ATTACHEMENT DES NOROVIRUS AUX SURFACES INERTES ET ÉVALUATION DE LEUR SENSIBILITÉ AUX DÉSINFECTANTS DOMESTIQUES
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MARYLINE GIRARD
ATTACHEMENT DES NOROVIRUS AUX SURFACES
INERTES ET ÉVALUATION DE LEUR SENSIBILITÉ
AUX DÉSINFECTANTS DOMESTIQUES
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Sciences et technologie des aliments
pour l'obtention du grade de Maître es Sciences (M. Se.)
DEPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION
FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2009
© Maryline Girard, 2009
11
Résumé
Les norovirus sont maintenant reconnus mondialement comme étant la cause
majeure de maladies d'origine alimentaire. Deux causes majeures expliqueraient la
recrudescence des cas d'empoisonnements alimentaires d'origine virale: leur très grande
stabilité dans l'environnement facilitant ainsi leur transfert et leur résistance à la majorité des
approches de lutte contre les microorganismes pathogènes tels que la désinfection chimique.
L'objectif général de ce projet était d'étudier et de caractériser le phénomène d'attachement
des norovirus humain et murin aux surfaces inertes en fonction des différents paramètres
physico-chimiques (pH et humidité relative) et d'évaluer l'impact de ce phénomène sur la
sensibilité des norovirus aux désinfectants chimiques domestiques.
Les résultats obtenus ont démontré un meilleur attachement à pH acide ou neutre
peu importe l'humidité relative. On a d'ailleurs observé un attachement moindre lorsque le
norovirus murin était sous des conditions de pH 9 et de faible humidité relative
comparativement au norovirus humain où aucune différence n'a été observée selon les
différentes conditions. Pour les deux virus, un attachement maximal a été observé après un
temps de contact de 10 minutes. L'évaluation de la sensibilité des norovirus aux différents
désinfectants chimiques a montré une plus grande sensibilité aux composés chlorés avec
une réduction virale supérieure à 3 log comparativement aux alcools ou aux ammoniums
quaternaires qui n'ont permis qu'une faible réduction généralement inférieure à 1 log. On a
également noté que le norovirus murin est généralement plus sensible que le norovirus
humain.
Ul
Abstract
Norovimses are now recognized as the major cause of food-borne illnesses
worldwide. Two major causes would explain the increase of viral food-borne illnesses:
their great stability in the environment making their transfer and resistance to the majority
chemical disinfectants. The principal aim of this study was to characterize the attachment of
both murine and human norovimses to inert surfaces as a function of various physic-
chemicals factors (pH and relative humidity) and to evaluate the impact of this
phenomenon in norovims sensitivity to household chemical disinfectants.
Our results demonstrated a better attachment at acid or neutral pH regardless to
relative humidity. A lesser attachment was observed when murine norovims was below
conditions like pH 9 and low relative humidity compared to human norovims which any
difference was noted for the different conditions. For both vimses, a maximal attachment
was observed after 10 minutes of contact time. In term of sensitivity to disinfectants,
norovimses were shown to be more sensitive to chlorine with a viral reduction higher than
3 logs compared to reduction observed with alcohols or quaternary ammonium compounds
(< 1 log). It was also shown that murine norovims was in general more sensitive to
disinfectants than human norovims.
IV
Avant-Propos
J'aimerais premièrement remercier ma directrice, Julie Jean, qui m'a tout d'abord fait
confiance en m'acceptant dans son équipe afin d'y faire une maîtrise. Je suis très
reconnaissante envers elle pour tout ce qu'elle m'a appris, pour toute son aide, ses conseils
et sa patience envers moi. Elle a toujours su m'orienter dans la bonne direction et me
fournir les bons éléments pour m'aider à aller toujours plus loin. Je remercie également ma
co-directrice, Kirsten Mattison, pour m'avoir accueillie si gentiment dans son équipe et
avoir fait en sorte que mon intégration dans un environnement anglophone se fasse si
aisément. Elle m'a permis de vivre une belle et enrichissante expérience de travail au sein
de son laboratoire à Santé Canada, Ottawa, ON.
Je remercie aussi Solange Ngazoa, chercheure post-doctorale au laboratoire de
virologie alimentaire de l'Université Laval, pour son expertise, son temps, ses judicieux
conseils et pour toutes les discussions que nous avons eu ensemble. Je remercie aussi tout
le personnel administratif et professionnel qui m'ont grandement facilité la vie et qui sont
toujours prêts à me rendre service.
Bien sûr, je ne peux oublier mes collègues étudiants. Je n'aurais pas pu passer aussi
bien à travers ces années sans leur support, leur écoute. Ils étaient présents aussi bien dans
les bons moments que dans les moments plus difficiles.
Je ne peux pas oublier Mélanie, mon amie, qui malgré la distance, reste toujours
disponible pour m'écouter, m'épauler et me rassurer. Je la remercie pour ses conseils et sa
confiance en moi.
Finalement, je remercie mon amoureux, Valier, pour tout l'amour qu'il me porte. Il a
toujours été fier de moi, m'a encouragé et m'a supporté pendant mes études. Puis, ma
famille qui a dû accepter l'éloignement pour la réalisation de mes études, mais surtout pour
leur intérêt envers mes recherches et leur soutien moral. Merci à ma sœur, qui n'a jamais
hésité à me démontrer sa fierté et à s'intéresser à ce que je fais. Je la remercie également
d'avoir mis au monde ma filleule, Madeleine, qui, par son sourire, fait fondre tous mes
soucis et envoler tous mes tracas.
