Test MSI Recommandations - Janick SELVES Département d'Anatomie Pathologique & Plateforme de Génétique des tumeurs Toulouse - Onco-Occitanie
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Réunion Régionale de Biologie Moléculaire
Montpellier, 21 Novembre 2019
Test MSI
Recommandations
Janick SELVES
Département d’Anatomie Pathologique &
Plateforme de Génétique des tumeurs
Toulouse
Système MMR = MisMatch Repair
Fidélité lors de la réplication de l’ADN:
essentielle ++
Système MMR = réparation
des mésappariements de
l’ADN
Mésappariements :
microsatellites
4 protéines
fonctionnant en
hétérodimères :
• MSH2/MSH6
• PMS2/MLH1
MSI: phénotype hypermuté: >10 mutations /Mb
The cancer Genome Atlas Network Nature 2012
Déficience du système MMR
Genetic Somatic
1 constitutive MMR
• Deux causes mutation
• Génétique Lynch Sporadic
• Somatique Syndrome cancer
• Déficit MMR + 1 somatic MMR 2 somatic MMR alterations
• Perte d’expression
alteration (mainly MLH1 promotor
methylation)
protéines MMR
• Instabilité
microsatellitaire dMMR
• Charge mutationnelle tumor
élevé (TMB) Loss of MMR protein
expression
Microsatellite instability
High mutational burden
Le test MMR somatique
• Terminologie: test MSI /Test RER/test MMR
• Fonctionnalité des protéines MMR (MisMatch
Repair) dans la tumeur: test MMR somatique
– Test MSI: instabilité microsatellitaire (génome
tumoral)
• Tumeur MSI/MSS
– IHC MMR: Immunohistochimie des protéines MMR:
perte d’expression
• Tumeur dMMR (deficient) /tumeur pMMR (proficient)
• Tumeur dMMR/MSI ou tumeur pMMR/MSS
MSI: Microsatellite Instability
RER: Replication ERror
Les indications du test MMR
1. Pré-criblage du syndrome de Lynch
2. Facteur pronostique (cancer colo-rectal, cancer gastrique,
cancer de l’endomètre)
3. Biomarqueur immunothérapie (axe PD1/PDL1)
TNCD (http://www.tncd.org)
Tourgeron et al, Hepato-Gastro, 2015
Luchini C et al, Annals of Oncology 2019
Le syndrome de Lynch: gènes MLH1, MSH2, MSH6, PMS2
Tumeurs du spectre de Lynch: Risque élevé de cancer
Spectre tumoral HNPCC Spectre tumoral HNPCC
« étroit » « large»
Côlon Intestin grêle
Endomètre Estomac
Ovaires Voies biliaires
Pancréas
Voies urinaires excrétrices
Glioblastomes…
Les variantes du syndrome de Lynch
Syndrome de Turcot Syndrome de Muirr Torre
Côlon Tumeur cutanées sébacées
Tumeurs SNC (glioblastome,
médulloblastome, épendymome)
Kérato-acanthomes
Tumeurs viscérales profondes
(côlon , endomètre, tractus digestif, voies
urinaires, ..)
Dunlop 1997
Hampel 2005
Eriscam, 2010
1- Pré-criblage S de Lynch
• Recommandations INCa:
– CCR < 60 ans, K endomètre < 50 ans
– CCR ou KE + antécédent personnel ou familial 1er degré
tumeur du spectre de Lynch
• Recommandations européennes*
– CCR ou K endomètre < 70 ans,
– CCR ou KE + antécédent personnel ou familial 1er degré
tumeur du spectre de Lynch
• Screening universel
– Tous les patients avec CCR (TNCD)
TNCD (http://www.tncd.org)
* À condition de faire méthylation MLH1
Guide de réalisation des tests somatiques pour le dépistage du Lynch INCa , 2016
2- Facteur pronostique: CCR
Cancer non métastatique: MSI bon pronostic
• Utile pour adapter le traitement:
– Cancer pT1 sur polype réséqué par endoscopie
– Grade: un de facteurs prédictifs de rechute*
– Pour déterminer le grade des cancers peu différencié et mucineux
– Cancer stade II avec facteur de mauvais pronostic** :
chimiothérapie adjuvante possible
– Si tumeur dMMR : pas de chimiothérapie adjuvante
– Si tumeur pMMR: chimiothérapie adjuvante
Cancer métastatique: mauvais pronostic
*Selves J et al, Ann Pathol 2018
** (pT4, tumeur peu différenciée, emboles vasculaires, < 12 ganglions analysés, TNCD (http://www.tncd.org)
infiltration péri-nerveuse, tumeur peu différenciée, perforation, occclusion révélatrice) Tougeron, J Natl Cancer Inst. 2016
2-Facteur pronostique:
cancer gastrique
• Cancer localisé pour adapter le traitement
péri-opératoire (TNCD 2017)
– Car très bon pronostic
– Pas de chimiothérapie péri-opératoire si MSI+
TNCD (http://www.tncd.org)2- Facteur pronostique: cancer de
l’endomètre
Sous-groupe moléculaire de bon Cancer localisé pour adapter le
pronostic traitement car très bon pronostic ?
