DESC de Maladies Infectieuses et Tropicales 10 Avril 2017 Jean-Christophe Lagier, IHU Méditerranée Infection, Marseille

DESC de Maladies Infectieuses et Tropicales
              10 Avril 2017
         Jean-Christophe Lagier,
  IHU Méditerranée Infection, Marseille

Partie I – Exploration du microbiote digestif

Microbiote digestif
• Le microbiote intestinal, autrefois appelé microflore
  intestinale, est l’ ensemble des bactéries, virus, champignons
  qui vivent dans le tube digestif

• Chaque individu héberge 1010 à 1014 (100 000 milliards)
  bactéries vivantes dans son intestin ce qui représente 10 à 100
  fois le nombre de cellules du corps humain

PHYLA OU EMBRANCHEMENTS BACTERIENS
                            Bifidobacterium
                            longum

Bacteroidetes
   Bacteroides fragilis
Firmicutes
   Staphylococcus
   Clostridium
   Lactobacillus
Actinobacteria                   Escherichia
                                  coli
   Bifidobacterium

Proteobacteria (

Techniques d’étude

• Techniques culture-dépendantes
  – Bactéries vivantes

• Techniques moléculaires indépendantes de la culture
  – ADN de la bactérie (bactérie vivante ou morte)

  – Une grande partie des espèces bactériennes du microbiote digestif
    n’avaient jamais été cultivées et sont retrouvées uniquement par la
    biologie moléculaire

SEQUENCAGE MOLECULAIRE

Une séquence d’ ADN bactérien  Un phylotype (et non une
espèce)
Techniques moléculaires indépendantes de la culture
PCR à large échelle (pyroséquençage)            Goldstandard de l’étude
                                                des écosystèmes complexes
PCR = POLYMERASE CHAIN REACTION

Phylum relative abundance depends significantly of 16S hypervariable region
                independently of pyrosequencing chemistry

                                                Claesson, Nucl Acid Res, 2010

Primer bias Turnbaugh, PNAS, 2010
                                                      Ralstonia detected only
           V2 primers lacks Bifidobacteria            by v4/v5 primers in this
                                                      study

                                                    Genus relative
                                               abundance and richness
                                               depends significantly of
                                               16S hypervariable region

                                                   (454 Titanium)
Claesson, Nucl Acid Res, 2010
                                                      Bifidobacteria detected
                                                      only by v3/v4 primers in
                                                      this study

Biais de profondeur

Culturomics
                                          Stool

                                                                     Pyrosequencing 16S

Microbial culturomics
   Multiplying culture conditions                                 PCR ARNr 16S
-Increasing of fastidious bacterial                                  No identification

growth
-Eliminating dominant populations

                                                  Maldi-TOF       New species:
                                                               Genome sequencing

                                      + 1 obese stool sample

– 32 500 colonies tested by MALDI-TOF
– 212 culture conditions
– 340 bacterial species including
    • 31 new bacterial species (including 6 new genera)
    •   174 isolated for the first time in the human gut
    •   2 species among rare phyla (Synergistetes, Deinococcus-Thermus)
    •   Largest genome bacterial species : Microvirga massiliensis (9,35 Mb)
    •   Senegalvirus : 1st giant virus isolated from human gut

Background : Culturomics

Température de croissance

    Croissance de bactéries
     ayant des propriétés                                   Atmosphere (aerobie, anaerobie
  physico chimique différentes                              Enceinte anaerobie,Microaerophile)

                                    Antibiotiques
   Lutte contre
    les bactéries
    majoritaires
                                    Filtrations
                                                                        Bactéries minoritaires

                                    Phages

                                     Choc thermique

Bactéries fastidieuses

                                                        Pre-incubation dans des flacons
                                                  d’hémocultures avec du jus de rumen et du sang

        Bactéries
      extremophiles              Milieu spécifiques pour bactéries halophiles
                                 (NaCl = 150 G/L)

         Challenges                                   Réponses

Doublement du nombre de bactéries
isolées du tube digestif

Augmentation de plus de 20% du nombre
de bactéries isolées chez l’homme

Applications pratiques

Partie II – Role du microbiote digestif

Colonisation du tube digestif
• A la naissance, le tube digestif est stérile et dépourvu de
  bactéries.