V
Table des matières
Résumé ii
Abstract iii
Avant-Propos iv
Table des matières v
Liste des tableaux vii
Liste des figures viii
Liste des abréviations ix
Introduction 10
1. CHAPITRE 1 11
REVUE DE LITTÉRATURE 11
1.1 Maladies d'origine alimentaire 11
1.1.1 Vims entériques 11
1.2 Norovims 12
1.2.1 Classification 14
1.2.2 Structure 16
1.2.3 Tableau clinique 20
1.2.4 Prévention 21
1.2.5 Epidemiologic 22
1.2.6 Méthodes de détection 23
1.3 Modes de transmission des norovims 37
1.3.1 Manipulateurs infectés et contact direct 37
1.3.2 Eau ou aliments contaminés 38
1.3.3 Aérosols 39
1.4 Attachement des vims aux surfaces 39
1.4.1 Types de surfaces 39
1.4.2 Types de micro-organismes 40
1.4.3 Types d'interactions 44
1.5 Persistance 45
1.6 Inactivation des norovims 47
1.7 Désinfection chimique des surfaces 48
VI
1.7.1 Types de désinfectants et modes d'action 50
1.7.2 Mécanismes de résistance des micro-organismes 59
1.8 Hypothèse et objectifs 63
2. CHAPITRE 2 64
ATTACHEMENT DES NOROVIRUS À L'ACIER INOXYDABLE ET LEUR
INACTIVATION PAR DES DÉSINFECTANTS DOMESTIQUES 64
ATTACHMENT OF NOROVIRUSES TO STAINLESS STEEL AND THEIR
INACTIVATION USING HOUSEHOLD DISINFECTANTS 64
2.1 Résumé 65
2.2 Abstract 66
2.3 Introduction 67
2.4 Materials and methods 68
2.4.1 Norovimses.. 68
2.4.2 Plaque assay 68
2.4.3 RNA extraction for RT-PCR assay 68
2.4.4 Amplification of NoV RNA by real-time RT-PCR 68
2.4.5 NoV attachment to stainless steel ; 69
2.4.6 Chemical inactivation of NoV attached to stainless steel 69
2.4.7 Statistical analysis 69
2.5 Results and discussion 71
2.5.1 Detection of NoV by real-time assay 71
2.5.2 Attachment of NoV to stainless steel 71
2.5.3 Chemical inactivation of NoV attached to stainless steel 72
2.6 Acknowledgements 73
2.7 Figure legends 75
Conclusion générale 80
Bibliographie 82
Vil
Liste des tableaux
CHAPITRE 2
Tableau 2.1 : Disinfectants and neutralizers used in this study 74
vin
Liste des figures
CHAPITRE 1
Figure 1.1 : Microscopie électronique des NoV montrant les dépressions en forme de coupes
autour de la capside 13
Figure 1.2: Analyse phylogénétique des Caliciviridae 15
Figure 1.3: Organisation génomique des norovims humain (NoV) et murin (MNV-1) 17
Figure 1.4: Structure de la capside des NoV tel que déterminée par microscopie cryo-
électronique et par cristallographie à rayons X 19
Figure 1.5 : Principe de la détection par la méthode RT-PCR 28
Figure 1.6 : Principe de la détection par la méthode NASBA 30
Figure 1.7: Schéma représentant le système de révélation des amplicons en temps réel par
le marqueur SyBr Green 32
Figure 1.8: Schéma représentant le système de révélation des amplicons en temps réel par
la sonde TaqMan 34
Figure 1.9: Schéma représentant le système de révélation des amplicons en temps réel par
les balises moléculaires 36
Figure 1.10: Structure générale d'un composé d'ammonium quaternaire (QAC) 52
Figure 1.11: Résistance des différents microorganismes aux antiseptiques et aux
désinfectants 60
CHAPITRE 2
Figure 2.1 : Attachment of MNV to stainless steel at pH 4, 7 and 9 and 25% (a) or 80% (b)
relative humidity 76
Figure 2.2 : Attachment of human NoV to stainless steel at pH 4, 7 and 9 and 25% (a) or
80% (b) relative humidity 77
Figure 2.3 : Inactivation of MNV on stainless steel by exposure to chemical disinfectants 78
Figure 2.4 : Inactivation of human NoV on stainless steel by exposure to chemical
disinfectants 79
IX
Liste des abréviations
ADN: acide désoxyribonucléique
.ADNc: ADN complémentaire
AdV: adénovims
AgRN: acide ribonucléique
CaCV: calicivims canin (canine calicivims)
EBSS: Earle's Balanced Salt Solution
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
FBS: sémm de bovin fétal
FCV: calicivims félin (feline calicivims)
FDA: Food and Drug Administration
G: génogroupe
HAstV: astrovims humains (human astrovirus)
HAV: vims de l'hépatite A (Hepatitis A vims)
HEV: vims de l'hépatite E (Hepatitis E vims)
IR-FIFA: infrared fluorescent immunofocus assay
kb: kilobase
logie,: logarithme dans la base 10
mg: milligramme
ml: millilitre
MNV-1 : norovims murin (murine norovims)
NASBA: nucleic acid sequence-based amplification
ng: nanogramme
nm: nanometre
NoV: norovims
ORF: cadres de lecture ouverts (open reading frames)
PE: polyethylene
pi: point isoélectrique
PV: poliovims
QAC: Composé d'ammonium quaternaire
RFLP: polymorphisme de taille des fragments de restriction
RIA: radioimmuno assay
RT-LAMP: reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay
RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction
RV: rotavims
SaV: sapovims
Ti02: dioxyde de titanium
UFP: unité formatrice de plages (PFU, plaque forming units)
UV: ultraviolet
VLP: particules virales ressemblant aux vims (vims-like particle)
uni: micron
10
Introduction
Les aliments font partie intégrante de notre vie quotidienne. Nous mangeons au
moins trois fois par jour et chaque personne se préoccupe de ce qu'elle mange, de sa santé
ainsi que des risques qui peuvent survenir à la suite de l'ingestion de ces aliments.
L'innocuité alimentaire est une préoccupation croissante de la santé publique. La morbidité
associée aux maladies d'origine alimentaire et les conséquences économiques reliées aux
coûts médicaux et à la perte de productivité expliquent la préoccupation croissante des
individus pour leur santé.
