Du chromosome à l'ADN - Watson et Crick face à la double hélice - Alliance Maladies Rares
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Du chromosome à l'ADN
Watson et Crick face
à la double hélice
Du gène (ADN) à la protéine en
passant par l'ARN messager
• Information auto réplicative
- Code à 4 lettres (A,T,C,G)
- Mot de 3 lettres = 1 acide aminé
• 22000 gènes chez l homme
• Environ 2% du génome
Peut on modifier les gènes, le génome ?
Pourquoi faire ?
Comment faire ?
Ciblage génique et modification par endonucléases
Principe:
Coupure ciblée de l’ADN par une enzyme: nucléase
L. Naldini, Nature Reviews Genetics, 2011
Comparaison de différentes méthodes
de modification du génome
Gilgenkrantz, Med Sci, 2014
Comparaison de différentes méthodes
de modification du génome
Gilgenkrantz, Med Sci, 2014
Immunité anti virale (phage) chez la bactérie
Découverte du système CRISPR
AV Wright et al, Cell 2016
Système CRISPR-CAS9
enzyme
ARN
de
guidage
2 oligonucléotides
Système simplifié:
1 ARN guide l’enzyme (CAS9) vers le site de l’ADN à cliver
Efficace, rapide, facile à employer
J.A. Doudna & E. Charpentier,
Science 2014
Mode d'action de CRISPR-Cas9
Gilgenkrantz, Med Sci, 2014
Système CRISPR/Cas9
Rappel général du principe d'action de CRISPR Cas9
J.A. Doudna & E. Charpentier,
Science 2014
Applications (In)activation de 1 ou plusieurs gènes dans une cellule, un tissu, un organisme Réponse à des questions de biologie fondamentale
Principe
NUCLEASES
CATALYSE THE HYDOLYSIS
OF NUCLEIC ACIDS
Zygote injection
• InDels
• Potential Knock-Out
• Point mutation
• Tag
• LoxP sites
• Rare eventRapidité !!!
THE PLATFORM SERVICES : CRISPR INJECTIONS
2 days
1 day
1 day
3 weeks
10 daysH Ledford, Nature, 2015
186 embryons 1 cellule → 83 transférés chez 29 femelles 10 grossesses (1 FCS, 3 γγ, 3 γγγ), 1 γγ → 2 par césarienne Modifications de Ppar-γ et Rag1 dont complète pour Rag 1 chez un animal Multiples génotypes → action à différents stades de l’embryogénèse Pas de mutations détectées dans 84 « off-target sites » potentiels
Applications
Science, 2014, 346, 1258096/1-9Les indications • Corriger une maladie héréditaire • Eviter la mort cellulaire (maladie dégénérative) • Conférer une propriété nouvelle à la cellule (combattre un cancer)
Vecteurs intégratifs/non intégratifs
Vecteur
Vecteur
encapsidé
ADN
chromosomique
Cassette
Vecteur d'expression
épisomal thérapeutique
intégrée
AAVirus,… Rétrovirus
ARN messager
thérapeutique et protéine
post mitotique en division
cellule cible
Adapté de M. Kay et al, 2001Thérapie génique des maladies du sang
Maladies
Cellule Lymphocyte T
lymphoide
progénitrice Immunodéficiences
Lymphocyte NK primaires
SCIDs
Lymphocyte B Syndrome de
Wiskott Aldrich
Granulocyte
Cellule dendritique Leucodystrophies
Cellules souches
Macrophage
Cellule
myeloïde
progénitrice Osteoclaste
Syndrome de
Plaquettes Wiskott Aldrich
Hémoglobinopathies
Erythrocyte Β thalassémie,
drépanocytoseThérapie génique du DICS lié à l’X
Lymphocyte T
Lymphocyte NK
Lymphocyte B
Erythrocyte
Granulocyte
Cellule souche
Cellule dendritique
Macrophage
Osteoclaste
Plaquettes
"gène thérapeutique"Correction - Principe
Moelle
osseuse
Cellule
progénitrice
gène γc
hématopoïétique
LTR
Cytoplasme
ARN
Sélection Virus ADN Noyau
cellulaire
Chromosome
Vecteur
x 3
ARNm γc
Prolifération
cellulaire
CultureThérapie génique du DICS lié à l'X
Premiers résultats : efficacité
100 90% (survie)
80 85% (survie sans maladie)
Survie (%)
60
(médiane 15 ans, 9 à 17 ans)
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 années
Correction des fonctions du système immunitaire, qualité de vie normale
Mais toxicité, nouveaux vecteurs plus sursImprovement in the safety of retroviral vectors
Leukemia-free
survival(%)
n=44 SIN-RV
(SCID-X1, WAS, ALD, MLD, B Thal. > 2years f.up)
Median : 4.1 years
Years post gene therapyThérapie génique
Extension des indications
Lymphocyte T
progéniteur Lymphocyte NK DIH
lymphoïde
Lymphocyte B
cellules souches
Erythrocyte Maladies de
l'hémoglobine
Granulocyte
Cellule DIH
progéniteur dendritique
myeloïde Macrophage
Maladies
Osteoclaste métaboliques…
PlaquettesPour l’instant : thérapie génique par addition de la
copie d’un gène
Peut on mieux faire ?