– Pas de curage ganglionnaire si
MSI+?
– Traitement adjuvant cancer de
risque intermédiaire/élevé?
En attente de validation
TCGA, Nature 20133- MSI: Facteur prédictif de réponse
aux anti-PD1
• MSI: marqueur de prédiction aux anti-PD1 (Le et al, 2015)
Tumeur MSS:
pas de réponse à l’anti-PD1
Tumeur MSI:
réponse tumorale aux anti-PD1
Cancer non colo-rectal : endomètre, estomac, ampoule et intestin grêleImmunothérapie des tumeurs dMMR
métastatiques
• MSI: 1er marqueur agnostique
– AMM aux USA (2017) pour les tumeurs dMMR
réfractaire
– En attente pour la France
• En France:
– Traitement possible des patients avec un cancer
dMMR, mais uniquement sur dossier argumenté
compte-tenu du coût
– Essais thérapeutiques +++
– Essai Acsé (mai 2017)*: traitement par nivolumab
(anti-PD-1) tous types cancers dMMR sauf CCR
*www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Essais-cliniques-et-therapies-cibleesQuel test réaliser: IHC ou Biologie moléculaire ?
L’immunohistochimie MMR
4 protéines MMR
(MLH1,PMS2,MSH2,MSH6)L’immunohistochimie MMR
– Les profils d’expression possibles:
Protéine
• Maintien d’expression des 4 protéines (pMMR) (=normal)
• Perte d’expression de protéines (dMMR) :
– MLH1 et PMS2
– MSH6 et MSH2
– Isolée PMS2
– Isolée MSH6
• Perte d’expression atypique dMMR)
– Perte d’expression 2 protéines (≠ hétérodimères fonctionnels),
perte d’expression de 3 ou 4 protéines, expression hétérogène
(sous-clonale)
• Expression équivoque
• Non analysablePerte d’expression (dMMR) Perte d’expression simultanée
hétérodimère fonctionnel MLH1 / PMS2
Protéine
Anti MLH1 Anti MSH2
Anti PMS2 Anti MSH6Expression non analysable: préanalytique défectueux (sous-fixation) MLH1 PMS2 MSH2 MSH6
Marquage équivoque
MLH1
X5 X20
X5 PMS2 X20Marquage hétérogène
Une zone avec perte
de marquage
franche , abrupte
(sous-clone)
= perte d’expression
MLH1/PMS2 MSH2/MSH6Immunohistochimie
• Avantages : • Inconvénients :
• Facile, rapide, • “Faux-positifs”(fausse perte
• Peu coûteux, acte CCAM (68 €) d’expression) :
• Faisable dans tous les labos • phase pré-analytique défecteuse
• mauvais calibrage technique
• Possible si peu de cellules
tumorales • “Faux-négatif” (pas de perte
d’expression) rares
• Applicable tout type tumoral
• mutation faux-sens gene MMR
• Au diagnostic (« reflex testing »)
• Reflex Testing : • Calibration technique
• Cancer colo-rectal, gastric cancer,
cancer de l’endomètre, tumeurs • Formation à la lecture et à
sébacées l’interpretation ++++
www.nordiqc.orgLe test MSI en biologie
moléculairePrincipes
• Technique de référence: MSI-PCR
– Analyse de taille de fragments (séquences microsatellitaires)
– Allèles mutés = instables
• Panels « consensus » de microsatellites
– Panel Bethesda, 1998:
• 2 marqueurs mononucléotidiques (BAT25 et BAT26) + 3 marqueurs di-
nucléotidiques (D5S345, ..)
