Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments - Aurélien Maillet NGS ...
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Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing)
dans le management de la sécurité
et de la qualité des aliments
Aurélien Maillet
NGS Industry Manager
Contexte
Pathogènes
Quelle est la source de contamination de mon produit ?
Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou
d’un fournisseur ?
Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon
environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?
Altération/Incident de fabrication
Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?
Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?
Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?
2
Caractérisation et identification
Communauté
Isolat bactérien
microbienne Niveaux
...
Classe
Caractérisation du Ordre Identification
microbiome Famille - MALDI-TOF
- Culture -16S ARNr (500pb-1500pb)
microbiologique Genre - ITS2
NGS
Espèce
Caractérisation niveau 1
Sérotype - Molecular subtyping / Ribotyping
(Riboprinter®)
- MLST
Type - PFGE
Souche Caractérisation niveau 2
NGS
Virulome
Résistome
3
Next Generation Sequencing (NGS)
"Next generation sequencing"
Plateformes de séquençages développées après 2005
Des millions de brins d’ ADN séquencés à
haut débit en in 1 seule analyse
Source : http://www.nature.com/nrg/journal/v11/n1/abs/nrg2626.html, 4
Des technologies de plus en plus
utilisées …
ILSI Europe Food Safety Task Force (Nestlé, Unilever, Mondelez, Arla, Mc Donald’s,
Mérieux NutriSciences ...)
‘Next Generation Sequencing (NGS): Translation into Practice’.
http://ilsi.eu/task-forces/food-safety/microbiological-food-safety/
ISO/TC 34/SC 9 : Microbiology
WG 25 Whole-genome sequencing for typing and genomic
characterization 5
Next Generation Sequencing (NGS)
NGS
Whole Genome
Metabarcoding
Sequencing (WGS)
Communauté
Isolat bactérien
microbienne
6
SOURCE : ACTEMIUM, SCIENCE PHOTO LIBRARY, ISTEMA-HUMANO.COM.AR
NGS pour l’Industrie
Agroalimentaire
Echantillon
alimentaire ou
environnemental
Isolat
Communauté microbienne
bactérien
Extraction de l’ADN
ADN ADN
Séquençage PCR
du génome
complet Metabarcoding
(WGS)
Analyse des séquences par Bioinformatique
Caractérisation du génome Composition
Typage isolats bactériens microbienne
7
NGS pour l’Industrie
Agroalimentaire
WGS Metabarcoding
ID & Phylogénie
Diversité Ecosystème
Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370 Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630
8
NGS pour l’Industrie
Agroalimentaire
WGS
ID & Phylogénie
Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370 Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630
9
Whole Genome Sequencing (WGS)
◼ Le Whole Genome Sequencing (WGS) permet d’obtenir la
sequence d’ADN complète d’un génome bactérien en une
seule fois
◼ Détails précis sur les microorganismes : gènes, plasmides,
facteurs de virulence, sérotype, gènes de résistance
(désinfectants, antibiotiques).
◼ Le WGS permet d’évaluer des différences au niveau
nucléotidique
◼ Relations phylogénétiques entre isolats (typage)
◼ Niveau le plus fin de caractérisation bactérienne
Source: Teresa M. Bergholz et al. Applied and Environmental Microbiology 82(3) · November 2015 10
Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370 Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630WGS comment ça marche ?
11WGS pour quoi faire ?
Passé Meilleure connaissances (études rétrospectives)
▪ Base de données d’isolats et de leur historique
(caractérisation précise des évènements passés de
contamination/évolution des différents isolats)
▪Evènement de persistance de pathogènes
Présent Traçabilité et résolution de crises/TIAC
▪ Ingrédient responsable dans une recette complexe
▪ Origine des contaminations
▪ Lien entre TIAC et source alimentaire
Futur Management de la sécurité des aliments
▪ Monitoring des environnements de production
▪ Meilleure prévention des risques bactériens
12WGS Exemple
PERSISTANCE DE LISTERIA CHEZ UN FABRICANT DE LEGUMES
SURGELES
Contrôles positifs redondants dans les produits finis
Destruction de lots/déchets /coûts de production et analyses élevés
Le processus de fabrication est-il maitrisé ?
D’où vient la contamination ?