Les vims entériques et notamment les norovims, sont responsables de la majorité
des maladies d'origine alimentaire dans le monde. Leur transmission est de type oro-fécale
principalement via les contacts interhumains, avec comme principaux vecteurs de
contamination les eaux souillées, les aliments manipulés par des individus malades et les
surfaces de travail. La recmdescence des cas d'empoisonnements alimentaires causés par
des vims s'expliquent par deux causes majeures soit leur très grande stabilité dans
l'environnement et leur résistance à la majorité des approches utilisées pour la lutte contre
les microorganismes pathogènes telle que la désinfection par des agents chimiques. Bien
que souvent très utiles contre les bactéries, l'efficacité des désinfectants chimiques contre
les vims entériques demeure limitée. C'est donc pour cette raison qu'il est grandement
nécessaire de trouver un moyen efficace afin d'inactiver ces vims.
L'objectif général de ce projet de maîtrise était d'étudier et de caractériser le
phénomène d'attachement des norovims aux surfaces inertes et d'évaluer l'implication de
ce phénomène dans la sensibilité des norovims aux désinfectants chimiques domestiques.
Deux types de vims entériques ont été utilisés dans cette étude à savoir le norovims murin,
qui a servi de modèle et un norovims humain. La détection de ces vims a été effectuée par
culture cellulaire et par RT-PCR pour le norovims murin, alors que pour le norovims
humain, seule la RT-PCR en temps réel a été utilisée. L'effet de certains paramètres tels
que le pH et l'humidité relative, sur l'attachement des norovims à une surface inerte a
également été évalué. Par la suite, différents désinfectants commerciaux ont été évalués
pour leur efficacité à inactiver les norovims.11
1. CHAPITRE 1
REVUE DE LITTÉRATURE
1.1 Maladies d'origine alimentaire
Selon une étude réalisée en 1999 par Mead et coll. (123), il a été estimé que les
maladies d'origine alimentaire causent environ 76 millions de cas, 325 000 hospitalisations
et 5000 morts chaque année aux États-Unis.
Parmi les cas rapportés, 30% sont causées par les bactéries, 3% par des parasites et
67% par des vims (123). Les infections virales d'origine alimentaire les plus fréquemment
rapportées sont la gastroentérite virale aiguë et l'hépatite A. Ces infections affectent tous
les groupes d'âges et ce, à travers le monde entier (32, 37).
1.1.1 Virus entériques
Un vims est un agent infectieux ayant une organisation acellulaire simple constituée
d'une capside protéique et d'un acide nucléique. Dépourvus de métabolisme indépendant,
les vims se multiplient uniquement dans des cellules hôtes vivantes, ils ne peuvent donc pas
se répliquer dans les aliments ou dans l'environnement (97), toutefois ils peuvent y
persister (119). Les vims d'origine alimentaire peuvent être introduits dans la chaîne
alimentaire à n'importe quel moment (32). De plus, ces vims sont stables à l'extérieur de
l'hôte et ils sont acido-résistants (97). Ils peuvent alors être ingérés avec les aliments et
traverser le système digestif sans problème pour atteindre l'intestin afin de se répliquer.
Les vims causant des gastroentérites sont plus particulièrement appelés des vims
entériques et comportent une grande variété de familles. Parmi ceux-ci, se trouvent
principalement les adénovims humains (AdV), les astrovirus (HAstV), les calicivims (plus
particulièrement les norovims (NoV)) et les rotavims (RV). Pour leur part, les vims des
hépatites A (HAV) et E (HEV) affectent principalement le foie causant un ictère (32). Aux12
États-Unis, les maladies virales d'origine alimentaire sont estimées à 66.6% par les
norovims, à 0.3% par les rotavims et à 0.3% par les astrovirus (123).
1.2 Norovirus
Les NoV (anciennement appelé « Norwalk-like vims») sont appams pour la première
fois lors d'une épidémie de gastroentérite aiguë (appelé «winter vomiting disease») en 1968
chez des étudiants et des professeurs d'une école à Norwalk en Ohio (3) aux États-Unis.
Les NoV font partie de la famille des Caliciviridae. Le nom calicivims est dérivé du
latin calyx, signifiant coupe ou goblet et réfère aux dépressions en forme de coupes visibles
par la microscopie électronique (Fig.l.1 (27j).13 Figure 1.1 : Microscopie électronique des NoV montrant les dépressions en forme de coupes autour de la capside (27).
14
1.2.1 Classification
Les calicivims humains sont classés en deux groupes : les genres norovims (NoV) et
sapovims (SaV) (32, 97) tandis que la majorité des vims présents chez les animaux sont
classés dans les genres vesivims et lagovims (72). À ce jour, une seule étude a été rapportée
dans la littérature portant sur la culture in vitro d'un norovims humain (157). Plusieurs
laboratoires ont tenté de reproduire les mêmes résultats mais toujours sans succès
(communication personnelle).
Les NoV ont été classifies en 5 génogroupes (Gl à GV) selon la séquence complète
du gène de la capside (Fig. 1.2 (177)). Une méthode standardisée utilisant les séquences
d'acides aminés de la protéine majeure de la capside a été proposée par Zheng et al. (180).
Les souches humaines de NoV se trouvent dans les génogroupes Gl, II et IV (58, 72, 168).
Les souches du GUI ont été détectées chez les bovins (7, 127, 165), et les souches du GV se
retrouvent chez les souris (82, 92). Les NoV porcins se classent dans le GII (158) et le NoV
du lion se classe dans le GIV, basé sur un séquençage partiel (116). Les SaV ont seulement
été trouvé chez les humains et sont le plus souvent associés avec des gastroentérites aiguës
chez les jeunes enfants (24).