• comparaison avec ADN normal nécessaire
– Panel NCI, 2004 (« Pentaplex -PCR»)
• 5 parmi les 7 marqueurs mononucléotidiques suivants : Bat25, Bat26, Bat40,
NR21, NR22, NR24 et NR27
• Kit commercial (Promega®,Bat25, Bat26, NR21, NR22, et Mono 27) ou technique maison si validé
par CQE
• Microsatellites quasi-monomorphes : sans comparaison avec ADN normal
• > 20 % de cellules tumorales dans l’échantillon extrait*
– Risque de faux négatif
Boland et al, Cancer Reseach 1998
Surawaera, Gastroenterology 2002
Umar et al , J Nat Cancer institut, 20041- Macrodissection
2- Extraction ADN tumoral
3-Génotypage (analyse de fragment)
Électrophorèse capillaire
Pentaplex PCR avec 5 microsatellites monomorphes *
NR21 Bat 26 Bat 25 NR24 NR22 NR21 Bat 26 Bat 25 NR24 NR22
MSS: 5/5 microsatellites stables MSI: si ≥2 marqueurs instables
Surawaera et al, 2002
*5 parmi les 7 marqueurs mononucléotidiques suivants : Bat25, Bat26, Bat40, NR21, NR22, NR24 et NR27
Goel et al, PLOS One 2010Règles d’interprétation d’un statut
microsatellitaire
• Mentionner la technique utilisée, la qualité de l’échantillon
• Ne pas faire si pas assez de cellules tumorales (< 20%)
• Contrôle qualité (Gentiss, …)
• Règles d’interprétation:
Pas d’instabilité microsatellitaire (0 /5 microsatellites)
Instabilité microsatellitaire ( au moins 2 instables /5 microsatellites)
Si un seul microsatellite instable: faire comparaison avec tissu normal
– Si polymorphisme prouvé: pas d’instabilité
– Si pas d’analyse tissu normal: comparaison immunohistochimie (et contexte
clinique +++)
– Si confirmation d’un seul microsatellite instable: MSI-low
*Danjoux, Selves et al, 2006Interprétation parfois difficile
Surtout: Cancers endomètre, urothélial Piège : le polymorphisme !
NR21 Bat 25 NR24 tumeur
normal
tumeur
normal
Profil d’instabilité difficile à analyser
NR21 et Bat 26: polymorphes (patient malgache ): MSS
Recommandation : comparer avec ADN normalInstabilité microsatellitaire (MSI) par MSI-PCR
• Avantages : • Inconvénients :
– Robuste, reproductible – Peut-être difficile à
– Bonne sensibilité pour les interpréter pour cancers
cancers coliques non colo-rectaux
• Moins bonne pour autre – Au moins 20 % de
type tumoral (endomètre) cellules tumorales dans
• Mauvaise pour gliomes et l’échantillon (risque de
tumeur sébacées faux-négatif)
– ADN disponible pour – Possible faux-positifs
analyses moléculaires avec Pentaplex-PCR :
supplémentaires polymorphisms (rares)Les alternatives
• Test Idylla™:
– Ne nécessite pas de plateau de biologie moléculaire
– 7 marqueurs testés, 3 résultats possibles:
• Stable (MSS) , Instable (MSI) , invalide
– Facile d’utilisation
– Bonne sensibilité pour tumeurs coliques et de l’endomètre
– Non validé dans les recommandations
Cartouche à usage unique
1: ordinateur de contrôle
2: cartouche à usage unique
3 : module d’analyse
Rapport généréLes alternatives
• HSP 110
– Un seul marqueur : homopolymère T17 de HSP110
– Technique: analyse de fragment /électrophorèse capillaire
• Un peu difficile à mettre en place
• Analyse un peu complexe
– Plus sensible que la Pentaplex-PCR par Cold PCR
– En cours d’évaluation (tumeurs non colo-rectales ? )
• Autres panels de microsatellites
• Panels de courtes répétitions mononucléotidiques
(Short mononucleotides repeats):
– Moins d’erreurs de PCR
– A évaluer sur différents types tumoraux
Buhard O , J Med Genet 2016
How-Kit A, Duval A , Hum Mutat 2017
Galon R, Hum Mutat 2018Les alternatives
• NGS
– Nombre illimité de marqueurs (mononucleotides repeats, 2
to 6 pb, composite microsatellites )
• Quels sont les meilleurs marqueurs ? Par type tumoral?
– Apport par rapport aux autres techniques: faible ?
