Mode d'emploi Microscope Confocal Leica SP8 - Inserm
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Plateau technique
d'imagerie cellulaire
d’Infinity-Purpan
Mars 2013
Mise à jour : Mars 2021
Mode d'emploi
Microscope Confocal Leica SP8
Plateau technique d’imagerie cellulaire d’Infinity-Purpan
Sophie Allart - sophie.allart@inserm.fr – Simon Lachambre – simon.lachambre@inserm.fr
Tél : 05. 62. 74. 45. 78
05. 31. 54. 79. 01
2
SOMMAIRE
1. Allumage du système 3
2. Fonctionnement du Statif 3
2.1 Observation des échantillons aux oculaires 3
2.2 Contrôles manuels 4
2.3 Réglage de Koehler 4
3. Présentation du software 5
3.1 Présentation du menu Acquisition 5
3.2 Charger une configuration 5
3.3 Régler les paramètres pour l'acquisition 6
3.4 Acquisition de l'image 6
3.4.1 Réglage du Gain 6
3.4.2 Réglage de la puissance laser : 6
3.4.3 Comparaison d’intensité 7
3.4.4 Acquérir une image en transmission 7
4. Zoom 7
5. Echantillonnage spatial 7
6. Acquérir une pile d'images en z 8
6.1 Z-Compensation 9
6.2 Z-Compensation durant une acquisition séquentielle 9
6.2.1 Seq 2 canaux : 9
6.2.2 Seq 3/4 canaux : 10
7. Tiles Scan 11
7.1 Mark end Find 11
7.2 Pour faire de la mosaïque 11
8. Fin de manip 12
8.1 Sauvegarde 12
8.2 Extinction du système 12
9. Récapitulatif des séquences d’utilisation du SP8 13
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1. Allumage du système
1- Allumer la lampe à fluorescence
2- Allumer le contrôleur CTR6500
3- Mettre en position « ON » les 2 interrupteurs du pupitre sous le bureau
A) Scanner Power
B) Laser Power
4- Tourner la clé vers la droite (diode s’allume de couleur orange)
5- Si PC éteint, rallumer le PC : ouvrir la session « TCS user »
6- Sur le bureau, ouvrir le logiciel : LAS X
7- Lors du démarrage du logiciel, une première fenêtre apparait :
Veillez à ce que le module STED et « Apply Customized User Settings » soit sur « OFF », puis
cliquez sur « OK »
2. Fonctionnement du Statif
2.1 Observation des échantillons aux oculaires
Trois objectifs sont présents sur le SP8: un 20X à
sec (ON 0,5), un 40X à immersion à huile (ON 1,3)
et un 63X à immersion à huile (ON 1,4). Choisir
l'un ou l'autre via le logiciel.
Vos lames doivent être propres.
Sur le statif, choisissez le canal que vous souhaitez observer (1)
(attention, 3 cubes sont disponibles pour la visualisation aux
oculaires : Dapi, vert et rouge. Il n'y a pas de cubes pour le
rouge lointain qui n'est pas visible aux yeux puis appuyez sur le
bouton Shutter (2). Le statif bascule automatiquement sur les
oculaires. Si cela n'est pas le cas, appuyez sur le bouton
représentant un œil (3).
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2.2 Contrôles manuels
5
Pour pouvoir voir en transmission, appuyez sur le bouton TL/RL (3)
à gauche du statif. L'intensité lumineuse peut être réglée (2), ainsi
que l'ouverture du diaphragme d'ouverture (1) et du diaphragme de
champ (4). Vis micrométrique (5).
Pour vous déplacer en x, y et z, utilisez le
joystick.
1: Déplacement en y
2: Déplacement en x
3: Déplacement en z (mise au point)
4: Réglage de la vitesse de déplacement en z
5: Réglage de la vitesse de déplacement en xy.
2.3 Réglage de Koehler
Le réglage de Koehler doit être fait lorsque l'on souhaite faire de la transmission afin d'obtenir une
image de meilleure qualité.
Il est à régler sur le plus faible grossissement puis à re-régler à chaque changement d'objectif.
