Travaux pratiques de " Biologie Digitale & Microfluidique " - I.B.M.C.
←
→
Transcription du contenu de la page
Si votre navigateur ne rend pas la page correctement, lisez s'il vous plaît le contenu de la page ci-dessous
Biologie Digitale & Microfluidique 2018-2019
Travaux pratiques de
« Biologie Digitale & Microfluidique »
A. Présentation générale
L’objectif de ces travaux pratiques est de vous permettre d’appréhender les approches
d’analyses digitales à l’aide d’un dispositif microfluidique à gouttelettes comportant 3 entrées
(une pour l’huile/tensio-actif et 2 pour les phases aqueuses) et une sortie (Figure 1). Deux
phases aqueuses seront combinées puis dispersées dans une phase d’huile/tensio-actif afin de
produire des gouttelettes de 20 pL. Ces gouttelettes seront utilisées pour individualiser des
bactéries et caractériser leur contenu enzymatique.
Bactéries
Huile/
tensio-actif
Emulsion
Sol. de lyse
Figure 1.
L’analyse menée lors de ces TP aura pour but la quantification d’une suspension
bactérienne, en particulier son titrage en bactéries possédant une activité b-glactosidase. Pour
cela, les bactéries seront encapsulées en gouttelettes microfluidiques en présence d’une
solution de lyse contenant un détergent commercial (BugBuster) et un substrat fluorogène de
la b-galactosidase (la Fluorescein bD-DiGalactopyranoside ou FDG). Les bactéries ainsi
encapsulées seront instantanément lysées par le détergent et la présence d’une activité b-
galactosidase révélée par l’apparition d’une fluorescence verte dans la gouttelette. Pour
pouvoir procéder à cette analyse, vous aurez à (i) fabriquer vos systèmes microfluidiques, (ii)
à déterminer les conditions expérimentales à utiliser (concentration en tensio-actif et débits
des pompes) et (iii) à réaliser une courbe de calibration : occupation en fonction de la
concentration en bactéries de la suspension testée.
B. Risques et sécurité
a. Manipulation de composés fluorés
Les composés fluorés pouvant présenter une toxicité à haute dose, l’expérimentateur portera
obligatoirement des gants lors de la manipulation d’huile ou de mélange huile/tensio-actif.
1Biologie Digitale & Microfluidique 2018-2019
b. Prévention des piqures
Pour éviter tout accident lié à l’utilisation d’aiguilles, il conviendra de suivre les règles de
sécurité suivantes :
1- Ne jamais recapuchonner une aiguille qui a été ouverte.
2- Jeter les aiguilles ouvertes dans les récup-aiguilles jaunes disposés au coté de chaque
station.
3- L’enfilage des tuyaux sur les aiguilles se fait obligatoirement à l’aide d’une pince
prévue à cet effet (fournie en salle).
C. Préparation et utilisation de la station microfluidique
La production de gouttelettes sur les stations microfluidiques nécessite l’utilisation
d’un système de manipulation des liquides (pompes et seringues) ainsi que d’un système de
visualisation des gouttes (microscopes et caméra) qu’il vous faudra préparer et configurer
avant utilisation.
1. Manipulation des liquides
a. Préparation des seringues.
1- Coupez une longueur d’environ 40 cm de tuyau en teflon (PTFE)
2- Insérez avec précautions à l’aide d’une pince une aiguille bleue à l’une des extrémités
du tuyau.
3- Remplissez la seringue à l’aide d’une aiguille neuve.
4- Retournez la seringue et chassez-en l’air délicatement.
5- Jetez l’aiguille dans la poubelle prévue à cet effet et montez le système aiguille/tuyau
préparé au point 1.
6- Poussez doucement le liquide dans le tuyau en maintenant la seringue verticale jusqu’à
ce que le liquide remplisse presque entièrement le tuyau. Gardez 1cm d’air à
l’extrémité ouverte du tuyau.
b. Configuration des pompes pousse-seringues
7- Placer l’interrupteur situé à l’arrière de la pompe sur la position « 1 ».
8- Vérifiez le diamètre interne programmé en maintenant la touche « Diameter »
enfoncée. Le diamètre des seringues utilisées est de 4,6 mm. Si le diamètre
programmé est le bon, passez au point 9, sinon programmé le bon diamètre en utilisant
la séquence : - « Set »
- « Diameter »
- « 4.6 »
- « Enter »
9- Programmez le débit d’injection à l’aide de la séquence :
- « Set »
- « Infuse rate »
- Tapez la valeur du débit souhaité en µL/h
- Pressez la touche « Infuse Rate » jusqu’à avoir des « µL/h »
comme unité.