– Cout +++++
– Analyse de la charge mutationnelle (TMB)
Buhard O , J Med Genet 2016
How-Kit A, Duval A , Hum Mutat 2017
Galon R, Hum Mutat 2018Détection MSI par NGS
Salipante, 2014 Bonneville et al 2017 Middha et al, 2017 Latham et al, 2019
Source UW-Oncoplex Coloseq TCGA MSK-IMPACT
Méthode MSI-Plus mSINGS Mantis MSI Sensor MSI Sensor
Technique Panel (0,85 Panel Exome Exome Panel de gènes (468) Panel de gènes (468)
MB) (44MB)
Nombre de microsatellites 15 146 2957 2350 1000
Nombre de tumeurs 324 324 324 11 139 12 888 15 045
Stade Tous stades Stade avancé Tous stades
Types tumoraux CCR CCR CCR 39 66 50
Taux MSI 3,8 % 1,8 % 2,2 %
Types tumeur > 1 % MSI 10 types de tumeurs 10 types de tumeurs 18 types de tumeurs
Mésothéliome: 4% Grêle: 16 % Grêle: 30 %
Col: 2 % Endomètre: 16 % Endomètre: 22%
Corticosurénalome: 2% CCR: 8 % Corticosurén: 45 %
Mésothéliome: 4 %
Concordance Pentaplex et 100 % 96 % 100 % 99,4 % ( colon et 98,2 % avec IHC
IHC endomètre)Place du NGS dans le diagnostic de routine pour MSI • Inclure le MSI dans les panels de biomarqueurs NGS utilisés en routine • EX: panel 35 genes (RAS, EGRF, KIT, …) + 5 microsatellites panel NCI + HSP110 – Nécessite une analyse bioinfo dédiée
Quelle analyse réaliser ? Quelle hiérarchie des techniques ?
Plusieurs facteurs
Indication de l’analyse
– Recommandations existantes:
1. Lynch syndrome
2. Immunothérapie
– Pas de recommandations pour la stratification
pronostique des cancers (colo-rectal, estomac,
endomètre)
Type tumoral
Qualité de l’échantillon1- Recommandations du test MMR pour
le syndrome de Lynch
Recommandations INCa (2016)
• Cancer colo-rectal:
– Test 1er intention: IHC des 4 protéines ou test MSI
– Si le premier test est positif ou pour tout résultat difficile à analyser:
compléter par le 2ème test (IHC ou bio mol)
• Cancer de l’endomètre et autres types de cancer ou si demande
oncogénétique:
– Faire d’emblée les deux tests MSI + IHC
– possible IHC en 1er intention
Recommandations européennes
– Côlon, endomètre
– Immunohistochimie avec les 4 anticorps * ou biologie moléculaire
Screening universel par immunohistochimie
– Côlon
– Utiliser les 4 anticorps
Vasen HF et al, GUT 2013
Weissman SM et al, J Genet Couns 2012
* A condition que le test de méthylation puisse être réalisé Sepulveda , Arch Pathol Lab Med 20172- Recommandations ESMO pour
l’immunothérapie des cancers1
• 1er intention: Immunohistochimie avec les 4
anticorps MLH1, PMS2, MSH2 and MSH6
– Pour toutes les tumeurs du spectre de Lynch: côlon,
rectum, gastrique, endomètre, intestin grêle, voies
urinaires, ovaires, glioblastome, tumeurs sébacée
• Pentaplex- PCR:
– 2d intention pour tout marquage IHC équivoque ou pour
tous les cas avec perte isolée MSH6 or PMS2.
• Eligibilité à l’immunothérapie :
– dMMR en IHC et MSI en biologie moléculaire1,2
1Luchini et al, Annals of Oncology, 2019
2Cohen et al, JAMA Oncol 2018Particularités du test MMR/MSI en
fonction du type tumoral
• Cancer colo-rectal:
– Très bonne concordance IHC /Pentaplex-PCR2: 99%
• Cancer endomètre:
– IHC1 : expression équivoque fréquente (MSH6 et MLH1)
• apprentissage de lecture ++
– Pentaplex-PCR : interprétation parfois difficile (comparer avec
ADN normal)
– Bonne concordance IHC / Pentaplex-PCR5: 6 % de cas ambigu
• Cancers digestifs 3,4 (estomac, œsophage, grêle, voies
biliaires, …):
– Peu de données littérature, idem colorectal ?