Lors d'une étude épidémiologique réalisée aux États-Unis entre les mois de juillet
2000 et juin 2004, 81% des épidémies étaient dues aux calicivims. Parmi ces dernières, le
génogroupe II des NoV était le plus abondant (79%) suivi du génogroupe I (19%) puis par
les SaV (2%) (24). Une étude similiaire à été réalisée, entre 2004-2005, sur des
échantillons cliniques de NoV au Canada et une prédominance du GII (95.7%) a été
observée (99).15
GCV - Marine nnravlrat - 1
• -< i v
HnNnV - M pnairua
Nantiras Hn>o\ H...M ..I
GGII
- IVsaV - SW«|I
HuVoY . Hnwnii
tloNoV • MT
u.Ill BoNoV ■ < Il I >
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■• U HnNoV ■ CMko
IluN .A
l.asrovirsrv KBHSV-CD
RHDV-FRG
- F C V . Irbassa
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- P O • Panl
- Kstvbil vrùvirav
- PoSa\ - 1 ovvoVa
Snpavlrsa
- HnSaV
HnSaV - l l o w l o n 8a
HnSaV - lloavion W
l'u ornaviridae
PosWvtnttl
l ( % Sesnanee Divrntracc
Figure 1.2: Analyse phylogénétique des Caliciviridae (177).16
1.2.2 Structure
Ces vims non-enveloppés ont un diamètre de 27 à 40 nm et contiennent un ARN
simple brin positif polyadénylé d'environ 7.6 kb. Les NoV possèdent 3 cadres de lecture
ouverts ou ORFs («open reading frames») (Fig. 1.3 (177)). L'ORF 1 code pour une
polyprotéine qui est clivée par une protease virale de type 3C en au moins 6 protéines non-
structurales, incluant l'ARN polymerase-ARN dépendante. ORF2 code pour la protéine
majeure de la capside (VP1), laquelle est responsable de l'auto-assemblage et de la
formation de la capside, la reconnaissance du récepteur, la spécificité de l'hôte, la diversité
entre les souches et l'immunogénicité. Pour sa part, ORF3 code pour la protéine mineure de
la capside (VP2), qui est impliquée dans l'expression et la stabilité de la protéine de capside
VP1.17
GTGAATG. GTGAATG
ORFI ORF3
NY18
Chez les NoV humains, la capside est composée de 180 copies d'une seule protéine
majeure organisées en 90 dimères et son architecture est basée sur une symétrie icosaédrale
T=3 correspondant à l'arrangement répété de 3 sous-unités (Fig. 1.4 (151)). Sa surface
montre 32 dépressions en forme de coupe et des arches saillantes (133).19
Monomer
P2-domain
P1-domain
S-domain
N terminal arm
Figure 1.4: Structure de la capside des NoV tel que déterminée par microscopie cryo-
électronique et par cristallographie à rayons X. (A) Représentation de la surface; (B) coupe
transversale; (C) dimère de la protéine de la capside. 90 dimères forment l'entière protéine
de la capside; (D) chaque monomère de la protéine de la capside est organisé en domaines
et sous-domaines. La partie N-terminale (vert) fait face à l'intérieur de la particule virale,
un domaine coquille (domaine S, jaune) forme la surface continue de la particule virale et le
domaine saillant (domaine P) constitue l'arche à la surface de la particule virale. Le
domaine P est divisé plus loin en sous-domaines Pl (rouge) et P2 (bleu). Le dernier est
impliqué dans les interactions vims-hôte (151).20
1.23 Tableau clinique
Depuis plusieurs années, les NoV sont la majeure cause commune de gastroentérites
chez tous les groupes d'âges (97). L'incidence est plus élevée chez les jeunes enfants, mais
la maladie survient régulièrement chez les adultes. Ce sont les vims diarrhéiques causant le
plus d'absentéisme au travail et à l'école (32).
Dans l'hémisphère nord, les gastroentérites causées par les NoV surviennent
principalement en hiver et au début du printemps. D'ailleurs, c'est pour cette raison
qu'elles sont parfois connues sous le nom de «winter-vomiting disease» (115). Par contre,
dans l'hémisphère sud, les épidémies sont plus fréquentes au printemps et à l'été (115). Ces
périodes correspondent, pour chaque hémisphère, aux mois présentant les températures les
plus froides.
Une première infection résulte de l'ingestion d'aliments ou d'eau contaminés par des
matières fécales (56). Par la suite, l'infection secondaire survient via un contact personne à
personne, des aérosols de vomissures, des surfaces, ou des manipulateurs d'aliments
infectés (58). De plus, le vims étant hautement contagieux, il en résulte donc un haut taux
de transmission par contact (97), car aussi peu que 10-100 virions sont suffisants pour
causer l'infection (19, 150). La période d'incubation moyenne du vims est de 12-48 heures
(11, 103) et les vims sont relâchés via les excréments et les vomissures. Au sommet d'une
infection de vims entériques, plus de 10 n virions par gramme peuvent être excrétés dans
les fèces (2, 16,145,170).
Le développement des symptômes de la gastroentérite peut se faire graduellement ou
de façon abmpte. Les symptômes tels que de la diarrhée, des vomissements et des nausées
apparaissent de 1 à 3 jours après exposition (14). Les personnes infectées demeurent
contagieuses après le rétablissement, puisque le relâchement viral asymptomatique continue
pour plus de 3 semaines (140, 160). Les adultes démontrent généralement de la diarrhée
comme caractéristique prédominante de la maladie, tandis que les enfants présentent des
nausées et des vomissements plutôt que de la diarrhée. Les symptômes accompagnant
fréquemment l'infection sont le mal de tête, la fièvre, des frissons et des myalgies
survenant dans 25%-50% des personnes infectées (37, 69, 103, 161).21
1.2.4 Prévention
L'interruption de la transmission est la première stratégie pour la prévention,
spécialement dans les hôpitaux et les centres d'hébergement déjeunes enfants (160, 175). Il
est donc important, avant et pendant une épidémie de NoV, de renforcer les mesures
d'hygiène, comme un bon nettoyage des mains, mais également de nettoyer toutes les
surfaces avec des désinfectants appropriés dans le but de prévenir la transmission de ces
vims (175).
