La voie canonique Wnt est nécessaire pour le maintien de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique après un accident vasculaire cérébral: ...
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La voie canonique Wnt est nécessaire pour le maintien
de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique après
un accident vasculaire cérébral: impacts sur la thérapie
thrombolytique
Mémoire
Noémie Jean-Leblanc
Maîtrise en neurobiologie - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Noémie Jean-Leblanc, 2019
Résumé
L'accident vasculaire cérébral (AVC) déclenche une perturbation de la barrière
hémato-encéphalique (BHE) et entrave la récupération des tissus en altérant le
microenvironnement cérébral local. L'administration de l'activateur tissulaire du
plasminogène (rtPA) dans une fenêtre thérapeutique étroite de 4,5 heures après
l'AVC demeure le seul traitement existant. Au-delà de cette fenêtre, le tPA aggrave
la perturbation de la BHE et provoque des transformations hémorragiques. La voie
canonique Wnt est connue comme induisant la formation et la maturation de la
BHE pendant l'ontogenèse. Nous émettons l'hypothèse que la voie est nécessaire
pour maintenir l'intégrité de la BHE après un AVC et que son activation pourrait
constituer une approche prometteuse pour améliorer le traitement par rtPA. Ainsi,
nous avons d'abord évalué l'activité de la voie dans le cerveau de souris soumises
à un modèle d’AVC. Ensuite, nous avons évalué l’effet de la désactivation de la
voie sur l’intégrité de la BHE ainsi que son activation dans un contexte.
d'administration retardée de rtPA. Nos résultats montrent que l'activité de la voie
est induite spécifiquement dans les cellules endothéliales cérébrales après un AVC
ischémique. La désactivation de la voie par un inhibiteur aggrave la dégradation de
la BHE et augmente l'incidence des transformations hémorragiques spontanées
sans affecter l’infarct. En revanche, l'activation de la voie par un activateur
spécifique, la 6-bromoindirubine-3'-oxime (6-BIO), atténue la dégradation de la
BHE et réduit l'incidence des transformations hémorragiques associées à
l'administration retardée du rtPA en induisant l’expression d’une protéine des
jonctions serrées (claudine 3) et atténue la perméabilité basale endothéliale en
réprimant l'expression de PLVAP, sans affecter l'infarctus, la vascularisation ou
l'inflammation du cerveau. Notre étude démontre que l'activation de la voie
canonique Wnt constitue une stratégie cliniquement pertinente pour étendre la
fenêtre thérapeutique du rtPA en atténuant la dégradation de la BHE via la
régulation des mécanismes spécifiques à la BHE.
iii
Abstract
Stroke triggers blood-brain barrier (BBB) disruption and hampers tissue recovery
by impairing the local brain microenvironment. Administration of recombinant tissue
plasminogen activator (rtPA) within a therapeutic window of 4.5 hours after onset
constitutes the only existing treatment. Beyond this window, tPA worsens BBB
disruption and causes haemorrhagic transformation. Canonical Wnt pathway
induces BBB formation during ontogeny. We hypothesize here that pathway
activity is required to maintain BBB integrity after stroke and that its activation
might constitute a promising approach to improve rtPA therapy via protection of the
BBB. Therefore, we have first assessed pathway activity in the brain of mice
subjected to transient middle cerebral artery occlusion (MCAo). Next, we have
evaluated the effect of pathway deactivation early after stroke on BBB integrity.
Finally, we have assessed the potential of pathway activation on BBB breakdown
associated to the delayed administration of rtPA. Our results show that pathway
activity is induced specifically in brain endothelial cells early after ischemic stroke.