En mode oculaire :
• Faire la mise au point sur
l'échantillon
• Fermer à fond (1) le
diaphragme de champ
• Régler (2) la hauteur du
bloc condenseur jusqu'à
voir les bords du
diaphragme net
• A l'aide des vis (3)
positionnées en (4),
centrer le diaphragme.
• Elargir le diaphragme
juste assez pour faire
disparaître les bords (1)
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3. Présentation du software
L'interface du programme LasX se divise en deux parties principales :
- A: Réglages des paramètres d'acquisition
- B: Affichage de l'image
A B
3.1 Présentation du menu Acquisition
A. Différents modes d’acquisition peuvent y être choisis (XYZ, XYT,
A 1 XYλ…). Le mode par défaut est XYZ
Icône d’activation du mode séquentiel (1) pour acquérir plusieurs couleurs.
B. Réglage des paramètres de l’image (taille de l’image en pixels, vitesse
d’acquisition en Hz (400 Hz = 400 lignes par seconde), facteur de zoom, type
de moyennage appliqué).
B C. Réglages des conditions d’acquisition d’une série Z
D. Séquences : choix de la séquence pré-configurée
3.2 Charger une configuration
Dans Acquisition Mode (A), cliquez sur le bouton Seq (1).
Un nouvel onglet apparaît : Sequential Scan (D). Cliquez sur le bouton Load
C (2) et choisissez la configuration qui vous convient. Il y a alors une séquence
par canal.
Choisir le scan Between Lines permettra de voir simultanément tous les
canaux
Le basculement d'un canal à un autre pendant le balayage se fait toutes les
2 lignes lorsque le scan se fait en Between Line et tous les frames en Between
Frame.
D Attention : En Live en Between Line on peut voir et donc régler tous les
canaux en même temps alors qu'en Between Frames, on ne voit qu'un seul
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canal à la fois.
3.3 Régler les paramètres pour l'acquisition
Allez dans Acquisition Mode.
Taille de l'image : Choisissez la taille de votre image dans Format (classiquement on fait du 512 x
512 pixels).
En cliquant sur le bouton Optimize xy format, on obtient la dimension en pixels idéale de l'image. Il
ne sert à rien d'avoir un nombre de pixels plus important que le nombre optimal (cf échantillonnage
spatial). Si un zoom est appliqué, il faut alors de nouveau cliquer sur ce bouton afin d'avoir la taille
optimale de l'image.
Vitesse d'acquisition : Plus la vitesse d'acquisition de l'image est lente, meilleur sera le rapport
signal/ bruit. La vitesse habituellement choisie est de 600 Hz.
Moyennage : Si le rapport signal/bruit n'est pas suffisant, on peut faire une moyenne. Avec un
échantillon vivant, le mode ligne est le plus approprié.
Direction : Afin de gagner du temps, acquérir l'image en balayage bidirectionnel en cliquant sur le
bouton Bidirectional z.
3.4 Acquisition de l'image
Pour chaque canal, les réglages doivent être faits afin que l'intensité des pixels les plus brillants soit
la plus proche possible de la saturation sans l'atteindre. Pour cela, il faut jouer sur le gain du
détecteur et la puissance du laser.
Démarrez le scan en cliquant sur Live et se mettre en fausse couleur (les pixels saturés
apparaissent en bleu et les pixels à zéro sont en vert) en cliquant sur le bouton en haut à
gauche de l'image. Afin d'obtenir une bonne image, les pixels les brillants doivent être proches de la
saturation sans l'atteindre. Pour cela, il faut régler le gain du détecteur et la puissance du laser
correspondant.
3.4.1 Réglage du Gain
Pour régler le gain du détecteur, jouez
avec le bouton gauche de la barre de
boutons de réglage. Jusqu'à 100% il n'y a
pas d'ajout de bruit électronique. Pour sélectionner le détecteur à
modifier, cliquez sur l'image correspondante (elle doit être entourée de
pointillés blancs).
3.4.2 Réglage de la puissance laser :
La puissance du laser se règle dans le logiciel. Pour sélectionner le
laser à modifier, il faut sélectionner la séquence correspondante dans
l’onglet Sequential Scan.
Faire la même chose pour tous les autres canaux.
