir à utiliser des techniques d’échantillonnage fœtal
invasives et risquées. Le délai pour la mise en œuvre clinique de ces découvertes est inconnu à
l'heure actuelle, mais 10 ans est sans doute une estimation raisonnable.

Dirk van den Boom : Communes à d'autres technologies révolutionnant la pratique médicale,
l'utilisation et la mise en œuvre de cette analyse doivent s’accompagner de considérations éthiques
adéquates et d’une validation analytique et clinique appropriées. Alors que les tests actuels se
concentrent sur la détection des trisomies 21, 18, et 13, un caryotype non invasif aux résultats
équivalents aux puces d'hybridation dans le liquide amniotique est à portée de main, les
technologies de séquençage évoluant. Le TPNI est extrêmement puissant et permettra le diagnostic
de nombreuses maladies, qui ne sont actuellement évaluables que par l'obtention d'échantillons

provenant de procédures invasives. Il est important que cette nouvelle technologie soit appliquée
pour améliorer la santé de chacun. Plus particulièrement, les maladies pouvant être traitées in utero
ainsi que l'identification prénatale de maladies métaboliques pourraient être des indications
intéressantes de cette technologie d'autant plus que des ajustements alimentaires à la naissance
pourraient être réalisés avant que les symptômes ne se développent.

Remarques

   7
       Abréviations non standardisées :

         SNG,
         Séquençage de nouvelle génération ;
         MPSS,
         Séquençage massif en parallèle et global ;
         TPNI,
         Test prénatal non invasif ;
         TAT,
         Délai d’exécution ;
         ISPD,
         Société internationale de diagnostic prénatal.

   Contributions des auteurs : Tous les auteurs ont confirmé qu'ils ont contribué au contenu
   intellectuel de ce document et ont répondu aux 3 exigences suivantes : (a) contributions
   significatives à la conception et au format, à l’acquisition de données, ou à l’analyse et
   l’interprétation des données ; (b) élaboration ou révision de l'article et de son contenu
   intellectuel ; et (c) approbation finale de l'article publié.

   Divulgations des auteurs ou potentiels conflits d'intérêts : Lors de la soumission du
   manuscrit, les auteurs ont rempli le formulaire de non-divulgation. Divulgations et/ou potentiels
   conflits d'intérêts :

   Recrutement ou Leadership : E.P. Diamandis, Clinical Chemistry, AACC; Y.M.D. Lo,
   Clinical Chemistry, AACC; D. van den Boom, Sequenom.

   Consultant ou fonction consultative : Y.M.D. Lo, Sequenom.

   Actionnariat : Y.M.D. Lo, Sequenom ; D. van den Boom, Sequenom.

   Honoraires : Non déclaré.

   Financement de la recherche : Y.M.D. Lo, Sequenom.

   Témoignage d'expert : Non déclaré

Brevets : Y.M.D. Lo, multiples brevets et demandes de brevet dans le domaine du diagnostic
   prénatal non invasif.

   Autre Rémunération : Y.M.D. Lo, Life Technologies.

   Reçu pour publication le 31 janvier 2013.

   Accepté pour publication le 5 février 2013.

   © 2013 The American Association for Clinical Chemistry

“This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the
accuracy of the translation. The views presented are those of the authors and not necessarily those
of the AACC or the journal. Reprinted from Clin.Chem, 2013; v. 59, p.1151-1159, by permission of
AACC. Original copyright © 2012 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing
this article, please refer to the original English publication source in the journal, Clinical
Chemistry”

« Cet article a été traduit avec la permission de l’AACC. L’AACC n’est pas responsable de la
qualité de la traduction. Les opinions formulées sont celles des auteurs et ne sont pas
nécessairement celles de l’AACC ou du journal. Réimprimé de Clin.Chem, 2013; v. 59, p.1151-
1159, avec la permission de l’AACC. Copyright original©2012 American Association for Clinical
Chemistry, Inc. Lorsque cet article est cité, la publication originale du journal en anglais doit servir
de référence. »