• La colonisation microbienne débute dès les premiers instants
  de vie et est modifiable selon
  – Allaitement (vs biberon)
  – Contacts humains (mère)
  – Alimentation
  – L’environnement
  – Facteurs de l’hôte (génétiques ?)

ALLAITEMENT = TRANSMISSION D’UN MICROBIOTE

   Le lait maternel est composé d’une flore bactérienne
abondante et très diverse et notamment de Lactobacillus et
                    de Bifidobacterium

C’est vers l’âge de 2 ans que le microbiote devient stable sur
               le plan structurel et fonctionnel.

LE LAIT MATERNEL EST UNE SOURCE DE BACTERIES LACTIQUES
              POUR LE TUBE DIGESTIF DU BEBE

                                                                      Martin, J Pediatr, 2003
 La même souche bactérienne (Espèce Lactobacillus gasseri) est
retrouvé dans le lait de la maman, dans la bouche du bébé et dans
                          les selles du bébé

  Cette bactérie n’était pas retrouvé sur la peau de la maman ni au
                          niveau de son vagin.

La COMPOSITION DU
     MICROBIOTE varie selon les
     segments du tube digestif

–   Teneur du milieu en oxygène
–   pH
–   Sécrétions (tolérance à la bile)
–   Nutriments disponibles
–   Vitesse du transit (rapide de la
    bouche au caecum, plus lent
    ensuite)

La COMPOSITION DU MICROBIOTE varie selon
                    les segments du tube digestif

Gradient quantitatif croissant oral-aboral
    Estomac < 103 UFC/g
    Duodénum 103-104 UFC/g
    Jéjunum 104-106 UFC/g
    Iléon 106-108 UFC/g
    Colon 109 à 1011 UFC/g
    UFC: unité formant colonie

Gradient qualitatif
  diminution progressive des bactéries aérobies au profit des bactéries anaérobies
   strictes au niveau du colon

Interrelation du régime, de l’hôte et de la
                     flore digestive

• La microflore intestinale est en interrelation permanente avec
  les aliments et l’organisme humain, l’ensemble constituant un
  écosystème complexe.

• Toute modification de l’un ou de l’autre de ses constituants est
  susceptible de perturber l’équilibre et le fonctionnement de
  l’ensemble.

Effet digestif
• Trophicité
  – Etablissement,
    maturation et
    entretien de la
    barrière de la
    muqueuse
    intestinale

• Motricité
  – Stimulation du
    transit intestinal

Effets nutritionnels

 Dégradation des hydrates de carbone (sucres) non absorbés
   Cellulose, Amidon, pectine, glycoprotéines
   Aboutissant à la production d’ « acides gras à chaines courtes »
    assimilables par l’hôte (acétate, propionate, butyrate) et de gaz (CO2, H2)
   L’acide butyrique est la principale source d’énergie de la muqueuse colique

 Hydrolyse des lipides alimentaires non absorbés
   Lipases bactériennes
   Conjugaison des acides biliaires primaires, indispensable pour une bonne
    absorption des graisses                                                       Cellulose

 Dégradation de certaines protéines et de certains acides aminés,
  permettant la récupération de l’azote
   Tryptophane

Apport vitaminique

• Certaines bactéries sont capables de synthétiser des vitamines

  – Riboflavine (Vitamine B2)
  – Acide pantothénique (Vitamine B5)
  – Pyridoxine (Vitamine B6)
  – Biotine (Vitamine B8 ou H)
  – vitamine B12 (son déficit entraine une anémie)
  – vitamine K (Facteurs II, VII, IX, X –Coagulation)

Protection contre l’infection

• Effet de barrière vis-à-vis des bactéries exogènes “résistance à
  la colonisation”
  – élimination totale de la souche exogène
  – maintien de la souche exogène en sous-dominance

• La flore digestive stimule l’immunité locale et générale

Partie III –VARIATIONS
 PHYSIOLOGIQUES ET
  PATHOLOGIQUES
du microbiote digestif

Facteurs de variation de la composItion du microbiote digestif

    •   Age
    •   Sexe
    •   Géographie
    •   Régime
    •   Antibiotiques
    •   Probiotiques

Particularités du microbiote et ethnies

• La composition du microbiote est très dépendante des facteurs
  environnementaux
• Varie d’une population à une autre (alimentation, hygiène…)

                                 De Filippo et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 ;107:14691-6.

