Mode d'emploi Microscope Apotome Zeiss - Inserm
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Plateau technique d'imagerie
cellulaire INFINITy - Purpan
Sept 2015, MAJ mars 2021
Mode d'emploi
Microscope Apotome Zeiss
Plateau technique d’imagerie cellulaire INFINITy - Purpan
Sophie Allart : allart@toulouse.inserm.fr Simon Lachambre : simon.lachambre@inserm.fr
Tél : 05. 62. 74. 45. 56 - 05. 31. 54. 79. 01
Composition du système
Type de microscope Zeiss Axio-observer (statif inversé)
Type de Brûleur HXP 120
Shutter de fluorescence Obturateur de la lampe
VERT 38 HE eGFP shift free
EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50
ROUGE 43 HE Cy 3 shift free
Filtres de fluorescence présents
EX BP 550/25, BS FT 570, EM BP 605/70
DAPI 49 DAPI shift free
EX G 365, BS FT 395, EM BP 445/50
FAR RED 50 Cy 5 shift free
EX BP 640/30, BS FT 660, EM BP 690/50
Objectif EC "Plan-Neofluar" 10x/0,3 Ph1 M27 (Phase)
Objectifs pour observation en
Objectif "Plan-Apochromat" 20x/0,8 M27
fluorescence
Objectif "Plan-Apochromat" 40x/1,4 Oil DIC M27
Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Oil DIC M27
Objectifs pour observation en
40X, 63X
contraste interférentiel (DIC)
Motorisée par joystick
Platine de déplacement
Déplacement en Z Galvanométrique précision de 25 nm
Changement d’objectifs Motorisé
Facteur de grossissement du tube 1X
Chambre C02 Non
Thermorégulateur Non
Caméra Axiocam HRm Rev.3
Résolution et taille du pixel 1388x1040 et jusqu'à 4164x3120 - pixel 6,45 µm
CCD refroidi oui
Digitalisation jusqu’à 14bit
Bruit noir 0,07 e-/p/s @ -30°C
Images multi-marquages en séquentiel
Acquisition
2D à 6D
Multi-champ, Mosaïque
Logiciel d’acquisition Zen 2012
Système d’exploitation Windows XP
Ordinateur Processeur Xéon 6 Core MUI, 6 Go RAM
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Filtre 38 (vert):
Excitation: BP 470/40
Beam Splitter: FT495
Emission: BP 525/50
Fluorochromes: 5-Carboxyfluorescein (5-FAM) 5-FAM (5-Carboxyfluorescein) Acridine
Orange, both DNA & RNA Acridine Yellow Alexa Fluor 488™ Astrazon Orange R
Auramine Aurophosphine Cy2™ DiO (DiOC18(3)) EGFP FITC FITC Antibody Fluo-3 Fluo-
4 Fluorescein (FITC) Fluoro-Emerald GFP (S65T) GFP red shifted (rsGFP) GFP wild type,
non-UV excitation (wtGFP) Lyso Tracker Blue-White Mitotracker Green FM Oregon Green
488-X Oregon Green™ 488 Oregon Green™ 500 PKH67 rsGFP S65A S65C S65L S65T
sgGFP™ (super glow GFP) SYTO 13 SYTO 18
Filtre 43 (rouge):
Excitation: BP 545/25
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Beam Splitter: FT570
Emission: BP 605/70
Fluorochromes: DsRed (Red Fluorescent Protein) Ethidium Bromide Fluor Ruby Magdala
Red (Phloxin B) Phloxin B (Magdala Red) Rhodamine B Rhodamine BB Rhodamine B 200
R-phycoerithrin (PE) Sevron Brilliant Red B Xylene Orange
FilterSet 49 (bleu):
Excitation: G365
Beam Splitter: FT395
Emission: BP 445/50
Fluorochromes: 1,8-ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid); 1-Anilinonaphthalene-8-
sulfonic acid (1,8-ANS); 6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0; 7-Amino-4-
methylcoumarin pH 7.0; 7-Hydroxy-4-methylcoumarin; 7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH
9.0; Alexa 350; AMCA conjugate; Amino Coumarin; BFP (Blue Fluorescent Protein);
Cascade Blue; Coumarin; DAPI; DAPI-DNA; DyLight 350; Hoechst 33258; Hoechst 33258-
DNA; Hoechst 33342; Indo-1 Ca2+; Indo-1, Ca free; Indo-1, Ca saturated; LysoSensor Blue;
LysoSensor ; Blue pH 5.0; LysoSensor Yellow pH 9.0; LysoTracker Blue; Marina Blue
Filtre 50 (rouge lointain):
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Excitation: BP 640/30
Beam Splitter: FT660
Emission: BP 690/50
Fluorochromes: Alexa 647; Alexa 660, Alexa Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2; Alexa
Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2; Allophycocyanin pH 7.5; APC (allophycocyanin); Atto
647; BODIPY 650/665-X, MeOH; Cy 5; DDAO pH 9.0; DyLight 649; Nile Blue, EtOH; TO-
PRO-3-DNA; TOTO-3-DNA
Allumage du système
- Eteindre le PC
- Basculez l'interrupteur sur ON au niveau de la multiprise (allume la lampe HXP 120 + le
boîtier de l'Apotome-2 + le boîtier control Unit 232 )
- Allumez le microscope (bouton à gauche du statif)
- Attendre que le microscope soit complètement allumé (la barre d'initialisation et le logo
Zeiss n'apparaissent plus sur l'écran TFT) puis démarrez le PC. Sur le bureau, choisir le
logiciel Zen 2012
Observation aux oculaires
L'observation de l'échantillon aux oculaires se pilote au travers du logiciel en sélectionnant
dans l'onglet le bouton Oculaire et le fluorochrome à observer.
