Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments - Aurélien Maillet NGS ...

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Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments - Aurélien Maillet NGS ...
Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing)
          dans le management de la sécurité
             et de la qualité des aliments

 Aurélien Maillet
 NGS Industry Manager
Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments - Aurélien Maillet NGS ...
Contexte

Pathogènes
Quelle est la source de contamination de mon produit ?

Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou
d’un fournisseur ?

Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon
environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?

Altération/Incident de fabrication
Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?

Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?

Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?
                                                                  2
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Caractérisation et identification
      Communauté
                                       Isolat bactérien
      microbienne    Niveaux
                        ...
                      Classe
Caractérisation du     Ordre     Identification
microbiome            Famille    - MALDI-TOF
- Culture                        -16S ARNr (500pb-1500pb)
microbiologique       Genre      - ITS2

   NGS
                      Espèce

                                 Caractérisation niveau 1
                     Sérotype    - Molecular subtyping / Ribotyping
                                 (Riboprinter®)
                                 - MLST
                       Type      - PFGE

                      Souche     Caractérisation niveau 2

                                 NGS
                      Virulome
                     Résistome

                                                                      3
Apport des outils de NGS (Next Generation Sequencing) dans le management de la sécurité et de la qualité des aliments - Aurélien Maillet NGS ...
Next Generation Sequencing (NGS)
                 "Next generation sequencing"
       Plateformes de séquençages développées après 2005

                       Des millions de brins d’ ADN séquencés à
                            haut débit en in 1 seule analyse

                         Source : http://www.nature.com/nrg/journal/v11/n1/abs/nrg2626.html,   4
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Des technologies de plus en plus
utilisées …

 ILSI Europe Food Safety Task Force (Nestlé, Unilever, Mondelez, Arla, Mc Donald’s,
 Mérieux NutriSciences ...)
 ‘Next Generation Sequencing (NGS): Translation into Practice’.

                     http://ilsi.eu/task-forces/food-safety/microbiological-food-safety/

               ISO/TC 34/SC 9 : Microbiology
               WG 25 Whole-genome sequencing for typing and genomic
               characterization                                                            5
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Next Generation Sequencing (NGS)

                         NGS
      Whole Genome
                                              Metabarcoding
     Sequencing (WGS)
                                              Communauté
      Isolat bactérien
                                              microbienne

                                                                                            6
                           SOURCE : ACTEMIUM, SCIENCE PHOTO LIBRARY, ISTEMA-HUMANO.COM.AR
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NGS pour l’Industrie
 Agroalimentaire
                                  Echantillon
                                alimentaire ou
                               environnemental
  Isolat
                                                      Communauté microbienne
  bactérien
                              Extraction de l’ADN

       ADN                       ADN

    Séquençage                                       PCR
    du génome
      complet                                    Metabarcoding
      (WGS)

                   Analyse des séquences par Bioinformatique

Caractérisation du génome                           Composition
Typage isolats bactériens                           microbienne
                                                                               7
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NGS pour l’Industrie
    Agroalimentaire
                      WGS                                                                                                                                  Metabarcoding

                   ID & Phylogénie
                                                                                                                                                             Diversité Ecosystème
Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370   Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630
                                                                                                                                                                                    8
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NGS pour l’Industrie
    Agroalimentaire
                      WGS

                   ID & Phylogénie
Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370   Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630
                                                                                                                                                           9
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Whole Genome Sequencing (WGS)
◼   Le Whole Genome Sequencing (WGS) permet d’obtenir la
    sequence d’ADN complète d’un génome bactérien en une
    seule fois

◼   Détails précis sur les microorganismes : gènes, plasmides,
    facteurs de virulence, sérotype, gènes de résistance
    (désinfectants, antibiotiques).

◼   Le WGS permet d’évaluer des différences au niveau
    nucléotidique

◼   Relations phylogénétiques entre isolats (typage)

◼   Niveau le plus fin de caractérisation bactérienne
Source: Teresa M. Bergholz et al. Applied and Environmental Microbiology 82(3) · November 2015                                                           10
Source : Leopold et al J. Clin. Microbiol. July 2014 vol. 52 no. 7 2365-2370 Source: Antimicrob. Agents Chemother. February 2011 vol. 55 no. 2 623-630
WGS comment ça marche ?