Plusieurs patients sont résistants à une réinfection pour une courte durée de 4-6 mois.
Cependant, il n'y a pas de développement à long terme de T immunité (32, 175) et
présentement, aucun vaccin ou traitement antiviral n'est disponible afin de prévenir une
infection aux NoV chez les humains (56, 160). Le développement de vaccins contre les
pathogènes entériques représentent un défi de taille dû au grand nombre de souches et à la
nécessité d'induire une immunité qui est efficace au niveau de l'intestin (49). Idéalement,
un vaccin contre les vims entériques devrait être administré par voie mucosale. Toutefois,
cette technique, faisant partie des plus récentes voies d'administration des vaccins,
nécessite un système de vectorisation (par exemple, des particules virales ressemblant aux
vims («vims-like parades» ou VLP)), par voie orale ou rectale. Cette méthode permet
d'augmenter l'attachement, l'assimilation et la demi-vie des antigènes tout en permettant au
vaccin d'avoir un ciblage optimal des muqueuses intestinales (47, 68). Cette voie
d'administration permet d'induire une réponse immunitaire protectrice à la fois mucosale et
systémique et de s'opposer ainsi au franchissement des muqueuses (47). Ces dernières sont
la porte d'entrée de la plupart des agents pathogènes bactériens et viraux.22
1.2.5 Épidémiologie
De nombreuses épidémies sont survenues partout dans le monde au fil des ans (25,
78, 174) et il serait fastidieux de toutes les énumérer. De plus, il est très difficile de trouver
des données concernant des épidémies de norovims appames au Québec. On sait toutefois
que selon le Laboratoire de Santé Publique du Québec, 678 cas de norovims sont survenus
au Québec de juillet 2008 à août 2009 (9). Rien n'indique toutefois si ces cas sont
principalement dus aux aliments, aux manipulateurs infectés ou à un autre mode de
contamination. Par conséquent, seules les épidémies les plus fréquemment relatées dans la
littérature vont être citées à titre d'exemple. La première épidémie aux NoV est appame en
1982, au Minnesota, suite à la consommation de gâteaux. Par la suite, entre 1981-1998,
41% des gastroentérites alimentaires au Minnesota étaient causées par les NoV dû à une
consommation d'aliments contenant des fruits et légumes frais préparés par des employés
malades (46). Puis, en mars 1998, une épidémie de gastroentérite est survenue auprès de
125 étudiants d'une université au Texas après avoir consommés des sandwichs au jambon
préparés par un employé malade de la cafétéria (42). Des données plus récentes portant sur
des épidémies d'origine alimentaire survenues entre 1996 et 2005 ont révélées que sur les 8
épidémies reliées au Canada, 3 d'entrés elles étaient causées par l'ingestion de fruits de
mer, 2 par des fruits et légumes et 3 autres par des aliments composés de plusieurs
ingrédients comme des sandwiches et des salades (74).
Les lieux les plus communément rapportés lors d'épidémies de NoV sont les
restaurants ou les événements impliquant des mets de traiteur (39%), suivies des résidences
pour personnes âgées et des hôpitaux (25%). Les épidémies sont également rapportées dans
les écoles, les garderies, les centres de soins, les camps (13%) et dans les destinations
vacances, incluant les bateaux de croisière (10%) ainsi que d'autres endroits (prisons,
communautés, base militaire, bureaux, bureau de médecin, caserne de pompiers et centre
médical) (24, 58, 59, 84, 108, 171). Selon une étude épidémiologique concernant 233
épidémies survenues entre juillet 1997 et juin 2000, la nourriture contaminée, par exemple
les huîtres, était le véhicule d'infection le plus fréquemment rapporté (57%), alors qu'une23
infection par contact interpersonnel (16%) et de l'eau contaminée (3%) étaient les moins
communes. Aucun mode de transmission n'a pu être déterminé dans 24% des cas (58).
1.2.6 Méthodes de détection
Plusieurs techniques de détection (immunologiques, moléculaires, culture cellulaire,
etc.) ont été développées et utilisées au fil du temps afin de vérifier la présence ou non de
NoV humains dans les matières fécales le plus rapidement possible.
1.2.6.1 Méthodes microscopiques
La microscopie électronique fait partie des méthodes microscopiques les plus
récentes. Toutefois cette méthode requiert une concentration minimale de IO6 particules
virales par ml de matières fécales (11). Les méthodes de microscopie électronique sont
grandement utilisées lors de l'analyse d'échantillons fécaux dans les laboratoires de santé
publique de plusieurs pays afin de détecter et de confirmer la présence de vims entériques
(H).
1.2.6.2 Méthodes immunologiques
Les méthodes immunologiques sont basées sur l'utilisation d'anticorps spécifiques.
Ces méthodes sont simples, spécifiques et peu sensibles aux inhibiteurs. Elles sont
principalement utilisées dans les laboratoires cliniques et ne sont pas assez sensibles pour
détecter les très faibles doses (< 100) de vims présents dans les aliments (11, 53, 135). Ces
méthodes sont principalement utilisées sur les échantillons provenant de patients infectés.
Les NoV étant antigéniquement variables, cela rend l'utilisation des méthodes
immunologiques difficiles. Toutefois, certaines techniques immunologiques ont été
développées pour l'identification des NoV. Ces techniques incluent les essais ELISA
(enzyme linked immunosorbent assay), RIA (radioimmunoassay), «blocking RIA» et
«immune adherence hemagglutination assays» (89).24
1.2.6.3 Méthodes de culture
La méthode de titration est basée sur la replication virale. Brièvement, le titrage est
réalisé en ensemençant le vims sur un feuillet établi de cellules. Le vims s'attache à la
cellule hôte, pour ensuite pénétrer dans la cellule afin d'y introduire son matériel génétique
(ARN). Il y a lors replication de l'ARN viral et synthèse des protéines structurales à l'aide
de la machinerie de la cellule hôte. Suite à l'assemblage des protéines de la capside, les
ARN viraux produits sont inclus à l'intérieur afin de former de nouvelles particules virales.