Régulation non physiologique du transgèneApplications
Science, 2014, 346, 1258096/1-9Ciblage génique et modification par endonucléases
L. Naldini, Nature Reviews Genetics, 2011Modification/correction génique
D.B. Turitz-Cox et al,
Nature Medicine 2015
• Inactivation d’un gène
• Inactivation d’un gène (exon) muté
Exemple de la myopathie de Duchenne (souris)Inactivation de CCR5 (récepteur du VIH) dans les lymphocytes T CD4 de patients infectés par le VIH
Ciblage génique et modification par endonucléases
L. Naldini, Nature Reviews Genetics, 2011L’avenir: correction génique ??
Recombinaison homologue
Régulation non physiologique
du transgèneTraitement de l'hémophilie B (modèle murin)
par insertion in situ d'une copie normale du gène (F9)
H. Li et al, Nature 2011Modèle expérimental de tyrosinémie (foie)
Déficit en fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)
métabolites toxiques lésions du foie
plasmides
poids
transaminases bilirubine
H. Yin et al, Nature Biotechnology 2014L’avenir: correction génique ??
Recombinaison homologue
Régulation non physiologique Fréquence de correction ?
du transgène « off targets »Limites de la « réparation génique »
Cycle
cellulaire
La plupart des cellules souches sont quiescentes La recombinaison homologue
nécessite la mise en cycleSystème CRISPR/Cas9 "amélioré"
1 brin 1brin
2 sites actifs RuvC et HNH 1 site muté 1 site muté
Affinité
Meilleure spécificité !
J.A. Doudna & E. Charpentier,
Science 2014“CRISP 2.0”
E. Pennisi, Science 2015Applications
Science, 2014, 346, 1258096/1-9Autres utilisations • Modification du génome des plantes (non OGM) • Modification d'insectes – vecteurs de maladies
Modifier le génome des cellules germinales ?
Embryogénèse précoce humaine
Spermatogonie
zygote blastocyste
cellule
germinale
primordiale
J1 J3 J5/6
ovogonie
Pierre JouannetApplication à l’embryon humain
RESEARCH ARTICLE
CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human
tripronuclear zygotes
Puping Liang, Yanwen Xu, Xiya Zhang, Chenhui Ding, Rui Huang, Zhen Zhang, Jie Lv, Xiaowei Xie, Protein Cell 2015, 6(5):363-372
Yuxi Chen, Yujing L i, Ying Sun, Yaofu Bai, Zhou So ngyang, Wenbin Ma, Canquan Zhou"", Junjiu Huang"" DOi 10.1007/s13238-015-0153-5
Résultats très imparfaits mais une forme de preuve de principePour quoi faire ? • Corriger une maladie génétique • Prévenir des risques de maladie • Améliorer les performances de l'homme
Modification germinale du génome humain ?
• Interdit UNESCO (1997)
Conseil de l'Europe (Oviedo) 1997
Loi de 1994. Article 16-4
Code civilQue doit on penser ?
• Technique pas complètement au point
• Caractère inutile (maladies génétiques) sauf exception rarissime
• Caractère dangereux inconnu
perte d'une fonction utile (CCR5)
• Caractère illusoire améliorer les performances. Vraiment ?
