Nano-ions as tools for membrane protein research

Master 2 internship project – 2020

                             Institut de Biologie Intégrative de la Cellule – Gif-sur-Yvette – France

                     Nano-ions as tools for membrane protein research

Internship supervisor: Guillaume Lenoir
Laboratory: Laboratoire des Protéines et des Systèmes Membranaires
website: https://www.i2bc.paris-saclay.fr/spip.php?article356

         Membrane proteins (MPs) are involved in numerous cell functions, such as cell signaling,
metabolite/ion/lipid transport, and cell detoxification. It is therefore of major interest to characterize MPs at a
molecular level. Such characterization generally requires extraction of MPs from biological membranes
using detergents, for subsequent purification (Fig. 1). Owing to the inherent ability of detergent to denature
MPs, solubilization of MPs remains challenging and empirical and new techniques are now emerging as
alternatives to classical detergents.
         In the frame of a collaborative project between the ICSM in Marcoule and the IBS in Grenoble, we
aim at testing the potential of metallacarboranes (MCs), which are ions of nanometric size, for the
solubilization as well as the functional and structural investigation of MPs. Indeed, the ability of MCs to
solubilize model membranes has recently been demonstrated by our collaborators in Marcoule. Our project
should help understanding interactions between nano-ions and biological membranes. Furthermore, our
approach aims to identify a potential stabilizing effect of nano-ions toward MPs, to facilitate determination
of their three-dimensional structure. As MPs represent the therapeutic of about 60 % of the currently used
drugs, determination of their high-resolution structure is of critical importance.
The student hired on this project will examine the effect of COSAN, a reference MC that has been
characterized in depth from a physico-chemical perspective, on four different target MPs of eukaryotic
origin: i) the Ca2+-transporter SERCA1a, which is essential for uptake of Ca2+ into the endoplasmic
reticulum lumen and therefore for muscle relaxation, ii) the lipid transporter (‘flippase’) Drs2p/Cdc50p,
which controls transbilayer lipid asymmetry in eukaryotic cells, iii) P-glycoprotein, an ABC transporter
involved in multidrug resistance, and iv) Caveolin, a MP which controls shear-induced stress in cell
membranes. The diversity of the chosen targets should allow to provide a proof of principle using different
membrane systems. Solubilization of membranes with COSAN will be investigated by centrifugation and
wester-blotting techniques, by measuring light scattering, and will be compared to solubilization of the same
MPs with classical detergents used routinely in our lab. The function and stability of detergent- and MC-
solubilized MPs will be assessed thanks to ATPase activity assays or phosphorylations assays using
radioactive tracers. The oligomeric state and monodispersity of solubilized proteins may also be investigated
using size-exclusion chromatography. In case COSAN would not exhibit any ability to solubilize MPs, we
plan to test its possible use as a stabilizing additive during purification or crystallization of MPs.

                                                                             Figure 1: schematic of the various steps
                                                                             required for the functional and
                                                                             structural analysis of membrane
                                                                             proteins (solubilization, purification,
                                                                             and     reconstitution).      COSAN,  an
                                                                             inorganic nano-ion which proved able to
                                                                             solubilize model membranes, appears as
                                                                             an alternative to detergents.

Selected references of the team on this topic:
    1.   Timcenko M, Lyons JA, Januliene D, Ulstrup JJ, Dieudonné T, Montigny C, Ash MR, Karlsen JL, Boesen T,
         Kühlbrandt W, Lenoir G, Möller A, Nissen P (2019) Structure and autoregulation of a P4-ATPase lipid
         flippase. Nature 571: 366
    2.   Lenoir G, Dieudonné T, Lamy A, Lejeune M, Vazquez-Ibar JL, Montigny C (2018) Screening of detergents
         for stabilization of functional membrane proteins. Curr Protoc Protein Sci 93: e59
    3.   Azouaoui H, Montigny C, Dieudonné T, Champeil P, Jacquot A, Vázquez-Ibar JL, Le Maréchal P, Ulstrup J,
         Ash MR, Lyons JA, Nissen P, Lenoir G (2017) High phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P)-dependent
         ATPase activity for the Drs2p-Cdc50p flippase after removal of its N- and C-terminal extensions. J Biol Chem
         292: 77954
    4.   Montigny C, Dieudonné T, Orlowski S, Vázquez-Ibar JL, Gauron C, Georgin D, Lund S, le Maire M, Møller
         JV, Champeil P, Lenoir G (2017) Slow phospholipid exchange between a detergent-solubilized membrane
         protein and lipid-detergent mixed micelles: brominated phospholipids as tools to follow its kinetics. PLoS One
         12: e0170481
    5.   Champeil P, Orlowski S, Babin S, Lund S, le Maire M, Møller JV, Lenoir G, Montigny C (2016) A robust
         method to screen detergents for membrane protein stabilization, revisited. Anal Biochem 511: 31
    6.   Orlowski S, Sélosse MA, Boudon C, Micoud C, Mir LM, Belehradek J Jr, Garrigos M (1998) Effects of
         detergents on P-glycoprotein ATPase activity: differences in perturbations of basal and verapamil-dependent
         activities. Cancer Biochem Biophys 16: 85

Institut de Biologie Intégrative de la Cellule – Gif-sur-Yvette – France

      Apport des nano-ions pour la manipulation des protéines membranaires

Responsable de stage : Guillaume Lenoir
Laboratoire : Laboratoire des Protéines et des Systèmes Membranaires
Site web : https://www.i2bc.paris-saclay.fr/spip.php?article356