Celles-ci sont ensuite relâchées à l'extérieur de la cellule provoquant la lyse cellulaire.
Cette méthode offre l'avantage de ne détecter que les vims infectieux générant un effet
cytopathique. Les plages de lyse ainsi obtenues sur le feuillet cellulaire correspondent soit
à une particule virale individuelle ou à un agrégat seul (contenant plusieurs particules
virales individuelles) (101). Le titre viral est alors exprimé en UFP (PFU en anglais) pour
.unité formatrice de plages.
L'infection aux NoV est présumée survenir dans le petit intestin, mais aucune étude
n'a identifié les NoV animaux dans les entérocytes. La replication des NoV humains ne
serait donc pas restreinte qu'à ce type de cellules. L'intestin est un habitat très complexe. Il
contient une multitude de types cellulaires différents, chacun ayant un contenu enzymatique
et une composition en protéines de surfaces différentes. Ces caractéristiques font de
l'intestin un environnement cellulaire très difficile à reproduire en culture (32). Toutefois,
Straub et al. (157), ont réussi à fabriquer le premier essai in vitro de culture cellulaire des
NoV. Ce modèle en trois dimensions de l'épithélium humain du petit intestin serait
constitué de multiples lignées cellulaires différentes (entérocytes, cellules en goblets, et
marqueurs de cellule de type M). Ce phénomène de multicellularité serait un facteur requis
pour l'infectivité des NoV. Finalement, une caractérisation de ce système 3-D aurait montré
que certains antigènes de surface (exemple, antigène A de Lewis) seraient très importants
dans l'attachement des NoV aux cellules. À ce jour, aucune autre étude reproduisant et
utilisant ce système de culture n'a été rapporté dans la littérature.
Différents modèles ont alors été utilisés afin de mieux les étudier. Parmi ces modèles
viraux ont note que le poliovims (PV), le vims de l'hépatite A (HAV) ainsi que les25
calicivims canin (CaCV) et félin (FCV) ont par le passé été utilisé en tant que modèle des
NoV afin d'étudier leur survie et leur inactivation sous différentes conditions. Ces vims ont
un génome composé d'ARN simple brin d'approximativement 7 kb et sont non-enveloppés.
Ils ont une taille d'environ 30 nm et ils possèdent tous une capside de structure
icosaédrique (97).
Plusieurs recherches (13, 21, 38, 41, 50, 76, 112, 159) ont utilisé le calicivims félin
(FCV) comme modèle pour les NoV humains. Le FCV, est un vims respiratoire. Cultivable
et faisant partie de la même famille que les NoV, il possède également des propriétés
physicochimiques similaires aux NoV (159). Cependant, le FCV n'est pas adapté au tractus
gastrointestinal. De ce fait, le FCV est plus fragile que les NoV (43) aux différentes
conditions gastriques. En effet, le FCV est inactivé à des pH relativement bas, affectant
ainsi sa capacité à être un bon modèle pour les études de stabilité environnementale et
d'inactivation des NoV humains (31, 52). Des études d'inactivation ont d'ailleurs démontré
que le FCV était moins stable que le HAV (97).
Certaines études ont été effectuées avec le phage MS2. Ce dernier fait partie du
groupe I des coliphages à ARN de la famille des Leviviridae. Escherichia coli est la
bactérie hôte et il est retrouvé le plus fréquemment dans les égouts et les fèces animales.
Comme les NoV, MS2 est adapté au tractus intestinal, il a un ARN simple brin positif avec
une symétrie icosaédrique et est environ de la même taille avec 26 nm de diamètre. Les
bacteriophages ont été précédemment utilisés afin d'étudier la sensibilité aux désinfectants
dans un but d'extrapoler ces propriétés chez les pathogènes humains (43). Dans l'étude de
Redman et al. (138), il a été suggéré que les particules virales de MS2 diffèrent de façon
significative pour leurs propriétés électrostatiques de celles des particules recombinantes de
Norwalk sans ARN servant de modèle pour le virion infectieux. Il a donc été conclu que le
MS2 ne serait pas un bon modèle pour les NoV (149).
Le premier norovims pathogène des souris a été décrit en 2003 (92). Ce norovims
murin (MNV-1) mesure entre 28 et 35 nm de diamètre et son génome est d'environ 7.6 kb.
C'est un vims icosaédrique et il possède également 3 cadres de lectures ouverts (177). Le
MNV-1 a démontré une habileté à infecter le tractus intestinal de la souris suivant une
inoculation orale (176) tout comme le mécanisme chez l'humain. Le MNV-1 cause une26
infection létale chez la souris qui se présente comme une hépatite, pneumonie, ou une
inflammation du système nerveux et est donc très différent de la présentation clinique des
NoV humains. Cependant, le MNV-1 est relâché dans les fèces de souris et est
communément transmis par la voie oro-fécale (92).
Le MNV-1 est le seul NoV qui se réplique en culture cellulaire et se multiplie dans un
petit animal. De plus, les souris de laboratoire sont versatiles et représentent un modèle
relativement peu cher pour l'analyse de pathogenèse virale. Le modèle MNV procure la
première opportunité pour comprendre la relation entre les mécanismes de base de la
replication des NoV en culture tissulaire et la pathogenèse dans un hôte naturel (177). Le
modèle MNV s'est révélé avoir un tropisme pour les cellules de la lignée hématopoïétique,
spécifiquement les macrophages et les cellules dendritiques. Présentement, le système de
culture cellulaire pour le MNV-1 utilise comme cellules-hôte, des macrophages RAW
264.7 (176).
