Dr M. SEDDIKI - Université d'Oran Faculté de Médecine Département de Pharmacie 5 année pharmacie - Faculté de Médecine d'Oran

Université d’Oran
   Faculté de Médecine
Département de Pharmacie
    5 année pharmacie

  Dr M. SEDDIKI

                           2019/2020

INTRODUCTION
Les contrôles de routine, d’enregistrement du
  produit fini comporte des tests de sécurité qui
  renferment:
• Essai des pyrogènes ;
• Recherche des endotoxines (LAL Test);
• Essai d’innocuité (toxicité anormale) ;
• Tolérance locale (cutanée, oculaire).

Essai des pyrogènes
• Objet et principe:
C’est la recherche des substances pyrogènes dans les
  produits pharmaceutiques à usage parentéral par la
  technique in vivo pour limiter à un niveau acceptable le
  risque de réaction de fièvre chez les patients.

Les substances pyrogènes sont représentées par :
• Les lipopolysaccharides des membranes bactériennes à
  gram – (endotoxines)
• Les bactéries à gram +
• Les levures et les moisissures
• Les poussières chimiques.

Essai
                 Essai   pyrogène
                       des pyrogènes
L’essai des pyrogènes consiste à mesurer l’élévation de la température
rectale chez le lapin, après injection de la substance à tester dans la
veine marginale de l’oreille.

Essai
             Essai   pyrogène
                   des pyrogènes
Lapins albinos de race néo-zélandaise (1.5 – 4 Kg)
Essai préliminaire : dont le but est de :
• Choisir les lapins candidats pour l’essai définitif ;
• Eliminer les lapins hypersensibles ;
• Valider l’eau physiologique et les seringues.

Essai définitif: permet de s’assurer de la conformité
  du produit.

Essai des pyrogènes
Champs d’application:
• Préparations injectables pour perfusion
• Préparations à diluer pour usage parentéral
• Préparations injectables ou poudres pour usage
  parentéral
• Produits dérivés du sang
• Vaccin méningococcique
• Matières premières ayant une monographie à la
  pharmacopée européenne
• Solutions pour hémodialyse et dialyse
  péritonéale

LAL test
• Objet et principe:
Cette étude a pour but de rechercher des
  endotoxines dans les produits pharmaceutiques à
  usage parentéral, in vitro qui utilise le lysat
  d’amoebocytes de limule.
Les endotoxines par activation d’une enzyme du
  lysat d’ameobocyte de limule, conduisent à
  l’hydrolyse du coagulogène en coaguline
  insoluble.
Une certaine quantité d’endotoxines est nécessaire
  pour activer l’enzyme gélifiante et former un gel.

LAL test
                                Endotoxine
    proenzyme (LAL) ===========> enzyme

                           Coagulogène ============> coaguline insoluble
                                                    (formation d’un gel)

• Le LAL test est une alternative à l’essai des pyrogènes chez le lapin.
  Il permet de réduire la souffrance animale.

• C’est un test rapide et sensible mais il ne détecte pas toutes les
  substances pyrogènes (uniquement les endotoxines bactériennes).

LAL test
• Essai final: Préparer les tubes comme suit :
•   Un tube contrôle négatif (eau LAL + lysat)
•   Un tube contrôle positif (CSE dans eau LAL + lysat)
•   Deux tubes produit à tester + lysat
•   Deux tubes produit à tester surchargé par CSE + lysat

• Résultats:
• Formation d’un gel : résultat + (produit non conforme)
• Absence de formation de gel : résultat - (produit conforme)

LAL test
• Champs d’application:
- Les produits radio-pharmaceutiques.
- Les produits contenant potentiellement de
   l’endotoxine (certains vaccins, des produits
   préparés par géni-génétique ex: insuline).
- EPPI.
- Injections IV et intra-rachidiennes.
- Préparations présentant une réactivité toxique ou
     pharmacologique marquée chez le lapin
     (hormones polypeptidiques).
- Produits sanguins

Essai de la toxicité anormale
• Objet et principe:

Essai
     Essai de
           dela
              latoxicité
                 toxicitéanormale
                          anormale
• Protocole:
• Utiliser la même voie que celle
 indiquée chez l’homme ;
• 5 souris albinos de race Swiss ;
• Surveiller pendant 24h après l’administration :
* Aucun animal ne meurt  conforme
* Plus que deux meurent  non conforme
* Un animal meurt  refaire l’essai sur 10 animaux :
    aucun animal meurt  conforme dans le cas
   contraire le produit est non conforme.

Essai de la tolérance cutanée « in vivo »
• Objet et principe :
Le test de tolérance cutanée a pour but de prédire à
  partir de la connaissance de la toxicité sur un
  organisme vivant, le risque toxicologique sur
  l’homme
La méthode est réalisée sur 6 lapins de race
  néozélandaise ou californienne.
Le dos de chaque animal est divisé en 2 zones,
  après élimination des poils ; sur l’une des zones le
  produit est appliqué directement, sur l’autre zone
  il est appliqué après scarification.

Essai de la tolérance cutanée « in vivo
 Essai de la tolérance cutanée « in vivo »
                     »
* Le produit est maintenu en contact par un pansement pendant 24h ;
* 24h après, les pansements sont ôtés. Les résultats sont lus au bout
d’une demi-heure par au moins deux personnes distinctes. Une
seconde lecture est faite après 72h.
 * Les lectures consistent à apprécier l’érythème et l’œdème.

Essai de la tolérance cutanée « in vivo
Essai de la tolérance cutanée « in vivo »
                    »
• Résultats :
Le système de cotation des phénomènes observés
  permet de dégager par un calcul un indice
  d’irritation primaire cutanée (IP) pour classer le
  produit en 4 catégories :
A. Non irritant (IP < 0.5)
B. Légèrement irritant (0.5 < IP < 2)
C. Irritant (2 < IP < 5)
D. Très irritant (5 < IP < 8)

Essai de tolérance oculaire
• Objet et principe :
L’instillation est effectuée dans le cul de sac
   conjonctival d’un œil chez 6 lapins de race
   néozélandaise. L’autre œil non traité constitue le
   témoin.
Les paupières sont maintenues fermées pendant 10 sec
   afin d’éviter toute perte de produit.

Essaide
           Essai  detolérance
                     tolérance oculaire
                               oculaire
• Les observations sont faites 1 heure après instillation puis 1 jour, 2 jours, 3
  jours, 4 jours, 7 jours et se poursuivent jusqu’au n ème jour ; par au moins
  2 personnes distinctes. A partir de J+1, de la fluorescéine est instillée à
  chaque observation pour une meilleure évaluation des lésions cornéennes.

• Résultats :
Le système de cotation des phénomènes observés permet de dégager par un
   calcul un indice d’irritation oculaire maximum pour classer les produits en
   6 catégories.
A. Non irritant (IO Max < 5)
B. Très faiblement irritant (5 < IO Max < 15)
C. Légèrement irritant (15 < IO Max < 25)
D. Irritant (25 < IO Max < 50)
E. Très irritant (50 < IO Max < 80)
F. Extrêmement irritant (IO Max > 80)