– Pancréas : IHC plus sensible que MSI-PCR2
1Sari et al , Am J Surg Pathol 2019
2 Selves et al, ECP 2019
3Lupinacci RM et al, Gatroenterology 2018
4Bae YS et al, Gut Liver 2015
5 Stello el al, Annals of Oncology 2017Particularités du test MMR/MSI en
fonction du type tumoral
• Autres cancers (faible prévalence de MSI)
– Peu de données de la littérature
– IHC : détecte > 98 % des cas MSI/Lynch1
• Etude NGS pan-Cancer(50 types tumoraux, > 14 000
cancers )
– Pattern MSI spécifique du type de cancer ?
• Prostate2: MSI-Plus > Pentaplex -PCR
– Pentaplex-PCR :
• Peu sensible dans glioblastome3 : faire IHC seulement
• Peu sensible dans les tumeurs sébacées 4 1LathamA et al, JCO 2018
2Hemplemann et al, 2018
3 ACSéJ
4Jessup C et al, Human Pathol 2016Quand prévoir une consultation
d’oncogénétique ?MSI et Lynch
• 16 % à 18 % des cas MSI (pan-cancer) sont
des S des Lynch :
– Tumeurs du spectre de Lynch
– Tumeurs « rares » : prostate, tumeurs germinales,
corticosurrénalome, mésothéliome, sarcome
• Marqueurs moléculaires des cancers
sporadiques
– Méthylation promoteur MLH1
– Mutation BRAF (CCR)Stratégie diagnostique du S de Lynch
Tumeur MMR anormal (dMMR)
Perte d’expression MSH2/MSH6 Perte d’expression MLH1 et PMS2
Perte d’expression isolée MSH6
Perte d’expression isolée PMS2
Méthylation MLH1
Mutation BRAF *
non oui
Evocateur d’un S de Lynch Cancer sporadique
Consultation d’oncogénétique
Guide de réalisation des tests somatiques pour le dépistage du Lynch INCa , 2016
*: pour les cancers du colon seulement1
Test MMR: à retenir
• Extension des indications du test MMR: pronostic, immunothérapie
• IHC méthode efficace pour le test MMR quelque soit le type
tumoral et l’indication
• avec les 4 protéines MLH1,PMS2,MSH6 and MSH2
• Nécessite un accès à une plateforme moléculaire +++
• Quel laboratoire de bio mol ?
• Expertise test MSI
• Avec 1 pathologiste expert
• Avec compétences sur les tests moléculaires supplémentaires2
Test MMR: à retenir
• Tous les cas dMMR en IHC doivent être contrôlés par la biologie
moléculaire avant traitement
• Test MSI:
• MSI-PCR (Pentaplex-PCR): test validé
• Apport de la technique NGS avec nouveaux panels ?
• Nécessite de mettre en place un workflow efficace entre
cliniciens/pathologistes/plateformes de génétique des
tumeurs/généticiensTest MMR
Immunothérapie, test universel, CCR Stade II, K gastrique
localisé, K endomètre
1er intention: IHC (ou MSI) IHC et MSI si demande oncogénétique
pMMR dMMR Statut MMR difficile à déterminer
Confirmation par la 2ème 2ème technique (MSI ou IHC)
technique (MSI ou IHC) Plateforme avec expertise
*Perte d’expression *Perte d’expression
MSH2/MSH6, PMS2 ou MLH1/PMS2
MSH6 isolé + MSI + MSI
non Méthylation MLH1 oui
Mutation BRAF *
Evocateur d’un S de Lynch *Cancer sporadique
Consultation d’oncogénétique *Eligible ImmunoTRemerciements • Dr Marie Danjoux, Dr Julie Meilleroux, Dr Eliane Mery, Dr Claire Illac, Dr Emilie Tournier, Pr Laurence Lamant… Département Anatomie Pathologique , IUCT- Oncopole, CHU. Toulouse • David Grand, Samira Icher, Solène Evrard, Frédéric Escudié... Plateforme de Génétique des tumeurs. Départment Anatomie Pathologique , IUCT- Oncopole, CHU. Toulouse • Jérôme Solassol, Julie Vendrell, Charles Van Goethem, Montpellier • Pr Rosine Guimbaud, Dr Delphine Bonnet. Service d’oncogénétique. IUCT-Oncopole et CHU, Toulouse • L’ensemble des pathologistes Midi-Pyrénées
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