Pour acquérir une image en transmission il faut d'abord faire un réglage de Koehler.
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Le réglage de Koehler doit être fait aux oculaires lorsque l'on souhaite observer l'échantillon
en transmission afin d'obtenir une image de meilleure qualité.
Il est à régler sur le plus faible grossissement puis à re-régler à chaque changement d'objectif.
2. diaphragme de champ
En mode oculaire :
3. hauteur bloc
condenseur • Faire la mise au point
sur l'échantillon
• Fermer à fond le
diaphragme de champ
4. centrage bloc
condenseur • Régler la hauteur du
bloc condenseur jusqu'à
voir les bords du
diaphragme net
• Centrer le diaphragme à
l'aide des vis argentées.
• Elargir le diaphragme
juste assez pour faire
disparaître les bords.
1. mise au point
échantillon
Charger une configuration
Tous les canaux qu'il est possible d'acquérir (Dapi, vert, rouge, rouge lointain) sont présents
dans l'onglet Channels. Activez les canaux que vous souhaitez acquérir.
Pour définir un temps d'exposition, cliquez sur Live et sélectionnez chaque canal afin de
déterminer le temps d'exposition adéquat. Pour cela, cochez Auto Exposure et ce temps sera
déterminé de manière automatique.
En dessous de l'image Live qui s'affiche, activez l'icône Range Indicator.
Les pixels saturés vont alors apparaître en rouge.
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Si le temps d'exposition proposé vous convient, cliquez sur Stop.
Si ce n'est pas le cas, réduisez-le manuellement jusqu'à ne plus avoir de pixels saturés.
La calibration du temps d'exposition est à faire pour chaque canal (fluo et transmission).
Une fois ces réglages faits pour la fluorescence et la transmission, vous pouvez acquérir une
image en cliquant sur Snap.
Il est aussi possible de charger une configuration à partir d'une image .czi. Ouvrez l'image
(File/Open) puis cliquez sur ReUse sous l'image acquise. Les paramètres
d'acquisition de cette image seront automatiquement re-appliqués (canaux, temps
d'exposition, stack…).
Comparaison d'intensité: Si vous souhaitez faire une étude d'intensité sur vos images,
réalisez d'abord vos mesures de temps d'exposition sur l'échantillon le plus brillant et gardez
ces paramètres pour acquérir les images suivantes.
Utilisation de l'apotome
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Poussez le bras de l'apotome délicatement dans le trajet de la fluorescence sur le côté du
microscope. Un bip sonore signale que l'apotome a bien été placé.
Les fonctions basiques sont les même qu'en épifluorescence.
Attention: La mise au point est identique en mode champ large et en mode apotome mais le
temps d'exposition est différent. Il faut donc le mesurer de nouveau après avoir enclenché le
bras de l'apotome.
Attention: il ne sert à rien d'utiliser l'apotome avec l'objectif 10X
Mode Champ Large Mode Apotome
Afin que le logiciel fasse les acquisitions en mode Apotome, vérifiez dans l'onglet Apotome
Mode que Enable Apotome est coché (et pour acquérir en Champ large, il doit être décoché).
Une fois l'image acquise, dans l'onglet Apotome sous l'image, cliquez sur Create Image. Une
nouvelle image est alors créée et c'est cette image qui doit être sauvegardée.
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Si vous observez des résidus de grilles sur votre image, avant de cliquer sur Create Image
vous pouvez appliquer un filtre (Fourrier) (menu déroulant au-dessus de Create Image.