                          11
WGS pour quoi faire ?

 Passé    Meilleure connaissances (études rétrospectives)
          ▪ Base de données d’isolats et de leur historique
          (caractérisation précise des évènements passés de
          contamination/évolution des différents isolats)
          ▪Evènement de persistance de pathogènes

Présent   Traçabilité et résolution de crises/TIAC
          ▪ Ingrédient responsable dans une recette complexe
          ▪ Origine des contaminations
          ▪ Lien entre TIAC et source alimentaire

 Futur    Management de la sécurité des aliments
          ▪ Monitoring des environnements de production
          ▪ Meilleure prévention des risques bactériens

                                                               12
WGS Exemple

 PERSISTANCE DE LISTERIA CHEZ UN FABRICANT DE LEGUMES
 SURGELES

 Contrôles positifs redondants dans les produits finis
 Destruction de lots/déchets /coûts de production et analyses élevés

 Le processus de fabrication est-il maitrisé ?
 D’où vient la contamination ?

         Utilisation du WGS
 Prélèvements produits/Environnement de production

                                                                       13
WGS Exemple

  Lm Produit
               Lm Trémis

               Lm Tapis
               Convoyage

               Lm Tunnel de
               Surgélation

                              14
WGS Exemple

                 Tour Eiffel

                               1431 km

       1029 km

                                         Colisée
        Sagrada Familia                            15
WGS Exemple

                  Tour Eiffel      Proche
                                Indistinguable    Peu éloigné
                                                 Distinguable   Lointain
                                                                Différente

                                   1431 SNP

       1029 SNP

                                                  Colisée
        Sagrada Familia                                                      16
WGS Exemple

     Lm Produit
                                              1500 SNP
                                                           Lm Trémis

                                                  1000 SNP

                                                           Lm Tapis
                                                           Convoyage
                                                   5 SNP

                                                           Lm Tunnel de
                                                           Surgélation
 Indistinguable   Distinguable   Différente

                                                                          17
WGS Exemple

 PERSISTANCE DE LISTERIA CHEZ UN FABRICANT DE LEGUMES
 SURGELES

 Contrôles positifs redondants dans les produits finis
 Destruction de lots/déchets /coûts de production et analyses élevés

 WGS :

 Identification de la source de contamination

 Mesures correctives:
 Procédures de nettoyage adaptées
 Changement équipements/surfaces

                                                                       18
Contexte

Pathogènes
Quelle est la source de contamination de mon produit ?

Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou
d’un fournisseur ?

Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon
environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?

Altération/Incident de fabrication
Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?

Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?

Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?
                                                                  19
Contexte

Pathogènes
Quelle est la source de contamination de mon produit ?

Est-ce que la pathogène identifié vient de mon environnement ou
d’un fournisseur ?

Comment puis-je être sûr que le pathogène identifié dans mon
environnement n’est pas responsable d’une TIAC ?

Altération/Incident de fabrication
Pourquoi mon conditionnement est gonflé ?

Pourquoi mes produits font l’objet de réclamations clients ?

Comment puis-je réduire mes coûts de non-qualité ?
                                                                  20
NGS pour l’Industrie
Agroalimentaire

                       Metabarcoding

                       Diversité Ecosystème
                                              21
Metabarcoding
Comment ça marche ?
Matrice Alimentaire
       et/ou
Environnementale

                      Séquençage d’un
                       gène bactérien
    Extraction de        universel         Composition/
  l’ADN bactérien                       Empreinte bactérienne
                                          des échantillons

                                                                22
Metabarcoding

                                                                          Composition bactérienne des
                                                                                 échantillons

                                                    Heatmap                                                           Barplot

                           100
                                 Genre 1
                                 Genre 2
                           10
                                 Genre 3
  Relative Abundance (%)

                                      …
                           1     Genre N
                                           Echantillon 1
                                                           …
                                                               Echantillon 2
                                                                               …
                                                                                   …