- « Enter »
La pompe est à présent prête à l’emploi.
2Biologie Digitale & Microfluidique 2018-2019
c. Amorçage du système de pompage
10- Placez la seringue sur le support de la pompe
11- Lancez la pompe à un débit de 5.000 µL/h pendant quelques secondes jusqu’à ce que
le cm d’air laissé à l’extrémité du tuyau (voir point 6) soit éliminé du tuyau et que
vous voyez une goutte de liquide se former à l’extrémité du tuyau.
12- Stoppez la pompe.
13- A l’aide d’une pince, insérer le tuyau environ 1mm dans le PDMS, au niveau de
l’entrée correspondante (voir Figure 1)
2. Préparation du système d’observation
1- Allumer la lampe du microscope à l’intensité maximum.
2- Ouvrez le diaphragme au maximum.
3- Réalisez la mise au point avec l’objectif de plus faible grossissement (5 ou 10x).
4- Démarrez le logiciel AVT et ajustez le shutter à la valeur minimum.
D. Préparation des puces microfluidiques
Un moule a été préparé pour photolithographie molle. Ce moule permet la préparation
de deux puces portant chacune 4 dispositifs identiques à celui présenté plus haut. Deux blocs
de PDMS de 4 dispositifs chacun vous seront remis en début de semaine.
1- Couvrez chaque dispositif par un morceau de scotch. Puis appliquer les points 2 à 5
pour chaque dispositif.
2- Retirez le scotch couvrant un des dispositifs.
3- Percer les entrées de la puce à l’aide du poinçon à biopsie fourni (diamètre 0.75mm)
en prenant garde de porter des gants et de ne pas toucher la surface non-protégée par
du scotch.
4- Une fois les 4 trous percés dans le dispositif, replacer le scotch de protection et
procédez de même pour le dispositif suivant.
5- Une fois tous les trous percés, retournez la puce et retirez, à l’aide d’une pince les
petits morceaux de PDMS apparents. Collectez ces morceaux sur un morceau de
scotch et jetez-le à la poubelle.
Suite faite par nos soins :
6- Eliminez les fragments de PDMS restant dans les trous en soufflant de l’azote sous
pression à travers les trous.
7- Nettoyer une lame de verre à l’aide d’un papier et d’eau MilliQ.
8- Séchez la lame à l’azote.
9- Placez le bloc de PDMS et la lame dans le four à plasma et exposez-les pendant 30
secondes au plasma d’oxygène.
10- Placez le PDMS et la lame de verre en contact.
11- Placez le montage au moins 15 minutes à 65°C.
12- Traitez la surface des canaux en injectant une solution de silane fluoré dans la puce.
L’excès de silane est ensuite éliminé en injectant de l’azote dans le circuit
microfluidique.
13- Couvrez le montage de scotch.
La puce microfluidique est prête à l’emploi.
E. Caractérisation des dispositifs microfluidiques préparés
3Biologie Digitale & Microfluidique 2018-2019
Afin de pouvoir utiliser les dispositifs que vous avez préparés, il vous faut déterminer deux
paramètres : les débits nécessaires à la production de gouttes de taille voulue et la
concentration en tensio-actif nécessaire à stabiliser les gouttes.
a. Détermination des débits de production
Cette caractérisation se fera avec une concentration de tension-actif fixée arbitrairement à
0,125%. Vous utiliserez comme phases aqueuses du PBS 1x en lieu et place de la suspension
bactérienne et de la solution de lyse test (PBS1x, BugBuster 1x).
1- Chargez la seringue d’huile-tensio-actif et montez-la sur une pompe.
2- Chargez les 2 seringues de phase aqueuse et montez-les sur la seconde pompe.
3- Amorcez les pompes.
4- Connectez les tuyaux à la puce.
5- Connectez un tuyau de collecte à la sortie de la puce et plongez l’autre extrémité du
tuyau dans un tube de collecte poubelle.
6- Démarrez les pompes à 500 µL/h.
7- Une fois les flux stabilisés entrez les débits que vous souhaitez tester.
8- Déterminez les débits permettant la production de gouttes de 20 pL en testant
différents débits d’huile compris entre 100 et 600 µL/h avec un incrément de 100 µL/h
entre chaque test et un débit total de phase aqueuse compris entre 100 (2x50) et 500
(2x250) µL/h avec un incrément de 100 µL/h.