Une fois les réglages réalisés, cliquez sur le bouton Start pour acquérir une image.
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3.4.3 Comparaison d’intensité
Si vous souhaitez faire une étude d'intensité sur vos images, faites d'abord vos réglages (laser, gain)
sur l'échantillon le plus brillant et gardez ces paramètres pour acquérir les images suivantes. Ainsi,
les autres échantillons ne seront pas saturés. De même, les améliorations d'images (contraste par
exemple) doivent d'abord être faites sur l'image la plus brillante puis appliquer de la
même manière sur les autres images.
3.4.4 Acquérir une image en transmission
Pour acquérir en transmission, sélectionnez une configuration avec Trans.
On peut voir que dans une séquence le PMT de la transmission est activé.
La transmission est acquise simultanément avec un canal fluo: la source d'excitation
(le laser) est donc commune et sa valeur est la même pour le canal fluo et pour le canal de la
transmission. Il faut donc en premier régler la puissance laser sur la fluorescence et ensuite pour
régler la transmission jouer uniquement sur le gain du PMT de la transmission. Avec la barre de
boutons de réglage, réglez le gain du PMT de la transmission.
4. Zoom
Vous pouvez directement zoomer sur la zone de votre choix en arrêtant le
LIVE puis en cliquant sur Zoom in dans l'onglet XY. Encadrez ensuite sur
l'image la zone à zoomer puis cliquer sur Start pour acquérir.
Dans l'onglet XY, pouvez voir et changer vos paramètres de zoom dans Zoom
factor. Il est aussi possible de dézoomer jusqu'à un facteur de 0,75 pour imager
une plus grande surface.
5. Echantillonnage spatial
0.4
- La résolution dépend de l’objectif : r =
- La taille du pixel est ajustable. Selon le théorème de Nyquist, l’échantillonnage idéal doit être de :
r
2.3
Objectif 20X 40X 63X
ON 0.8 1.3 1.4
r (à 543 nm) 271.5 nm 167 nm 155 nm
Echantillonnage 118 nm 72.6 nm 67.5 nm
idéal
Taille du pixel 1,14 µm 361 nm
(512x512)
Zoom =1
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8
Taille du pixel 379 nm 120nm
(512x512)
Zoom=3
Taille du pixel 90 nm
(512x512)
Zoom=4
Taille du pixel 189 nm
(512x512)
Zoom=6
Taille du pixel 568 nm 180 nm
(1024x1024)
Zoom=1
Taille du pixel 284 nm 90 nm
(1024x1024)
Zoom=2
Taille du pixel 189 nm 60 nm
(1024x1024)
Zoom=3
- Si on sur-échantillonne trop, on use le fluorophore et on bleache, sans gagner en résolution qui est
limitée par l’objectif. Quand je zoome, je sur-échantillonne.
- Si on sous-échantillonne, on perd en résolution.
Avec l'objectif 20X et en 512x512 il ne faut pas dépasser le zoom de 6.
Avec l'objectif 63X et en 512x512 il ne faut pas dépasser le zoom de 4.
6. Acquérir une pile d'images en z
Allez dans l'onglet Z-stack. On va ici fixer les limites haute et basse
de la pile.
Cliquez sur Live, déplacez-vous en Z à l'aide de la vis micrométrique
et déterminez le premier et le dernier plan en cliquant sur Begin et
End. Vous pouvez déterminez vous-même le nombre d'images à
acquérir ou l'intervalle entre chaque image. Pour avoir un intervalle
entre deux images qui respecte le théorème de Nyquist, sélectionnez
System optimized.
Afin de ne pas avoir de saturation, se mettre en fausse couleur et
chercher pour chaque canal séparément en navigant en z s'il y a un
plan plus lumineux que celui sur lequel les réglages ont été
précédemment faits. Cliquez sur l’icône : START.
Si vous ne souhaitez plus réaliser de Z-stack mais seulement acquérir
une image dans un seul plan, cliquez sur le bouton représentant une
poubelle. Cela effacera les bornes de votre Z-stack.
Le bouton Capture Image permet aussi d'acquérir une image dans le
plan actuel si un Z-stack est actif.