Early deactivation of the pathway using a potent inhibitor, XAV939, aggravates
BBB breakdown, and increases the incidence of spontaneous haemorrhagic
transformation, without affecting brain infarct. On the other hand, pathway
activation using a potent specific activator, 6-Bromoindirubin-3’-oxime (6-BIO),
attenuates BBB breakdown, and reduces the incidence of haemorrhagic
transformation associated to delayed rtPA administration by inducing expression of
the tight junction claudin-3, and attenuates endothelial basal permeability by
repressing the expression of PLVAP, without affecting brain infarct, vascularization
and inflammation. Our study demonstrates that activation of the canonical Wnt
pathway constitutes a clinically relevant strategy to extend the therapeutic window
of rtPA by attenuating BBB breakdown via regulation of BBB-specific mechanisms.
iv
Table des matières
Résumé ............................................................................................................................. iii
Table des matières ............................................................................................................ v
Liste des figures................................................................................................................ vii
Liste des abréviations ...................................................................................................... viii
Remerciements.................................................................................................................. x
Avant-propos ..................................................................................................................... xi
Chapitre 1 .......................................................................................................................... 1
1. Introduction ................................................................................................................. 1
1.1 Les accidents vasculaires cérébraux ................................................................... 1
1.2 L'ischémie cérébrale ............................................................................................ 1
1.2.1 L'unité neurovasculaire en condition physiologique ...................................... 2
1.2.2 L'unité neurovasculaire en condition ischémique .......................................... 7
1.3 Le système de l'activateur tissulaire du plasminogène ....................................... 18
1.3.1 Fonction du système de l’activateur tissulaire du plasminogène ................. 19
1.3.2 L'action de l'activateur tissulaire du plasminogène sur la barrière hémato-
encéphalique ............................................................................................................ 21
1.3.3 L'activateur tissulaire du plasminogène dans les accidents vasculaires
cérébraux et ses limitations ...................................................................................... 23
1.4 La voie de signalisation Wnt/ β-caténine ............................................................ 23
1.4.1 Fonctions de la voie Wnt ............................................................................ 25
1.4.2 Fonctions de la voie Wnt dans la barrière hémato-encéphalique ................ 26
1.4.3 La voie Wnt et l'accident vasculaire cérébral .............................................. 27
1.5 Hypothèse de travail et objectifs spécifiques...................................................... 27
Chapitre 2 ........................................................................................................................ 30
2. Canonical Wnt pathway maintains blood-brain barrier integrity upon ischemic stroke
and its activation ameliorates tissue-plasminogen activator therapy ................................ 30
2.1 Résumé ............................................................................................................. 31
2.2 Abstract ............................................................................................................. 32
2.3 Introduction ........................................................................................................ 33
2.4 Material and Methods ........................................................................................ 35
2.4.1 Animal experiments .................................................................................... 35
2.4.2 Tissue processing ....................................................................................... 36
2.4.3 Transmission Electron Microscopy ............................................................. 37
2.4.4 Isolation of brain capillaries......................................................................... 38
2.4.5 Analysis of brain injury, IgG extravasation and haemorrhagic transformation
38
2.4.6 Fluoro-jade B staining ................................................................................. 39
2.4.7 ELISA assay ............................................................................................... 40
2.4.8 Western Blot analysis ................................................................................. 40
v