Prenez une photo pour chaque condition testée et résumez l’expérience sous forme d’un
tableau en indiquant le volume exact que vous aurez déterminé par calcul.
b. Détermination de la concentration en tensio-actif à utiliser
La concentration en tensio-actif est particulièrement importante car un excès peut favoriser
des échanges micellaires entre les gouttes et un déficit conduit à une instabilité des gouttes.
Vous réaliserez l’expérience avec différents mélanges huile/tensio actif contenant 0,5 %, 0,25
% ou 0.125% de tensio-actif.
9- Préparez les différentes dilutions d’huile/tensio-actif en utilisant de l’huile comme
diluant.
10- Chargez une seringue avec 500 µL d’huile/tensio-actif et montez-la sur une pompe.
11- Chargez les 2 seringues de phase aqueuse (PBS et Solution de Lyse Test) et montez-
les sur la seconde pompe.
12- Amorcez les pompes.
13- Connectez les tuyaux à la puce.
14- Produisez une émulsion en utilisant les débits déterminés précédemment.
15- Connectez un tuyau de collecte à la sortie de la puce et plongez l’autre extrémité du
tuyau dans un tube contenant 50 µL d’huile minérale.
16- Collectez l’émulsion produite pendant 10 minutes.
17- Répétez l’expérience avec une nouvelle concentration en tensio-actif.
18- Déposez un peu d’émulsion produite sur une cellule de comptage et observez au
microscope.
19- Prenez la photo d’un champ type pour chaque condition testée.
20- Déterminez la concentration optimale en tensio-actif à utiliser.
F. Quantification digitale de bactéries
Assurez-vous que vos tubes soient toujours gardés sur glace pour limiter la croissance
et/ou la mort des bactéries.
4Biologie Digitale & Microfluidique 2018-2019
a. Préparation des échantillons
1- Prélevez une colonie de bactéries exprimant la b-galactosidase et mettez-la en culture
dans 5 mL de LB-Ampicilline (utilisée à 100µg/mL) additionné d’IPTG (100 µM)
pendant une nuit à 37 °C sous agitation.
2- Pour les suspensions inconnues inoculez 5 mL de LB-Ampicilline (utilisée à
100µg/mL) additionné d’IPTG (100 µM) par 10 µL de suspension inconnue et placez
en culture pendant une nuit à 37 °C sous agitation.
3- Le lendemain, centrifugez 5’ à 6000 rpm.
4- Lavez le culot par 5 mL de PBS 1x.
5- Centrifugez 5’ à 6000 rpm.
6- Reprenez le culot par 5 mL de PBS 1x.
7- Mesurez la DO de la suspension à 600 nm à partir d’une dilution au 1/10.
8- Préparez les dilutions (en utilisant du PBS 1x comme diluant) vous permettant de vous
placer à la valeur lambda souhaitée.
La courbe de calibration sera réalisée avec des valeurs lambda de 4, 1, 0.25, 0.06 ou 0.015.
Les suspensions inconnues seront analysées avec une valeur lambda de 0.2.
Rappel : 1 DO = 4.108 bactéries/mL (d’après Najah et al 2012)
b. Production des émulsions
9- Chargez une seringue avec une dilution appropriée de tensio actif qui aura été
déterminée au jour 2.
10- Chargez une seringue avec la solution Lyse-FDG (PBS 1x, BugBuster 1x, 100µM
FDG) qui vous est fournie.
11- Chargez une seringue avec la dilution de bactéries que vous souhaitez tester.
Note : vous prendrez soin de réaliser vos tests en ordre croissant de concentration pour éviter
les contaminations croisées.
12- Amorcez les pompes et connectez les tuyaux à la puce.
13- Démarrez les pompes à 500 µL/h.
14- Dès que les flux sont stables à la caméra, entrez les valeurs de débit déterminées au
jour 2 permettant la production de gouttes.
15- Connectez en tuyau de collecte fourni en salle à la sortie de la puce.
16- Collectez les émulsions en plongeant l’extrémité du tuyau de collecte dans des tubes
PCR contenant 50 µL d’huile minérale.
17- Collectez l’émulsion pendant 10-15 min.
18- Déconnectez le tuyau de collecte de la puce.
19- Stoppez les pompes.
Les émulsions ainsi produites peuvent être analysées immédiatement ou conservées la nuit sur
la paillasse sous une feuille d’aluminium pour limiter le blanchiment de la fluorescéine.
G. Observation des gouttelettes au microscope à épi-fluorescence
a. Dépôt des émulsions sur lame de comptage
1- Passez un doigt humide sur le porte-lamelle d’une cellule de comptage et mettez
immédiatement la lamelle en place.