Microbiote digestif des sociétés traditionnelles et urbaines

 • Urbaines (180)
    –   Saoudiens
    –   Français
    –   Polynésiens
    –   Sénégalaises
    –   Nigériens

 • Traditionnelles (220)
    –   Amazoniens
    –   Pygmées
    –   Bedouins
    –   Tuaregs

 • Principle Coordinate Analysis
    –   Traditionnelles clusterisent différemment

Microbiote digestif des sociétés traditionnelles et urbaines

• Urbaines : clusterisent différemment au niveau
  de la concentration de Bifidobacterium dans
  leur microbiote digestif

Microbiote digestif des sociétés traditionnelles et urbaines

• Microbiote des urbains :
      Enrichie par les
    bactéries contenues
    dans les probiotiques

  Consommation importante
    de probiotiques et de
      produits laitiers

Probiotiques et obésité: L'hypothèse

• L’ alimentation modifie l'équilibre dans l'intestin
    – source de bactéries et de virus

• Les bactéries contenues dans les probiotiques pourraient modifier la
  flore intestinale et avoir ainsi un rôle dans la pandémie actuelle
  d’obésité                               1. Raoult D. Nature 2008; 454:690-691
                                              2.   Angelakis E et al. Future Microbiol 2012;7:91-109.

 Probiotiques quotidiennement consommés

      Promoteurs de croissance
         dans l'agriculture
                                        Angelakis E, et al. Lancet Infect Dis 2013;13:889-99

Coloration de gram d’un yaourt

Probiotiques - Yaourts contiennent des quantités très élevées de bactéries

                                           Angelakis E, et al. J Food Sci 2011;76:M568-72.

                                                                                             35

Observation d’un effet espèce
                         dépendant

                         • L. reuteri: obésité
                         • L. casei/paracasei: absence
                           obésité

                         Première observation de l’effet anti-
                                 obésité des BIFIDUS
                           (Bifidobacterium animalis) chez
                                      l’homme

     Les bactéries lactiques, donc
  l’allaitement et les probiotiques,
pourraient prédisposer ou au contraire
       protéger contre l’obésité

Le stress oxydatif digestif anormal entraine une perte du microbiote humain
             mature anaérobie chez les enfants avec malnutrition aiguë sévère

                 Archaea

                                   340 procaryotes perdus chez les
                                    enfants avec un Kwashiorkor        L’augmentation du potential redox
                                                                       fécal des enfants avec kwashiorkor
                                incluant les 4 archées méthanogènes
                                     (=> maldigestion par perte       reflète le manque d’anti-oxydants et
                                                                        explique la perte des procaryotes
                                   fermentation/méthanogenèse)
                                                                                   anaérobies
PREMIERE DEMONSTRATION DU LIEN ANTIOXYDANTS-CONTRÔLE STRESS OXYDATIF-MAINTENANCE MICROBIOTE SAIN

Colite à Clostridium difficile

Significant difference between known and predicted
              species

By F.Rohwer                                                        41

We know only the
tip of the microbial
            iceberg.

Métaprotéomique

A retenir

• Nous sommes ce que nous mangeons et la flore intestinale est le reflet
  de notre alimentation

• La flore intestinale joue un rôle dans l’absorption des nutriments

• Le microbiote intestinal semble impliqué dans de nombreuses
  pathologies intestinales, métaboliques ou autres

•   Il est difficile de faire des conclusions générales sur la flore
    intestinale car les études sont biaisées par les méthodes utilisées

Microbiote              Maladies liées au microbiote

                 ?
 Digestif

               Régime
             Probiotiques
             Antibiotiques
      TRANSPLANTATION DE
       MICROBIOTE FECAL

Merci de votre attention

  jean-christophe.lagier@univ-amu.fr