2.4.9 Immunofluorescence analysis ..................................................................... 41
2.4.10 Cell-based assays ...................................................................................... 42
2.4.11 Statistical analysis ...................................................................................... 44
2.5 Results .............................................................................................................. 45
2.5.1 Pathway activity is detectible predominately in the brain endothelial cells and
re-emerges upon ischemic stroke ............................................................................. 45
2.5.2 Early pathway deactivation aggravates BBB breakdown and increases
incidence of spontaneous haemorrhagic transformation ........................................... 47
2.5.3 6-BIO dose dependently activates the pathway in brain endothelial cells and
reverses OGD-induced endothelial basal permeability .............................................. 47
2.5.4 Pathway activation increases BBB integrity and reduces incidence of rtPA-
induced perivascular bleeding................................................................................... 49
2.5.5 6-BIO administration does not influence ischemic stroke-associated neuronal
injury, angiogenesis and inflammation ...................................................................... 51
2.5.6 6-BIO systemic administration induces and stabilizes pathway activity
specifically in brain microvasculature ........................................................................ 53
2.5.7 Pathway activation attenuates tight junction disruption and basal endothelial
permeability associated to delayed rtPA administration ............................................ 54
2.6 Discussion ......................................................................................................... 57
2.7 Acknowledgements............................................................................................ 62
2.8 Disclosure statement ......................................................................................... 62
Chapitre 3 ........................................................................................................................ 63
3. Discussion ................................................................................................................ 63
Chapitre 4 ........................................................................................................................ 70
4. Conclusion et perspectives ....................................................................................... 70
Références ...................................................................................................................... 73
vi
Liste des figures
Figure 1.1 La pénombre ischémique. ................................................................................. 2
Figure 1.2. L'unité neurovasculaire .................................................................................... 3
Figure 1.3. Schéma des jonctions serrées inter-endothéliales et des protéines intégrales
impliquées dans la régulation paracellulaire....................................................................... 6
Figure 1.4. La cascade ischémique.................................................................................... 8
Figure 1.5. Schéma des événements phasiques de la barrière hémato-encéphalique
associés à l'ischémie cérébrale et à la reperfusion au cours du temps ............................ 15
Figure 1.6. Organisation schématique de la signalisation de la β-caténine dans les cellules
endothéliales du système nerveux central ....................................................................... 24
Figure 2.1. Canonical Wnt pathway activity is detectable predominantly in brain endothelial
cells and is induced upon ischemic stroke.. ..................................................................... 45
Figure 2.2. Figure 2. Deactivation of the canonical Wnt pathway in brain endothelial early
after ischemic stroke aggravates brain oedema and causes haemorrhagic transformation
........................................................................................................................................ 46
Figure 2.3. 6-BIO efficaciously activates the canonical Wnt pathway in brain endothelial
cells and decreases the OGD-induced basal permeability ............................................... 48
Figure 2.4. 6-BIO attenuates BBB breakdown and reduces the incidence haemorrhagic
transformation associated to delayed rtPA administration after stroke ............................. 50
Figure 2.5. 6-BIO does not influence neuronal death, angiogenesis and inflammation after
ischemic stroke ................................................................................................................ 52
Figure 2.6. Delayed rtPA administration impairs canonical Wnt pathway activity in brain
endothelial cells, which is rescued by 6-BIO systemic treatment ...................................... 53
Figure 2.7. 6-BIO systemic administration attenuates tight junction disruption associated to
delayed rtPA administration. ............................................................................................ 55