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6.1 Z-Compensation
Cette fonction de compensation peut être utilisée lors d’une acquisition d’un Z-Stack pour
compenser les variations de brillance dans l’épaisseur de l’échantillon.
Ceci peut se faire de 2 façons :
- via l’intensité du laser (AOTF/EOM
Gain/ MP Attenuation)
- via le Detector Gain
Ces méthodes peuvent être combinées l’une avec
l’autre.
1 [begin] et 2 [end] correspondent aux
bornes du Z-Stack quand « Z-compensation » a été
choisi.
3 Les lignes horizontales représentent les
positions du Z-stack qui serviront de points de
support pour la Z- compensation.
4 La ligne en pointillée indique la position
Z en cours
6.2 Z-Compensation durant une acquisition séquentielle
3 6.2.1 Seq 2 canaux :
1) Définir les bornes de la pile
d’images :
4
2) Définir le mode par lequel la
2 séquence doit être effectuée :
Between Lines, Between Frames
ou Between Stacks. (1).
3) Cliquer « Live » puis sur « Z-
compensation ». (2).
1
4) - Sélectionner le type de
compensation souhaitée dans la
boite de dialogue de la Z-
compensation (3) AOTF/EOM Gain soit Detector Gain ou
les deux combinés indispensable si l’on veut l’acquisition de
la Transmission et donc régler le gain du T-PMT.
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Nota Bene : Dans le mode « Between Lines sequential scan mode », la compensation peut
uniquement se faire en utilisant AOTF/EOM Gain. Il est préférable d’utiliser la séquence « Between
Stack ».
5) - Une fenêtre informe l’utilisateur que le mode de réglage de la Z-compensation est valide pour
toutes les séquences. Cliquer OK pour confirmer. (4).
6) – Pour chaque séquence (canal) appliquer le % puissance laser en fonction de la position Z et
cliquer sur « Add ». Faire cette manip autant que nécessaire. Puis passer à la 2e séquence.
7) – cliquer : START pour commencer l’acquisition séquentielle du Z-stack avec la compensation
linéaire.
6.2.2 Seq 3/4 canaux :
A partir de 3 canaux (1), la
séquence de compensation
peut uniquement se faire
dans le mode « Between
Lines » (2).
3 La Z-compensation ne
pourra alors se faire que par
l’AOTF/EOM Gain (3).
1
2 4
1. - Durant le Live, configurer les réglages pour la
première séquence (premier canal).
2. - Cliquer sur la position de départ du Z [Begin] dans la
boite de dialogue de la Z-compensation et appliquer cette
position en cliquant Move To. Ensuite, ajuster le %
puissance laser pour cette position.
Cliquer « Add » pour appliquer les valeurs à cette
position.
3. - Suivre la même procédure pour la position [End].
4. - Par la suite, des positions supplémentaires au sein du
Z-Stack peuvent être définies pour compensation en
traversant l’échantillon et en ajoutant les valeurs de %
modifiées pour la position correspondante en cliquant «
Add » ;
5. – Rester en mode « LIVE » et passer sur la seconde
séquence pour le deuxième canal.
6. - Assurez-vous que Seq.2 est actif dans la boite de dialogue Sequential Scan (bouton est rouge)
7. - Comme décrit à l’étape 2, configurez maintenant les réglages correspondant à la position
[Begin] et à celle de [End] (et également pour les positions intermédiaires) pour la Z-
compensation. Durant cette procédure, soyez sûr que vous avez adapté les valeurs introduites depuis
la seq.1 aux critères pour la 2e séquence.
8. - Les positions intermédiaires pour la compensation peuvent être définies indépendamment pour
chaque séquence.
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9. - Suivre la même procédure pour les séquences supplémentaires.
10. - Une fois tous les réglages faits, cliquer START pour commencer l’acquisition séquentielle du
Z-stack avec la compensation linéaire.
7. Tiles Scan
Il faut initialiser la platine au démarrage du logiciel LAS X 1
pour pouvoir activer les icônes.