Acquérir une pile d'images en Z
Cochez Zstack, l'onglet Zstack apparaît.
Mettez vous en Live sur le canal d'intérêt et déplacez-vous en Z à l'aide de la vis
micrométrique et déterminez le premier plan en cliquant sur Set First (1). Faites la même
chose pour déterminer le dernier plan en cliquant sur Set Last (2). Vous pouvez déterminez
vous-même le nombre d'images à acquérir ou l'intervalle entre chaque image. Pour obtenir de
meilleurs résultat, cliquez sur le bouton à côté d'Optimal (3)pour avoir un intervalle entre
deux images qui respecte le théorème de Nyquist.
2
3
1
Afin de ne pas observer de saturation, se mettre en Live en fausse couleur et chercher pour
chaque canal séparément en naviguant en Z s'il y a un plan plus lumineux que celui sur lequel
les réglages ont été précédemment faits. Si c'est le cas, ajustez le temps d'exposition pour qu'il
n'y ait plus de saturation.
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Réaliser des acquisitions au cours du temps
Cochez Time Lapse et dans le nouvel onglet Time Lapse qui s'est ouvert choisissez le nombre
de cycles et l'intervalle entre chaque acquisition.
Pour ne pas perdre les données si un problème se produit au cours de l'acquisition, faire une
sauvegarde automatique (cf Sauvegarde).
Attention: l'Apotome n'a pas d'incubateur ni de régulateur de CO2!
Acquérir une Mosaïque
Cochez Tiles.
Attention: Avant d'acquérir une mosaïque, décochez Auto Exposure pour tous les canaux.
Dans ce nouvel onglet, les mosaïques peuvent être acquises de manières différentes:
- La méthode la plus simple est de déterminer directement le nombre de tuiles dans Add Tile
Region et de cliquer sur +. La mosaïque apparaît dans Tile Regions and Positions et la
position actuelle sera le centre de la mosaïque.
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Tél : 05. 62. 74. 45. 56 - 05. 31. 54. 79. 01- Il est aussi possible de dessiner soi-même la mosaïque. Pour cela, cliquez sur le bouton
Advanced Setup, une nouvelle fenêtre s'ouvre avec une fenêtre Live. Différents points de la
mosaïque peuvent être marqués en appuyant sur F2 (une image va être acquise à cette
position) afin de servir de repères. On peut alors ensuite dessiner la mosaïque autour de ces
points. Pour cela, sous l'image, choisir l'onglet Tile Region Setup et l'option Contour puis
dessinez votre mosaïque autour de vos repères
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Tél : 05. 62. 74. 45. 56 - 05. 31. 54. 79. 01- Enfin, une mosaïque peut être réalisé en fonction du support de votre échantillon (plaque 96
puits…)
Tout d'abord, dans Sample Carrier choisissez le support de votre échantillon en cliquant sur
Select.
Ensuite, il faut calibrer la platine et la boîte. Dans l'onglet Tiles, dans Sample Carrier, cliquez
sur le bouton Calibrate. Une nouvelle fenêtre s'ouvre. Vérifiez qu'il n'y a rien qui peut gêner
la platine puis cliquez sur Calibrate. La platine s'initialise seule.
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Tél : 05. 62. 74. 45. 56 - 05. 31. 54. 79. 01Ensuite, cliquez sur Next.
Il faut alors calibrer le support de l'échantillon. Suivez les indications données par le logiciel
qui varient en fonction du support utilisé.
Pour définir ensuite votre mosaïque, cliquez sur Advanced Set up. Sous l'image, dans Carrier ,
sélectionnez dans quels puits, si vous utilisez une plaque à puits, vous souhaitez faire une
mosaïque (1) (Ctrl+ A pour sélectionner tous les puits, Ctrl+clic pour en sélectionner
certains). Puis, dans Tile Region Setup, cliquez sur Carrier et dans Fill factor, choisissez la
superficie de la zone du puits couverte par la mosaïque et cliquez sur Create (2).
1
2
Enfin, quelle que soit la méthode utilisée pour définir votre mosaïque, si elle comporte un
grand nombre de tuiles, il faut faire une correction de focus en différents points afin de
corriger les variations de position en Z de votre échantillon. Pour cela, aller dans la partie
Focus Surface de l'onglet Tiles. Double-cliquez sur une tuile de la mosaïque; faîtes la mise au
point à l'aide de l'image Live puis cliquez sur le bouton +. Répétez sur différentes tuiles (la
correction de focus doit au moins être faite sur les 4 coins de la mosaïque). Plus la mosaïque
est grande, plus il faut enregistrer de points. Les points marqués apparaissent en jaune sur le
modèle de la mosaïque.