                           0.1

                           0

                                                                                           Source: Mérieux NutriSciences        23
Diversité d’échantillons
◼ Environnement                   de production

◼ Matières    premières, Matières en cours de fabrication, Produits finis

◼ Incidents   de Fabrication

                                                                                                                                          24
         https://www.slideshare.net/yashgajwani1/microbiology-of-milk-59033370   http://canacopegdl.com/images/spoilage/spoilage-14.jpg
Metabarcoding Exemple

Mauvaises odeurs                                      J0     J14    J21    J28
Mauvais goût
Réclamations clients

  Utilisation du
  METABARCODING
  Identification de toute la
  communauté bactérienne du
  produit au cours de sa durée de vie

        Identification de la
        population d’altération
        du produit au cours de
        sa durée de vie
                                        Quelle est l’origine de l’altération de mon
                                        produit ?

Source: Mérieux NutriSciences
                                                                                      25
ALTEROBIO
Metabarcoding Exemple
                                Réception/Filletage   Traitement   Packaging

Echantillons
Environnementaux

  Utilisation du
  METABARCODING
  Identification de toute la
  population bactérienne de
  l’usine de production
  (équipements, surfaces, …)

      Comparaison des données
      produits/environnement
      « Machine Learning »

Source: Mérieux NutriSciences
ALTEROBIO
Knights et al., 2011                                                           26
Metabarcoding Exemple

     Mauvaises odeurs
     Mauvais goût
     Réclamations clients

         METABARCODING :

         Identification de la flore d’altération
         Identification de la source de contamination

         Mesures correctives:
         Procédures de nettoyage plus ciblées
         Révision plan de nettoyage/plan de contrôle
                 ou
         Adaptation atmosphère conditionnement/Biopréservation
Source: Mérieux NutriSciences
                                                                 27
ALTEROBIO
Take home messages

WGS                                        Metabarcoding
  Investigation pathogènes                    Investigation flores d’altération/incident de fabrication

  Caractérisation isolats                     Caractérisation du microbiote d’un produit ou d’un
  Typage/Résistance stress                    environnement d’usine

  Attribution de source de contamination      Compréhension écologie produit/environnement

  Meilleure maîtrise process                  Meilleure maîtrise process      Extension durée de vie

                                                                                                     28
Merci de votre attention

                           29
Typage Bactérien

➢ Comparaisons isolat/isolat pour déterminer leur proximité
                                                                  Levels

➢ Investigations épidémiologiques                                    ...
                                                                   Class
                                                                   Order
                                                                   Family
➢ Identifications de routes de transmission d’agents infectieux
                                                                   Genus

                                                                  Species
                  ?
                  ?                                               Serotype
                  ?
                  ?                  ????                          Type
                  ?
                                                                  Strain

                                                                             30
Typage Bactérien

 ◼ Méthodes Phénotypiques
    ◼ Ex: Sérotypage

                             Owais et al., 2014

                                                  ➢ Nécessite un œil
                                                    expérimenté
   ➢ Rapide
                                                  ➢ Sérums onéreux
   ➢ Peut être standardisé
                                                  ➢ Faible pouvoir
                                                    discriminant
                                                                       31
Typage Bactérien

         ◼ Méthodes       moléculaires
                  ◼ Ex: MLST

Aanensen DM, Spratt BG (2005) The multilocus sequence typing network: mlst.net Nucleic Acids Res. Jul
                                                                                                        32
1;33(Web Server issue):W728-33
Typage Bactérien

   ◼ Méthodes  moléculaires
       ◼ Ex: MLST

                              ➢ Temps d’analyse
                                pouvant être
                                importants

➢ Caractérisation précise     ➢ Faible pouvoir
                                discriminant -> 7
➢ Schémas complets pour         gènes
  un certain nombre
  d’espèces bactériennes      ➢ Pas disponible pour
                                toutes les bactéries

                                                       33
Typage Bactérien

◼ Ex:   PFGE

                   Source : PulseNet CDC

                                           34
Typage Bactérien

◼ Ex:   PFGE

 ➢ Pouvoir discriminant    ➢ Temps d’analyse importants
   important                 (4 à 5 jours)