7.1 Mark end Find
(Multipositions) (1)
1- Dans l’onglet Mark and Find experiment, définir les
positions x,y,z avec l’icône « Mark pos » (2), cliquez +
2- Pour faire du Multi pos + Z stacks :
a) Même Z-stack pour toutes les positions : cocher « same stack
for all » (3) qui permet de garder la même épaisseur du stack
pour toutes les positions choisies.
L’épaisseur du stack peut être définie de 2 manières :
- en « Begin/End »
- en « Z around current » : définir l’intervalle
b) Pour faire des Z-stacks différents sur chaque position :
- décocher « same stack for all »
- choisir les bornes “Begin/End” sur une position et
cliquer sur “redefine stack”.
2
- aller sur la position suivante et redéfinir « Begin/End » et
cliquer sur « redefine stack ».
7.2 Pour faire de la mosaïque
(Tile Scan) (4)
4 - définir le nombre de tuiles (2x2
ou 2x3 etc…)
- activer « auto stitching » et
« smooth » (5) 3
5
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8. Fin de manip
8.1 Sauvegarde
Allez dans Experiments. Les images ont été automatiquement placées dans une expérience
(Project). Elles peuvent être renommées en faisant un clic droit dessus puis Rename. Puis sauvez
l'Experiment en faisant un clic droit puis Save. Enregistrez le « project » dans le dossier « données
utilisateurs » qui se trouve sur le bureau : >>> CPTP N° équipe.
Toute image acquise sur le SP8 doit être sauvegardée en format .lif afin de conserver les méta
données. Vous pouvez ensuite sauvegarder en .tif mais pas en Jpeg (qui compresse donc perd des
informations).
8.2 Extinction du système
Lorsque vous êtes de dernier utilisateur de la journée :
1- Nettoyer l’objectif 63X ou 40X à huile avec un Kimtech et de l’alcool
2- Baisser la tourelle d’objectifs
3- Eteindre les lasers dans le logiciel : mettre sur « OFF » chaque laser allumé
A) Cliquer sur le + pour ouvrir la fenêtre des lasers
B) Mettre chaque laser sur « OFF »
A
B
4- Sauvegarder vos acquisitions
5- Fermer le logiciel
NE PAS ETEINDRE L’ORDINATEUR
6- Sous la table, tourner la clé vers la gauche (le voyant lumineux orange s’éteint)
Mettre les 2 interrupteurs sur « OFF » : Laser Power et Scanner Power
7- Eteindre le contrôleur CTR 6500
8- Eteindre la lampe à fluorescence
9- Mettre la housse de protection sur le microscope
10- Bien refermer la porte de la pièce en partant
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Rappels
Nettoyez les objectifs à immersion utilisés avec un Kimtech et de l'alcool à la fin de la séance.
Récupérez le plus rapidement possible les données après acquisitions (nettoyage mensuel de
l'ordinateur).
Si un problème se produit, remplir les fiches « anomalie » présentes à côté de l'ordinateur et
signaler le problème à un responsable.
9. Récapitulatif des séquences d’utilisation du SP8
1- Allumer le système : Eteindre PC (pas forcément nécessaire), puis allumer selon la
séquence: 1) lampe fluo, 2) contrôleur, 3) banc lasers, 4) allumer PC, 5) ouvrir le
logiciel LASX : 6) onglet Z-Stack : choisir « Z-Wide », 7) choisir l’objectif (20X ou
63X). Voir fiche sur le mur.
2- Positionner son échantillon sur le porte-objet de la platine du microscope et
observer aux oculaires
3- Acquisition de son (ses) échantillon(s) via Confocal : charger une configuration ou
rappeler une configuration depuis une acquisition précédente.
Cocher l’onglet « Bidirectionnel »
Faire les réglages : plan focal/ saturation ;
Régler paramètres d’acquisition : format image ; scan speed ; moyennage
4- Dans l’onglet « Project » : donner un nom à l’experiment = project.
Nommer ses différentes acquisitions.
5- Sauvegarder l’ « Experiment » = « Project » dans le fichier « Données
utilisateurs »
6- fin de manip : nettoyer l’objectif, abaisser la tourelle avec les objectifs et
éventuellement éteindre le système. Voir fiche sur le mur.
7- Noter son passage sur le registre
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05. 31. 54. 79. 01Vous pouvez aussi lire