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Tél : 05. 62. 74. 45. 56 - 05. 31. 54. 79. 01Une fois la mosaïque acquise, la superposition des tuiles peut être à parfaire. Pour cela, aller
dans l'onglet Processing et choisissez l'option Stitching. Si la démarcation entre les tuiles est
visible, aller dans New output et cochez Fuse Tiles puis Apply.
Acquérir des multipositions sur plusieurs jours
A faire avant la première acquisition:
1. Dévissez les vis du porte échantillon afin qu'il soit bien à plat.
2. Bien caler le porte échantillon à chaque acquisition dans le même sens.
3. Placez votre boîte à chaque acquisition de la même manière (poussez la dans le même
coin car il y a du jeu)
Cochez Tiles puis dans l'onglet Tiles
4. Tout d'abord, dans Sample Carrier choisissez le support de votre échantillon en
cliquant sur Select.
Calibrez la platine et la boîte. Dans l’onglet Tiles dans Sample Carrier cliquez sur Calibrate.
Pour une plaque 96 puits, choisissez la calibration en 3 points pour laquelle à chaque étape
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Tél : 05. 62. 74. 45. 56 - 05. 31. 54. 79. 01vous devez déterminez le centre des 3 puits de coin. Suivez les indications données par le
logiciel qui varient en fonction du support utilisé.
5. Déterminez les points à étudier dans le sous-onglet Position en cliquant sur le bouton
+.
Vous pouvez aussi déterminer les points en fonction du support utilisé. Par exemple, un point
aléatoire par puit. Cliquez sur Advanced Set up. Sous l'image, dans Carrier, sélectionnez dans
quels puits, vous souhaitez acquérir un point (1) (Ctrl+ A pour sélectionner tous les puits,
Ctrl+clic pour en sélectionner certains). Puis, dans Position Setup, cliquez sur Carrier,
choisissez le nombre de points à acquérir par puit, leur localisation (centre du puit, sur les
bords, aléatoire….) et cliquez sur Create (2).
1 2
Pour les acquisitions suivantes, les points 1, 2, 3, 4, 5 et 7 sont à faire. Pour importer les
positions, ouvrez la précédente acquisition et cliquez sur le bouton Reuse.
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Tél : 05. 62. 74. 45. 56 - 05. 31. 54. 79. 01Si les différentes étapes ont été scrupuleusement suivies, le repositionnement en x et y sera
bon mais il se peut qu’il faille refaire le Z. Pour cela, dans l’onglet Positions, après avoir
réimporté les positions avec le bouton Reuse, cliquez sur Verify Position (1). Une nouvelle
fenêtre s’ouvre. En live, sélectionner la première position, refaîtes le focus et cliquez sur Set
Current Z (2). Ensuite, cliquez sur Move to Next point(3), refaîtes le focus et sauvegardez le.
Répétez ces étapes. Une fois que tous les points auront été vérifiés, la fenêtre indiquera que
tous les points sont faits.
2
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Tél : 05. 62. 74. 45. 56 - 05. 31. 54. 79. 01Si la position en X/Y des images doit être redéfinie, dans l’onglet Position, en Live, se
déplacer en x/y pour être sur les bonnes coordonnées, sélectionnez la position à modifier,
faîtes un clic droit et cliquez sur Set Current X/Y/Z for selected Position.
Sauvegarde
Toute image acquise sur l'apotome doit être sauvegardée en format .czi afin de conserver les
méta-données. Vous pouvez ensuite sauvegarder en .tif mais PAS en Jpeg (qui compresse et
donc perd des informations).
A gauche, cliquez sur l'image à sauvegarder puis clic droit/ Save As.
Sauvegarde automatique:
Lorsque vous faîtes un time lapse ou une grande mosaïque, il est important de faire une
sauvegarde automatique afin de ne pas perdre de données en cas de problème.
Allez dans Tools / Options puis dans Saving choisissez le dossier dans lequel vos fichiers
seront sauvegardés.
Extinction du système
Nettoyez les objectifs à huile avec de l’alcool et du papier Kimtech.
Baisser la tourelle des objectifs.
- Ne pas Eteindre le PC
- Eteindre le microscope avec le bouton à gauche du statif
- Basculez l'interrupteur sur ON au niveau de la multiprise
Remettre le cache en tissus bleu sur le microscope.
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Tél : 05. 62. 74. 45. 56 - 05. 31. 54. 79. 01Plateau technique d’imagerie cellulaire INFINITy - Purpan
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