Figure 2.8. 6-BIO systemic administration recovers basal endothelial permeability after
delayed rtPA administration ............................................................................................. 56
Figure 4.1 Niveaux de la protéine Dkk-1 chez la souris suite à un AVC ischémique ........ 72
vii
Liste des abréviations
AVC Accident vasculaire cérébral
6-BIO 6-Bromoindirubine-3'-oxime
AMPA α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoazol-4-propionate
APC Protéine adenomatous polyposis coli
ATP Adénosine triphosphate
BDNF Facteur neurotrophique issu du cerveau
BEMC Cellules endothéliales microvasculaires primaires du cerveau
bEnd3 Cellules endothéliales immortalisées dérivées de cerveaux murins
BHE Barrière hémato-encéphalique
CASK Calcium calmoduline serine thréonine kinase
CK1α Kinase caséine 1α
DISC Complexe d'induction de mort
Dkk-1 Dickkopf-1
Dvl Protéine Dischevelled
FADD Protéine associée au domaine de mort Fas
FDA Food and Drug Administration
Fzd Récepteur Frizzled
GCSF Facteur stimulant les colonies de granulocytes
GDNF Facteur neurotrophe dérivé de la glie
GLUT1 Transporteur du glucose 1
GSK3β Glycogène syntéthase kinase 3β
ICAM-1 Molécule d'adhésion intercellulaire 1
IL-10 Interleukine 10
IL-1β Interleukine-1β
JAM-A/-B/-C Molécule d'adhésion jonctionnelle A, B, C
LRP1/5/6 Protéine apparentée aux récepteurs des lipoprotéines à faible densité
1, 5, 6
LTD Dépression à long terme
LTP Potentialisation à long terme
MAC Pores de transition mitochondriale
viii
MAGI-1 Membrane-associée guanylate kinase
MCAO Occlusion de l'artère cérébrale moyenne
MCP-1 Protéine chimiotactique des monocytes 1
MMP-2/-3/-9 Métalloprotéinases matricielles 2, 3, 9
NADH Nicotinamide adénine dinucléotide
NF- Кβ Facteur de transcription Кβ
NIHSS National Institute of Health Stroke Score
NMDA N-méthyl-D-aspartate
NO Oxyde nitrique
OGD Déprivation d'oxygène et de glucose
ONOO- Peroxynitrite
PAF Facteur d'activation plaquettaire
PAI-1/-2 linhibiteur des activateurs du plasminogène 1, 2
Par-3/-6 Protéines de polarité 3, 6
PLVAP Protéine associée aux vésicules de plasmalemma
PN-1 Protéase nexine 1
ROS Dérivés réactifs de l'oxygène
rtPA Activateur tissulaire du plasminogène recombiné
SOD Superoxyde dismutase recombinante
STAIR Stroke Therapy Academic Industry Roundtable
TGF-β Facteur de croissance transformant β
TNFR1/2 Récepteur du facteur de nécrose tumorale 1, 2
TNF-α Facteur de nécrose tumorale α
tPA Activateur tissulaire du plasminogène
rtPA Activateur tissulaire du plasminogène, forme recombinante
UNV Unité neuro-vasculaire
VCAM-1 Protéine d'adhésion vasculaire cellulaire 1
VEGF Facteur de croissance de l'endothélium vasculaire
VEGFR-2 Récepteur du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire 2
ZO-1 Zonula occludens 1
ix
Remerciements
Mon projet de maîtrise et le mémoire qui s'y rattache ne seraient pas les mêmes
sans le support et l'aide incroyable que j'ai pu recevoir durant ces deux dernières
années.
Premièrement, j'aimerais remercier mon directeur de recherche, mentor, collègue
et ami, Ayman ElAli. Il a su m'offrir un support et une écoute incroyable dans un
milieu qui n'était pas toujours facile. Merci de m'avoir fait confiance et de m'avoir
accepté dans ton laboratoire en tant que première étudiante. Les connaissances et
l'expertise que j'ai acquises sont inestimables et me serviront pour le reste de ma
vie, tant professionnelle que personnelle. Je suis fière du laboratoire que tu as su
créer et les prochains étudiants seront chanceux d'étudier sous ta direction.
Merci à tous les membres de l'équipe du Dr Serge Rivest pour leur support
incroyable particulièrement Marie-Michelle Plante, Paul Préfontaine et Nataly
Laflamme qui ont pu m'aider avec toutes mes petites questions techniques
fatiguantes.
Merci aux membres de mon équipe, Revathy et plus récemment Romain et
Maxime. Parce qu'une équipe de 4 c'est pas mal mieux qu'une équipe de 1!
Merci à ma famille et mes amis, de leur support et de leur curiosité scientifique à
l'égard de mon projet. Pouvoir répondre à vos questions scientifiques et voir la
compréhension illuminer vos faces est plus gratifiant que la meilleure des notes
dans un bulletin.
Finalement, merci au comité d'évaluation pour leur temps et leur contribution pour
la version finale de ce mémoire.
x
Avant-propos
L’article intitulé Canonical Wnt pathway maintains blood-brain barrier integrity upon
ischemic stroke and its activation ameliorates tissue-plasminogen activator therapy
est en révision dans le journal Brain Pathology. Cet article représente le second
chapitre du mémoire. Lors de ce projet, j’ai effectué l’intégralité des expériences
mis à part les chirurgies de MCAO qui ont été réalisées par Revathy Guruswamy
et les expériences en microscopie électronique qui ont été réalisées par Katherine
Picard et Geneviève Parent. J’ai également accompli l’analyse des résultats, puis
interprété ceux-ci en discutant avec Ayman ElAli. Suite à la discussion scientifique,
j’ai rédigé l’article scientifique avec l'aide de Ayman ElAli, article qui fut ensuite
corrigé par l'ensemble des co-auteurs. Le projet lui-même a été conçu et encadré
par Ayman ElAli.