Certains travaux (12, 55, 70) ont également été réalisés en utilisant des VLP («virus-
like particle»), correspondant à des particules virales identiques au vims d'intérêt mais sans
acide nucléique, donc qui n'est pas infectieux. Ces VLP ont principalement été utilisés dans
les études visant la découverte d'un vaccin contre les NoV ou celles visant à comprendre le
processus d'attachement des NoV.
Bae et al. (13), ont comparés différents vims afin d'identifier le meilleur modèle pour
les NoV humains. Les résultats ont indiqués que MNV-1, MS2 et PV ont tous le potentiel
d'être des modèles utiles pour les NoV humains. Toutefois, le FCV est questionnable sur
son application en tant que modèle adéquat des NoV compte tenu de la grande réduction de
son infectivité virale qui a été observée à 25°C comparativement aux autres vims.
1.2.6.4 Méthodes moléculaires
Les méthodes moléculaires, pour leur part, sont basées sur la mise en évidence des
séquences spécifiques du matériel génétique viral. Ces méthodes offrent les caractéristiques27
de sensibilité et de spécificité requises pour la détection des vims entériques dans les
aliments. Parmi les méthodes développées, on trouve la RT-LAMP (reverse transcription-
loop-mediated isothermal amplification assay) (64), le RFLP (restriction fragment length
polymorphism) (136), le microarray (85) ainsi que le IR-FIFA (infrared fluorescent
immunofocus assay) (40). Les méthodes les plus efficaces restent jusqu'à maintenant la
RT-PCR et la NASBA toutes deux en temps réel.
1.2.6.4.1 RT-PCR et NASBA
La méthode de détection basée sur la RT-PCR («Reverse Transcription-Polymerase
Chain Reaction») est une procédure très utile, puisque son temps de détection est
significativement réduit et qu'elle procure une meilleure sensibilité que la méthode de
culture cellulaire. Cette meilleure sensibilité, cependant, est due surtout à l'habileté de
l'essai à détecter des séquences intactes d'acides nucléiques de vims en dépit de leur
infectivité. De ce fait, il n'existe pas toujours une corrélation entre les méthodes
moléculaires et les méthodes de culture. En fait, considérant les résultats de la titration du
FCV non traité, la culture cellulaire apparaît être plus appropriée pour la détection de vims
infectieux que la RT-PCR (autant conventionnelle que les essais en temps réel) (132).
Dans la technique de RT-PCR (Fig. 1.5 (139)), l'acide nucléique (ARN) viral cible
est premièrement converti en un ADN complémentaire (ADNc) double brin dans une étape
de transcription inverse, suivi d'une amplification par PCR (86). Dans le but de détecter le
plus de variantes possibles des NoV par des essais de RT-PCR, la température
d'hybridation doit être assez basse et les amorces dégénérées peuvent être utilisées afin
d'induire l'amplification de matrices non spécifiques. Cependant, quand des produits
alimentaires suspectés nécessitent d'être testés dans une routine de laboratoire, il n'est pas
préférable d'inclure plusieurs systèmes RT-PCR. Il est fortement suggérer d'inclure un
contrôle interne d'ARN pour vérifier l'inhibition de l'essai RT-PCR utilisé (14).28
ARNm
5 AAA-3'
3'- 5'
I"
Amorce
Transcriptase
invars*
ARNm
5'« • AAA-3'
3'« •5'
ADN
Amorça 2
4
u
a. Taq Polymârasa
U 5'. 3
3 5
Amorça 1
tc
o
JJ 3' 5
o
Amorça 2
I
Produit amplifia
Figure 1.5 : Principe de la détection par la méthode RT-PCR (139).29
La RT-PCR a prouvé être une méthode extrêmement sensible pour détecter les NoV.
Cependant, cette méthode a quelques limites, entre autres : la sensibilité à la présence
d'inhibiteurs d'amplification dans les échantillons de fèces ou alimentaires et la nécessité
de confirmer les produits d'amplification pour prévenir les résultats faux-positifs (73).
La NASBA («Nucleic Acid Sequence-Based Amplification») (Fig. 1.6 (172)) est
spécifiquement désignée pour amplifier l'ARN et emploie trois enzymes : une transcriptase
inverse, une RNase H et une ARN polymerase T7, qui agissent de concert pour amplifier
les séquences à partir d'un ARN simple brin original comme matrice. La réaction est
réalisée à une seule température, normalement 41°C. À cette température, l'ADN
génomique du microorganisme cible reste double brin et ne devient pas un substrat pour
l'amplification. Ce qui élimine la nécessité d'un traitement à la DNase, lequel est requis
quand on utilise la RT-PCR pour la détection de l'ARN. La détection de l'ARN messager a
été proposée comme un indicateur de viabilité bactérienne se définissant comme la capacité
d'une division cellulaire, métabolisme ou transcription des gènes. L'ARN messager peut
avoir une courte demi-vie à l'intérieur des cellules viables, et est rapidement dégradé par
des enzymes spécifiques (RNases) lesquelles sont très stables même dans les
environnements à l'extérieur de la cellule (39). Différents systèmes NASBA ont été
développés pour la détection des vims tels que le HAV, le rotavims et les NoV des
génogroupes Gl et GII (86-88).30
T7RNA
polymerase ,.
primer P1
Figure 1.6 : Principe de la détection par la méthode NASBA (172).31
1.2.6.4.2 Systèmes de révélation des amplicons en temps réel
Le développement récent de la RT-PCR et de la NASBA en temps réel simplifie la
détection des amplicons tout en réduisant le risque de contamination en laboratoire (51). Le
principe de la RT-PCR en temps réel consiste à suivre, à chaque cycle, la fluorescence
émise pendant la réaction d'amplification. Ce principe est différent de la PCR qualitative
conventionnelle puisque dans cette dernière, les amplicons ne sont détectés qu'à la toute fin
du processus. En temps réel, l'augmentation du signal fluorescent est directement
proportionnelle à la quantité d'amplicons générés durant la réaction de PCR permettant une
quantification (131). Différentes chimies de fluorescence ont été développées pour les
réactions d'amplification moléculaire en temps réel. Il existe essentiellement deux
principes généraux pour la détection quantitative des amplicons : les agents se liant à
l'ADN double brin (ex. SYBR Green I) et les sondes fluorescentes. Pour cette dernière
catégorie, l'hydrolyse de sondes (Taqman assay) et les balises moléculaires (Molecular
Beacons) sont les plus utilisées.