2- Mettez la cellule en place sur la platine du microscope.
3- A l’aide d’un Pipetman prélevez environ 5-10 µL d’huile fluorée sous l’émulsion
collectée, puis prélevez un petit peu d’émulsion.
4- Injectez immédiatement l’émulsion ainsi diluée entre la lame et lamelle de la cellule
de comptage.
5Biologie Digitale & Microfluidique 2018-2019
5- Procédez aux observations et comptage.
b. Utilisation des microscopes à épi-fluorescence
6- Retirez la housse de protection du microscope, le cache-lampe et les cache-oculaires.
7- Allumez dans l’ordre (i) le boitier Colibri, (ii) le microscope et (iii) l’ordinateur.
8- Lancez le logiciel Axiovison.
Note : Les explications sur l’utilisation des logiciels seront données de façon individuelle au
moment approprié.
9- Les observations seront réalisées avec l’objectif 10x, en contraste de phase et en
fluorescence FITC (excitation 490 nm/émission 520nm).
H. Bactériologie
a. Estimation de viabilité
1- A partir de la DO mesurée, déterminez la concentration en bactéries de votre
suspension b-gal + et préparez une dilution en milieu LB vous permettant d’obtenir
100 et 1000 colonies par boite.
2- Mélangez 100 µL de vos dilutions avec 40 µL de X-Gal et 40 µL d’IPTG.
3- Déposez l’ensemble sur une boite LB-Amp.
4- Etalez à l’aide de 4-5 billes en verre stériles.
5- Placez votre boîte la nuit à 37°C.
6- Le lendemain, comptez le nombre de colonies obtenues et calculez le pourcentage de
viabilité de vos bactéries.
b. Titrage de la suspension inconnue
1- A partir de la DO mesurée, déterminez la concentration en bactéries de votre
suspension inconnue. Connaissant le pourcentage de viabilité de vos bactéries,
préparez une dilution en milieu LB vous permettant d’obtenir 100 et 1000 colonies par
boite.
2- Mélangez 100 µL de vos dilutions avec 40 µL de X-Gal et 40 µL d’IPTG.
3- Déposez l’ensemble sur une boite LB-Amp.
4- Etalez à l’aide de 4-5 billes en verre stériles.
5- Placez votre boîte la nuit à 37°C.
6- Le lendemain, comptez le nombre de colonies blanches et bleues.
7- Déterminez le titre des suspensions inconnues en bactéries b-galactosidase +.
I. Compte-rendu de manipulation
Vous résumerez rapidement le protocole utilisé pour chaque partie du TP (le copier-coller du
présent protocole est naturellement autorisé). Vous présenterez ensuite rapidement le résultat
obtenu et sont interprétation. A défaut, donnez au moins les données brutes obtenues
(comptages, photo de gouttes….). Ces données seront utilisées pour une analyse statistique
globale du TP sur l’ensemble des binômes.
6Biologie Digitale & Microfluidique 2018-2019
Programme journalier
Jour 1 : - Préparation des puces microfluidiques
- Préparation du matériel et des stations microfluidiques
Jour 2: - Détermination des débits pour la production des gouttes
- Détermination du pourcentage de tensio-actif à utiliser
- Lancement des cultures de bactéries b-galactosidase + à partir d’une boîte
IPTG-X-Gal
Jour 3: - Récupération et lavage des cellules
- Réalisation de la courbe de calibration occupation = f (concentration en
bactéries) à partir d’une gamme lambda théoriques de 4, 1, 0.25, 0.06 et
0.015.
- Imagerie des émulsions de calibration au microscope à épi-fluorescence
(Part.1)
- Test de viabilité
- Lancement de 2 pré-cultures inconnues par binômes.
Jour 4: - Récupération et lavage des suspensions inconnues
- Encapsulation des suspensions inconnues à une valeur lambda = 0.2
- Imagerie des émulsions de calibration au microscope à épi-fluorescence
(Part.2)
- Imagerie des émulsions inconnues au microscope à épi-fluorescence (Part. 1)
- Calcul de la viabilité de bactéries (comptage et calcul)
- Titrage de la suspension par étalement sur boite (étalement)
Jour 5: - Imagerie des émulsions inconnues au microscope à épi-fluorescence (Part. 2)
- Titrage de la suspension par étalement sur boite (comptage et calcul)
- Détermination du titre des solutions inconnues en bactéries b-gal +.
Mettez les temps morts du TP à profit pour rédiger un compte rendu expérimental que
vous remettrez au plus tard une semaine après la fin de la semaine de TP.
7Vous pouvez aussi lire