Utilisation du WGS
Prélèvements produits/Environnement de production
13WGS Exemple
Lm Produit
Lm Trémis
Lm Tapis
Convoyage
Lm Tunnel de
Surgélation
14WGS Exemple
Tour Eiffel
1431 km
1029 km
Colisée
Sagrada Familia 15WGS Exemple
Tour Eiffel Proche
Indistinguable Peu éloigné
Distinguable Lointain
Différente
1431 SNP
1029 SNP
Colisée
Sagrada Familia 16WGS Exemple
Lm Produit
1500 SNP
Lm Trémis
1000 SNP
Lm Tapis
Convoyage
5 SNP
Lm Tunnel de
Surgélation
Indistinguable Distinguable Différente
17WGS Exemple
PERSISTANCE DE LISTERIA CHEZ UN FABRICANT DE LEGUMES
SURGELES
Contrôles positifs redondants dans les produits finis
Destruction de lots/déchets /coûts de production et analyses élevés
WGS :
Identification de la source de contamination
Mesures correctives:
Procédures de nettoyage adaptées
Changement équipements/surfaces
18Contexte
Pathogènes
Quelle est la source de contamination de mon produit ?
Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou
d’un fournisseur ?
Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon
environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?
Altération/Incident de fabrication
Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?
Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?
Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?
19Contexte
Pathogènes
Quelle est la source de contamination de mon produit ?
Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou
d’un fournisseur ?
Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon
environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?
Altération/Incident de fabrication
Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?
Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?
Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?
20NGS pour l’Industrie
Agroalimentaire
Metabarcoding
Diversité Ecosystème
21Metabarcoding
Comment ça marche ?
Matrice Alimentaire
et/ou
Environnementale
Séquençage d’un
gène bactérien
Extraction de universel Composition/
l’ADN bactérien Empreinte bactérienne
des échantillons
22Metabarcoding
Composition bactérienne des
échantillons
Heatmap Barplot
100
Genre 1
Genre 2
10
Genre 3
Relative Abundance (%)
…
1 Genre N
Echantillon 1
…
Echantillon 2
…
…
0.1
0
Source: Mérieux NutriSciences 23Diversité d’échantillons
◼ Environnement de production
◼ Matières premières, Matières en cours de fabrication, Produits finis
◼ Incidents de Fabrication
24
https://www.slideshare.net/yashgajwani1/microbiology-of-milk-59033370 http://canacopegdl.com/images/spoilage/spoilage-14.jpgMetabarcoding Exemple
Mauvaises odeurs J0 J14 J21 J28
Mauvais goût
Réclamations clients
Utilisation du
METABARCODING
Identification de toute la
communauté bactérienne du
produit au cours de sa durée de vie
Identification de la
population d’altération
du produit au cours de
sa durée de vie
Quelle est l’origine de l’altération de mon
produit ?
Source: Mérieux NutriSciences
25
ALTEROBIOMetabarcoding Exemple
Réception/Filletage Traitement Packaging
Echantillons
Environnementaux
Utilisation du
METABARCODING
Identification de toute la
population bactérienne de
l’usine de production
(équipements, surfaces, …)
Comparaison des données
produits/environnement
« Machine Learning »
Source: Mérieux NutriSciences
ALTEROBIO
Knights et al., 2011 26Metabarcoding Exemple
Mauvaises odeurs
Mauvais goût
Réclamations clients
METABARCODING :
Identification de la flore d’altération
Identification de la source de contamination
Mesures correctives:
Procédures de nettoyage plus ciblées
Révision plan de nettoyage/plan de contrôle
ou
Adaptation atmosphère conditionnement/Biopréservation
Source: Mérieux NutriSciences
27
ALTEROBIOTake home messages
WGS Metabarcoding
Investigation pathogènes Investigation flores d’altération/incident de fabrication
Caractérisation isolats Caractérisation du microbiote d’un produit ou d’un
Typage/Résistance stress environnement d’usine
Attribution de source de contamination Compréhension écologie produit/environnement
Meilleure maîtrise process Meilleure maîtrise process Extension durée de vie
28Merci de votre attention
29Typage Bactérien
➢ Comparaisons isolat/isolat pour déterminer leur proximité
Levels
➢ Investigations épidémiologiques ...
Class
Order
Family
➢ Identifications de routes de transmission d’agents infectieux
Genus
Species
?
? Serotype
?
? ???? Type
?