xiChapitre 1
1. Introduction
1.1 Les accidents vasculaires cérébraux
L'accident vasculaire cérébral (AVC) est un trouble cérébral courant qui se classe
parmi les trois principales causes de mortalité au monde et constitue la cause la
plus importante d'incapacité à long terme chez les adultes (1). L'hypertension,
l'hypercholestérolémie, l'obésité, le diabète, l'inactivité physique et l'âge constituent
les facteurs de risques les plus communs (2). Chaque année, 50 000 nouveaux
cas d'AVC sont recensés au Canada dont 15 à 30% souffriront d'incapacité à long
terme (2). Le vieillissement grandissant de la population laisse présager une
augmentation de l'incidence des AVC. Le pronostic suivant un AVC varie en
fonction du type et de la gravité de l'atteinte, de l'emplacement de l'occlusion ainsi
que de l'efficacité et de la disponibilité du traitement anti-thrombolytique. 15 à 30%
des individus ayant subi un AVC doivent composer avec des incapacités
permanentes et 20% seront placés dans des institutions pour des soins à long
terme (2). Les AVC engendrent des coûts astronomiques sur le système de santé.
Par exemple, il est estimé que les coûts directs et indirects sont montés à plus de
40.1 milliards de dollars américains entre 2013 et 2014 aux États-Unis (2). Compte
tenu de la prévalence des AVC, des effets à long terme sur la population, de sa
nature multifactorielle et du fardeau économique qu'il engendre, il est impératif
pour les chercheurs de développer des thérapies plus efficaces pour non
seulement prévenir les AVC, mais aussi pour améliorer la récupération
subséquente.
1.2 L'ischémie cérébrale
Un AVC est caractérisé par une perte soudaine de la fonction cérébrale suite à
l'interruption du débit sanguin cérébral causé par un blocage des vaisseaux
sanguins (AVC ischémique) ou par une rupture (AVC hémorragique). Les AVC
ischémique représentent la majorité des cas (87%) et surviennent suite à un
rétrécissement des artères engendré par l'accumulation de plaques
1arthérosclérotiques (2). L'AVC ischémique peut être de type thrombotique ou
embolique selon le site de formation du caillot: un thrombus se forme à la zone de
l'infarctus dans l'artère du cerveau tandis qu'un embole provient d'ailleurs dans le
corps et se déplace jusqu'à la région de l'infarctus. Les 13% restant des AVC sont
constitués d'AVC hémorragiques qui surviennent lorsqu'un vaisseau sanguin
fragilisé se rompt et perturbe le flux d'oxygène et de nutriments amené par le sang
dans le tissu cérébral. L'AVC ischémique va donc induire la formation de deux
zones lésées distinctes, soit la zone infarctée qui se nomme le cœur, entourée par
une région secondaire appelée la pénombre (Fig 1.1).
Figure 1.1. La pénombre ischémique. Une région cérébrale de faible perfusion dans laquelle les cellules ont perdu leur
potentiel membranaire («cœur») est entourée d'une zone où la perfusion intermédiaire prédomine («pénombre») et les
cellules se dépolarisent par intermittence («dépolarisation péri-infarctus»). Dès le début du déficit de perfusion focale, le
cœur et la pénombre sont dynamiques dans l'espace et dans le temps. Il existe des seuils de perfusion au-dessous
desquels certaines fonctions biochimiques sont bloquées (échelle de couleur). (3) [tiré intégralement]
Le cœur est la zone la plus faiblement irriguée, caractérisée par un débit sanguin
inférieur à 10ml/min/100g, et sera donc là où la survie cellulaire sera compromise
puisqu'elle correspond à une lésion structurale. La pénombre est caractérisée par
un débit sanguin légèrement plus élevé (10 à 18 ml/min/100g) et est aussi à risque
de devenir nécrosée mais la survie cellulaire y est assurée dans un premier temps
(3). Les régions du cœur et de la pénombre sont dynamiques et leurs dimensions
évoluent dans le temps (4).