Le SYBR Green I (Fig. 1.5 (131)) est un agent intercalant de l'ADN. Il est
économique, facile à utiliser et respecte les deux exigences d'un bon agent soit d'augmenter
en fluorescence lorsque lié à l'ADN double brin et de ne pas inhiber la réaction de PCR
(131). Les amorces sont un élément important de la technologie basée sur le SYBR Green I
puisque la spécificité de la détection repose sur eux. De plus, aucune sonde fluorescente
n'est nécessaire dans cette technique (29).32
3'
1111II11 I I I II I
i
■ * « ■
BS"*W^ a\""W^r P JF^^^^^
4 ^ : fluorochrome stimulé amplicon amorce
% : fluorochrome non stimulé libre : AON double brin cible
Figure 1.7: Schéma représentant le système de révélation des amplicons en temps réel par
le marqueur SyBr Green (131).33
Le système de révélation des amplicons en temps réel par la sonde TaqMan (Fig. 1.6
(131)) utilise l'activité 5'-exonucléasique de la Taq polymerase. La sonde Taqman est
constituée d'un fluorochrome émetteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxy-fluorocein) fixé à
l'extrémité 5' et d'un second fluorochrome suppresseur (quencher) présent à l'extrémité 3'
(ex. TAMRA : 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine). Le fluorochrome suppresseur inhibe
l'émission de l'émetteur en raison de leur proximité. Au cours de l'étape
d'hybridation/extension de la PCR, la sonde hybridée à sa séquence cible sur l'amplicon est
hydrolysée. Le fluorochrome alors libéré de son suppresseur peut alors émettre de la
fluorescence qui est mesurée et analysée.34
llllllllllllll ;
*
r> > ?
1'
iiiiniiiiiiii
JJ-L _i b "
: sonde TaqMan 2j : sonde hydrolysée avec suppresseur . : ADN double brin cible
sonde hydrolysée avec fluorochrome stimulé «—■• : ampicon : amorce
*
Figure 1.8: Schéma représentant le système de révélation des amplicons en temps réel par
la sonde TaqMan (131).35
En NASBA en temps réel, les sondes nucléotidiques, de type balise moléculaire, sont
essentiellement utilisée (Fig. 1.7 (125) et 1.8 (Biomérieux)). Une balise moléculaire
consiste en une séquence de sonde flanquée de deux courtes séquences formant les bras qui
sont complémentaires l'un à l'autre. Le bras séquence à l'extrémité 5' porte une molécule
fluorochrome émetteur ou fluorophore (reporter) tandis que le bras séquence à l'extrémité
3' est lié de façon covalente à une molécule fluorochrome suppresseur (quencher). Sous des
conditions normales de réaction NASBA, la complémentarité des bras séquences hybrides
redonne à la balise moléculaire sa structure typique d'épingle à cheveux dans laquelle le
fluorophore est gardé à proximité du suppresseur. Une séquence de balise moléculaire peut
adopter de multiples structures secondaires. La structure préférée serait la conformation en
épingle à cheveux avec de minimes, voire aucune structure secondaire supplémentaire dans
la région de la boucle.36
stem
Figure 1.9: Schéma représentant le système de révélation des amplicons en temps réel par
les balises moléculaires (BioMérieux)..37
1.3 Modes de transmission des norovirus
Tout comme les autres pathogènes entériques, les NoV sont transmis via la voie oro-
fécale. L'origine de la contamination peut survenir à différents points dans la chaîne de la
ferme à la fourchette. La transmission virale est dépendante de l'interaction avec l'hôte
aussi bien que de l'interaction avec l'environnement. De plus, une augmentation du taux de
transmission d'origine alimentaire a été remarqué au fil des ans (24, 58, 59).
Des 51 épidémies (entre janvier 1996 et juin 1997 aux États-Unis) pour lesquelles le
mode de transmission a été rapporté, la propagation d'origine alimentaire est la plus
commune (37%), suivie du contact personne-à-personne (20%), de l'ingestion d'huîtres
contaminées (10%), et la consommation d'eau contaminée (6%). Pour plusieurs épidémies,
le mode de transmission spécifique était recherché mais n'a pas pu être déterminé (27%). À
noter, le contact interpersonnel est souvent un diagnostic d'exclusion quand les autres
modes ne peuvent pas être clairement identifiés (59). Les surfaces, vaisselles de service ou
contenants, ustensiles ayant été manipulés par des personnes malades et ne pratiquant pas
une hygiène personnelle adéquate avant la préparation des aliments, peuvent aussi
contribuer à la maladie (31).
1.3.1 Manipulateurs infectés et contact direct
Les manipulateurs d'aliments peuvent contaminer les aliments à n'importe quel
moment, de la récolte jusqu'au service s'ils sont infectés (32). Les manipulateurs infectés
peuvent être, ou non, symptomatiques au moment de la contamination. Un lavage des
mains ou une hygiène personnelle inadéquats ont été impliqués dans des épidémies autant
de NoV que de HAV (22). Un cas a d'ailleurs été rapporté lors d'une réception de mariage
où un assistant cuisinier a été malade pendant son quart de travail et a vomi dans l'évier
destiné à la préparation des légumes. Bien que l'évier ait été nettoyé avec un produit à base
de chlore, des NoV étaient encore présents et environ 50% des gens présents ont été
malades (130). Ainsi, les NoV se disséminent par plusieurs routes, incluant les aérosols, et
peuvent persister dans l'environnement même après le nettoyage (45, 57, 114, 126, 173).Vous pouvez aussi lire