Strain
30Typage Bactérien
◼ Méthodes Phénotypiques
◼ Ex: Sérotypage
Owais et al., 2014
➢ Nécessite un œil
expérimenté
➢ Rapide
➢ Sérums onéreux
➢ Peut être standardisé
➢ Faible pouvoir
discriminant
31Typage Bactérien
◼ Méthodes moléculaires
◼ Ex: MLST
Aanensen DM, Spratt BG (2005) The multilocus sequence typing network: mlst.net Nucleic Acids Res. Jul
32
1;33(Web Server issue):W728-33Typage Bactérien
◼ Méthodes moléculaires
◼ Ex: MLST
➢ Temps d’analyse
pouvant être
importants
➢ Caractérisation précise ➢ Faible pouvoir
discriminant -> 7
➢ Schémas complets pour gènes
un certain nombre
d’espèces bactériennes ➢ Pas disponible pour
toutes les bactéries
33Typage Bactérien
◼ Ex: PFGE
Source : PulseNet CDC
34Typage Bactérien
◼ Ex: PFGE
➢ Pouvoir discriminant ➢ Temps d’analyse importants
important (4 à 5 jours)
➢ Grande résolution ➢ Coûts élevés de mise en
place (équipement, logiciel
➢ Reproductible d’analyse, réactifs)
➢ Applicable à un grand ➢ Nécessite un personnel très
nombre d’espèces qualifié
bactériennes
➢ Biais d’analyses
35Typage Bactérien
◼ Ex: PFGE
Adapté de Tunover et al., 1995 36Quelles analyses ?
wgMLST wgSNP
(hqSNP)-based clustering pipelines
wgMLST wgSNP
(L. monocytogenes) (L. monocytogenes)
4797 loci ≈ 3 000 000 basepairs
37Quelles analyses ?
wgMLST SNP
Polymorphisme de
Uniquement mutation
Unité de mesure gène – plusieurs type
de nucléotide simple
de mutation
Génome de référence
Base de données
Pré-requis complet et de très
génique
bonne qualité
Rapide – ne dépend
Résolution extrême –
Avantages pas de génomes de
méthodes publiées
référence
Base de données Génome de référence
géniques à mettre à – Ressource
jour – Accès aux informatique
Inconvénients
bases de données importante -
difficile – Expertise Expertise
bioinformatique bioinformatique
38Quelles analyses ?
wgMLST wgSNP
(hqSNP)-based clustering pipelines
wgMLST wgSNP
(L. monocytogenes) (L. monocytogenes)
4797 loci ≈ 3 000 000 basepairs
Indistinguable Distinguable Indistinguable Distinguable Différente
39Products shelf life studies
◼ Microbial population shift
Production date Use by Date (UBD) UBD + 10
Lactococcus, Leuconostoc….
Pseudomonas 55%
unclassified
Source: Mérieux NutriSciences 40Etude de Durée de Vie de Produits
◼ Microbial population shift
Production date Use by Date (UBD) UBD + 10
Source: Mérieux NutriSciences 41Food Defect
Coagulated UHT milk
Spoiled Milk Ref
Off odors 100
Other
No culture on petri dishes Unclassified
Cellulomonas
Abondance relative (%)
Dermacoccus
Microbacterium 10
Propionibacterium
Chryseobacterium
genre
Barnesiella
16S METABARCODING use Alistipes 1
Pedobacter
Whole bacterial community Clostridium
identification within the spoiled product Finegoldia
Staphyloccocus 0.1
and comparison with a non spoiled Streptococcus
Massilia
product (Ref) Pseudomonas
Akkermansia 0
Chryseobacterium within the
spoiled product (90% relative
abundance) / absent within the Ref
Thermoresistant
proteases
Source: Mérieux NutriSciences 42Food Defect
Random
blown-packed effect Spoiled Product Reference
Packaging defect
METABARCODING use
Whole bacterial community
identification within the spoiled product
and comparison with a non spoiled
product (Ref)
Lactobacillus within the spoiled
product (57% relative abundance)
/ absent within the reference
Source: Mérieux NutriSciences 43
mapaq.gouv.qc.caFood Defect
Dominant population culture on
appropriate media
Lactobacillus enumeration
Species Identification
Mass Spectrometry MALDI-TOF
Lactobacillus buchneri
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