1.2.1 L'unité neurovasculaire en condition physiologique
Le cerveau consomme jusqu'à 20% des nutriments (principalement du glucose) et
de l'oxygène présent dans le sang, rendant les neurones complètement
2dépendantes du système vasculaire pour assurer leur survie (5). Ainsi, la
microvasculature cérébrale doit interagir fonctionnellement et structurellement avec
le parenchyme cérébral pour assurer le fonctionnement adéquat du cerveau. Cet
échange est gouverné par l'unité neurovasculaire (UNV). Le concept d'UNV a été
pour la première fois défini par le Stroke Progress Review Group qui l'a décrit
comme étant une triade composée des neurones, des cellules gliales (astrocytes
et microglies) et de la vasculature adjacente (artérioles et capillaires) (6). Les
cellules endothéliales, en étant scellées entre elles, forment la barrière hémato-
encéphalique (BHE) (Section 1.2.1.1 La barrière hémato-encéphalique) , et
interagissent physiquement et chimiquement avec les protéines de la matrice
extracellulaire, les péricytes, les pieds astrocytaires, les microglies et les neurones
afin de créer une barrière fonctionnelle qui régule le mouvement des molécules qui
rentrent et qui sortent du cerveau (Fig 1.2) (7). L'UNV est donc un site dynamique
d'échanges biochimiques et cellulaires qui a pour but d'assurer l'homéostasie et le
fonctionnement optimal du cerveau en influençant le microenvironnement cérébral.
Le contrôle du couplage neurovasculaire (8), l'ajustement local du flot sanguin
cérébral (9) et le réglage des paramètres et des fonctions de la BHE (10) sont
donc assurés par les composantes de l'UNV afin de répondre au besoin du
cerveau en tout temps (5).
Figure 1.2. L'unité neurovasculaire comprend les cellules endothéliales, les péricytes et les astrocytes qui, ensemble,
confèrent des propriétés uniques à la barrière hémato-encéphalique. Les cellules endothéliales qui bordent le système
vasculaire cérébral ont de nombreux transporteurs transcellulaires en plus de jonctions serrées qui limitent la diffusion
paracellulaire passive de tous les solutés et des ions, sauf ceux de très petite taille. (11) [tiré intégralement]
31.2.1.1 La barrière hémato-encéphalique
Tel que mentionné plus haut, la BHE est formée des cellules endothéliales jointes
ensemble en une barrière qui sépare le sang du cerveau. Les jonctions serrées
lient les cellules endothéliales adjacentes entre elles et poussent les molécules à
emprunter la route transcellulaire pour atteindre le parenchyme cérébral, créant
donc une réelle barrière physique (12). Des gaz comme l'O2 et le CO2 peuvent
diffuser librement à travers la membrane ainsi que de petits agents lipophiles tels
que l'éthanol, mais ce sont principalement la présence de systèmes de
transporteurs spécifiques qui sont capables de réguler le trafic des molécules
hydrophiles de petites tailles (13). Les jonctions serrées induisent aussi la polarité
nécessaire de la BHE qui est caractérisée par la présence de deux côtés
fonctionnellement distincts, un côté luminal faisant face à la circulation sanguine et
un côté abluminal faisant face au parenchyme cérébral (7). Finalement, une
barrière métabolique est créée par la présence d'enzymes intracellulaires et
extracellulaires, tels que la monoamine oxydase et le cytochrome P450 qui sont
capables d'inactiver plusieurs composants neuroactifs et toxiques (14).
L'endothélium cérébral exhibe une activité d'endocytose et de transcytose quasi
inexistante en comparaison au reste de l'endothélium périphérique (15).
La BHE rempli plusieurs rôles. Elle facilite l'entrée des nutriments nécessaires au
cerveau et régule la sortie des composants potentiellement nocifs et des déchets
métaboliques (13). Elle restreint les mouvements ioniques et fluidiques entre le
sang et le cerveau afin de protéger des fluctuations dans la composition ionique
qui pourraient perturber la signalisation synaptique (16). Elle permet aussi de
séparer les neurotransmetteurs qui agissent de manière centrale ou périphérique
afin d'éviter un effet redondant (17).
Les cellules endothéliales qui composent la BHE sont en contacts étroits avec les
péricytes (18, 19) et les pieds astrocytaires (17). Cette proximité induit une
communication bidirectionnelle. La communication entre les deux côtés est
essentielle pour la préservation de l'homéostasie du cerveau. Du côté luminal, les
cellules endothéliales sont exposées à des facteurs de stress présents dans la
circulation sanguine tels que des médiateurs inflammatoires et des toxines
4environnementales qui peuvent compromettre l'intégrité de la barrière (5). Le côté
abluminal contient de nombreux récepteurs et protéines membranaires qui
contribuent au relai du signal émis par les péricytes et les pieds astrocytaires dans
l'espace périvasculaire vers les cellules endothéliales (17, 18). Ce sont ces
signaux périvasculaires qui contrôlent la formation des jonctions cellulaires entre
les cellules endothéliales et régulent l'abondance et l'activité des transporteurs
membranaires (20).