 ➢ Grande résolution       ➢ Coûts élevés de mise en
                             place (équipement, logiciel
 ➢ Reproductible             d’analyse, réactifs)

 ➢ Applicable à un grand   ➢ Nécessite un personnel très
   nombre d’espèces          qualifié
   bactériennes
                           ➢ Biais d’analyses

                                                           35
Typage Bactérien

◼ Ex:   PFGE

                   Adapté de Tunover et al., 1995   36
Quelles analyses ?

           wgMLST                      wgSNP

                             (hqSNP)-based clustering pipelines

             wgMLST                      wgSNP
        (L. monocytogenes)        (L. monocytogenes)
            4797 loci            ≈ 3 000 000 basepairs

                                                                  37
Quelles analyses ?

                             wgMLST                    SNP
                         Polymorphisme de
                                                Uniquement mutation
      Unité de mesure   gène – plusieurs type
                                                de nucléotide simple
                            de mutation
                                                Génome de référence
                         Base de données
        Pré-requis                               complet et de très
                             génique
                                                   bonne qualité
                        Rapide – ne dépend
                                                Résolution extrême –
        Avantages       pas de génomes de
                                                 méthodes publiées
                             référence
                         Base de données        Génome de référence
                        géniques à mettre à        – Ressource
                          jour – Accès aux          informatique
       Inconvénients
                         bases de données           importante -
                        difficile – Expertise         Expertise
                           bioinformatique        bioinformatique

                                                                       38
Quelles analyses ?

                     wgMLST                              wgSNP

                                            (hqSNP)-based clustering pipelines

                       wgMLST                            wgSNP
                  (L. monocytogenes)              (L. monocytogenes)
                      4797 loci                  ≈ 3 000 000 basepairs

 Indistinguable          Distinguable   Indistinguable    Distinguable   Différente

                                                                                      39
Products shelf life studies

    ◼ Microbial   population shift

Production date                   Use by Date (UBD)                              UBD + 10

                   Lactococcus, Leuconostoc….

                   Pseudomonas 55%

                   unclassified

                                                      Source: Mérieux NutriSciences         40
Etude de Durée de Vie de Produits

    ◼ Microbial   population shift

Production date              Use by Date (UBD)                              UBD + 10

                                                 Source: Mérieux NutriSciences         41
Food Defect

Coagulated UHT milk
                                                                            Spoiled Milk   Ref
Off odors                                                                                                                 100
                                                                  Other
No culture on petri dishes                                 Unclassified
                                                         Cellulomonas

                                                                                                 Abondance relative (%)
                                                         Dermacoccus
                                                       Microbacterium                                                     10
                                                     Propionibacterium
                                                    Chryseobacterium

                                            genre
                                                            Barnesiella
16S METABARCODING use                                          Alistipes                                                  1
                                                           Pedobacter
Whole bacterial community                                   Clostridium
identification within the spoiled product                    Finegoldia
                                                       Staphyloccocus                                                     0.1
and comparison with a non spoiled                       Streptococcus
                                                               Massilia
product (Ref)                                           Pseudomonas
                                                          Akkermansia                                                     0

 Chryseobacterium within the
 spoiled product (90% relative
 abundance) / absent within the Ref

                         Thermoresistant
                           proteases
                                                    Source: Mérieux NutriSciences                                               42
Food Defect

  Random
  blown-packed effect                                      Spoiled Product   Reference
  Packaging defect

METABARCODING use
Whole bacterial community
identification within the spoiled product
and comparison with a non spoiled
product (Ref)

   Lactobacillus within the spoiled
   product (57% relative abundance)
   / absent within the reference

                                            Source: Mérieux NutriSciences                43
                                            mapaq.gouv.qc.ca
Food Defect

                              Dominant population culture on
                              appropriate media
                              Lactobacillus enumeration

                              Species Identification
                              Mass Spectrometry MALDI-TOF

     Lactobacillus buchneri

                                                               44
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