• Qui consent ?Situation actuelle • Interdiction • Moratoire (Conférence de Washington) • Garde fous
Opinions -1-
Don’t edit the human germ line
Edward Lanphier, Fyodor Urnov and colleagues.
“There is also fear of the negative impact it could have on important work involving the use of genome-editing
techniques in somatic (non-reproductive) cells.”
Nature, 26 march 2015, 519: 410-1
A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification
David Baltimore ,Paul Berg, Michael Botchan , Dana Carroll, R. Alta Charo et al
1) Strongly discourage any attempts at germline genome modification for clinical application
in humans, while societal, environmental, and ethical implications of such activity are discussed
among scientific and governmental organizations.
3) Encourage and support transparent research to evaluate the efficacy and specificity of
CRISPR-Cas9 genome engineering technology in human and nonhuman model systems relevant
to its potential applications for germline gene therapy.
Science, 3 APRIL 2015, 348: 36-8
Brave new Genome
Eric S Lander
Four key issues: Technical/Potential applications/who has the right to decide/ Morality
N Engl J Med. 2015 Jul 2;373(1):5-8
Pierre JouannetOpinions -2-
The Board of Directors of the Society for Developmental Biology (SDB) and the Editors of its official
journal Developmental Biology are very concerned about the recently published study applying
CRISPR/Cas9 genome editing technology to human embryos. SDB supports a voluntary moratorium by
members of the scientific community on all manipulation of pre-implantation human embryos by
genome editing.
THE ISSCR STATEMENT ON HUMAN GERMLINE GENOME MODIFICATION (19 March,
2015)
The International Society for Stem Cell Research calls for a moratorium on attempts at clinical
application of nuclear genome editing of the human germ line to enable more extensive scientific
analysis of the potential risks of genome editing and broader public discussion of the societal and
ethical implications.
In view of the unanswered scientific questions
and inherent moral issues concerning germline
gene editing in general, it is essential to conduct
public discussion and deliberation about these
emerging technologies.
Pierre JouannetOpinions -3- NIH national human genome research Institute Gene transfer clinical trials have a unique oversight process that is conducted by the National Institutes of Health (NIH) through the Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) and the NIH Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules, and by the Food and Drug Administration (FDA) through regulation (including scientific review, regulatory research, testing, and compliance activities, including inspection and education). RAC will not currently consider protocols using germline gene transfer https://www.whitehouse.gov/blog/2015/05/26/note-genome-editing A Note on Genome Editing MAY 26, 2015 AT 10:40 AM ET BY JOHN P. HOLDREN The White House fully supports a robust review of the ethical issues associated with using gene- editing technology to alter the human germline. The Administration believes that altering the human germline for clinical purposes is a line that should not be crossed at this time. Gene politics US lawmakers are asserting their place in the human genetic-modification debate. NATURE | VOL 523 | 2 JULY 2015 …(the) subcommittee — of the House Appropriations Committee that funds the FDA — was meeting on Capitol Hill to draft the agency’s 2016 budget. The subcommittee wants to take no chances with human modification: a bill that it released on 17 June bans the FDA from using public funds to evaluate applications for clinical trials involving genetically modified human embryos. Pierre Jouannet
Opinions -4-
Mais…… en Grande Bretagne :
It is important to emphasise that the science is still at a relatively early stage and potential
therapeutic applications are not yet here.
We will continue to support the use of genome editing in preclinical biomedical research as
well as studies that progress and refine these technologies. Within the UK, this research
may involve the use of somatic (non-reproductive) or germ cells, including human embryos
up to 14 days old
We believe that genome editing technologies may hold significant potential for clinical
application in the future;
We also recognise, however, that there may be future potential to apply genome editing in
a clinical context using human germ cells or embryos,
Background paper: Identifying key developments, issues and questions relating to
techniques of genome editing with engineered nucleases.
The Council has established a new working group to explore the ethical issues raised by
novel genome editing techniques, such as the CRISPR-Cas9 system,
Pierre JouannetConclusion • Une avancée spectaculaire de la biologie issue de la serendipité crédits principaux : E. Charpentier, J.A. Doudna, F. Zheng • Des applications médicales envisageables • Des applications agronomiques envisageables • Poser les limites d'utilisation • Nécessité du débat public
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