         Les protéines membranaires (PMs) sont impliquées dans de nombreuses fonctions essentielles, par
exemple le transfert d’informations ou de métabolites à travers les membranes, ou la détoxication cellulaire. Leur
caractérisation au niveau moléculaire est donc un enjeu majeur. Cette caractérisation passe généralement par leur
extraction depuis les membranes, souvent à l’aide de détergents (Fig. 1). Du fait du caractère parfois dénaturant
des détergents, l’extraction constitue une étape délicate au cours de la purification des PMs, qui reste très
largement empirique. Ainsi, de nombreuses recherches sont à l’heure actuelle dédiées au développement
d’alternatives aux détergents.
         Dans le cadre d’un projet très récemment financé, nous souhaitons, en collaboration avec des laboratoires
de l’ICSM à Marcoule et de l’IBS à Grenoble, tester le potentiel des métallacarboranes (MCs), des espèces
ioniques de taille nanométrique, pour la solubilisation et l’étude fonctionnelle/structurale des PMs. En effet, la
capacité des MCs à solubiliser des membranes modèles a été récemment démontrée par nos collaborateurs de
l’ICSM. Notre projet devrait permettre de mieux comprendre les interactions entre nano-ions et membranes
biologiques, et de favoriser la détermination de la structure tridimensionnelle des PMs purifiées et maintenues
sous leur forme fonctionnelle. Les PMs étant la cible d’environ 60 % des molécules de la pharmacopée,
l’obtention de leurs structures est essentielle pour le développement de nouvelles molécules d’intérêt
pharmaceutique.
         L’étudiant-e en M2 qui travaillera sur ce projet examinera l’impact du COSAN, un MC de référence, sur
quatre PMs cibles d’origine eucaryote : i) l’ATPase-Ca2+ SERCA1a, essentielle pour le réapprovisionnement des
stocks intracellulaires de Ca2+, ii) le transporteur de lipides (‘flippase’) Drs2/Cdc50, qui contrôle l’asymétrie
transversale des lipides au sein des membranes cellulaires, iii) la P-glycoprotéine, impliquée dans la résistance
multi-drogue, et iv) la cavéoline, une protéine qui contrôle entre autres la résistance des cellules aux stress
mécaniques. La diversité des cibles choisies permettra éventuellement d’apporter une preuve de principe sur
différents systèmes membranaires. La capacité éventuelle du COSAN à solubiliser ces cibles sera mesurée par
centrifugation et western-blot et/ou par mesure de diffusion de la lumière, et comparée à la solubilisation par des
détergents classiques. Des tests biochimiques (phosphorylation par l’ATP, activité ATPasique) permettront
d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité des protéines solubilisées. L’état d’association en solution et
l’homogénéité des protéines fonctionnelles pourront également être évalués notamment par chromatographie
d’exclusion stérique. Le cas échéant, si le COSAN se révèle insuffisamment efficace pour solubiliser les PMs
testées, un effet stabilisateur de ce même COSAN sur les PMs solubilisées par un détergent classique sera testé,
dans la perspective de son utilisation possible comme additif lors des purifications ou de la cristallisation par
exemple.

                                                                             Figure 1 : principe des différentes
                                                                             étapes mises en jeu dans l’étude des
                                                                             protéines membranaires (solubilisation,
                                                                             purification, et reconstitution). Le
                                                                             COSAN, un nano-ion inorganique qui a
                                                                             récemment montré une forte capacité à
                                                                             solubiliser les membranes lipidiques
                                                                             modèles, se présente comme une
                                                                             alternative possible aux détergents.

Références de l’équipe sur le sujet :
    1.   Timcenko M, Lyons JA, Januliene D, Ulstrup JJ, Dieudonné T, Montigny C, Ash MR, Karlsen JL, Boesen T,
         Kühlbrandt W, Lenoir G, Möller A, Nissen P (2019) Structure and autoregulation of a P4-ATPase lipid
         flippase. Nature 571: 366
    2.   Lenoir G, Dieudonné T, Lamy A, Lejeune M, Vazquez-Ibar JL, Montigny C (2018) Screening of detergents
         for stabilization of functional membrane proteins. Curr Protoc Protein Sci 93: e59
    3.   Azouaoui H, Montigny C, Dieudonné T, Champeil P, Jacquot A, Vázquez-Ibar JL, Le Maréchal P, Ulstrup J,
         Ash MR, Lyons JA, Nissen P, Lenoir G (2017) High phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P)-dependent
         ATPase activity for the Drs2p-Cdc50p flippase after removal of its N- and C-terminal extensions. J Biol Chem
         292: 77954
    4.   Montigny C, Dieudonné T, Orlowski S, Vázquez-Ibar JL, Gauron C, Georgin D, Lund S, le Maire M, Møller
         JV, Champeil P, Lenoir G (2017) Slow phospholipid exchange between a detergent-solubilized membrane
         protein and lipid-detergent mixed micelles: brominated phospholipids as tools to follow its kinetics. PLoS One
         12: e0170481
    5.   Champeil P, Orlowski S, Babin S, Lund S, le Maire M, Møller JV, Lenoir G, Montigny C (2016) A robust
         method to screen detergents for membrane protein stabilization, revisited. Anal Biochem 511: 31
    6.   Orlowski S, Sélosse MA, Boudon C, Micoud C, Mir LM, Belehradek J Jr, Garrigos M (1998) Effects of
         detergents on P-glycoprotein ATPase activity: differences in perturbations of basal and verapamil-dependent
         activities. Cancer Biochem Biophys 16: 85