Il est maintenant reconnu que l'endothélium cérébral diffère de l'endothélium des
tissus périphériques en raison de caractéristiques spécifiques qui contribuent à ses
propriétés de barrières (physiques ou chimiques). Par exemple, les jonctions
serrées sont nettement plus complexes dans l'endothélium cérébral et occluent la
fente intercellulaire plus efficacement (Fig 1.3) (12). Parmi les composants
identifiés ayant un rôle essentiel pour la structure des jonctions serrées, on
retrouve les protéines transmembranaires occludines et claudines. Occludine est
une protéine qui est capable de se lier avec la protéine de liaison au cytosquelette
zonula occludens 1 (ZO-1). La fonction principale de la protéine occludine semble
être la régulation des jonctions serrées (21). La délétion de la partie N terminale de
la protéine induit un effet dramatique sur l'intégrité des jonctions serrées,
caractérisé par une faible résistance électrique transcellulaire, une augmentation
du flux paracellulaire de petits traceurs de masse moléculaire et la présence
d'espaces dans les jonctions serrées en analyse en microscopie électronique (22).
Les claudines, quant à elles, forment une famille de multigènes comprenant plus
de 20 membres qui composent les jonctions serrées via une interaction homophile
claudine-claudine (23). À la BHE, c'est principalement l'expression des claudines
3, 5 et 12 qui semblent contribuer le plus à la forte résistance électrique
transendothéliale (12). Chaque claudine régule la diffusion d'un groupe de
molécules d'un certain poids moléculaire (24). D'autres protéines de jonctions
comme JAM-A, JAM-B et JAM-C sont aussi présentes dans les cellules
endothéliales du cerveau et sont impliquées dans la formation et la maintenance
des jonctions serrées (25). Les protéines transmembranaires sont connectées du
côté cytoplasmique à un réseau complexe de protéines membranaires
5périphériques qui forment de grands complexes protéiques, les plaques
cytoplasmiques. À l'intérieur de ces plaques se retrouvent des protéines
adaptatrices telles que ZO-1, la calcium calmoduline serine thréonine kinase
(CASK), la membrane-associée guanylate kinase (MAGI-1) ou encore les
protéines de polarité Par-3 et Par-6 (5). Les interactions cellules-cellules à la
jonction serrée sont stabilisées par les jonctions adhérentes qui sont entremêlées
avec les jonctions serrées.
Figure 1.3. Schéma des jonctions serrées inter-endothéliales et des protéines intégrales impliquées dans la régulation
paracellulaire, telles que définies dans le texte. (26) [tiré intégralement]
Les jonctions serrées restreignent fortement le transport paracellulaire et forcent
donc les molécules hydrophiles à emprunter la voie transcellulaire. De manière
générale, le transport transcellulaire à travers la BHE peut être classifié en cinq
grandes catégories: le passage par transporteur, le passage d'ions, le transport
actif d'efflux, le transport médié par un récepteur et le transport médié par les
cavéoles (5). Les transporteurs qui assurent le passage des nutriments au cerveau
incluent le transporteur de glucose GLUT1, plusieurs transporteurs d'acides
aminés ainsi que des transporteurs de nucléosides, nucléobases et autres
substances (13). De même, les cellules endothéliales expriment des transporteurs
spécifiques qui permettent d'éliminer les déchets du système nerveux central vers
6la circulation sanguine (27). Ces différents transporteurs peuvent être
bidirectionnels, tel que GLUT1, et transporter les substances à l'encontre du
gradient de concentration et se retrouver du côté luminal ou abluminal, ou les
deux. Ainsi, la polarité apicale-basale des cellules endothéliales cérébrales se
reflète donc dans leur fonction de transport polarisé et est maintenue en condition
physiologique. Les cellules endothéliales du cerveau expriment aussi de manière
très faible une activité de transcytose qui est cependant augmentée en condition
de dysfonction de la BHE lors de conditions pathologiques. La transcytose à
travers les cellules endothéliales est médiée par des vésicules de cavéoline.
Cavéoline-1 est exprimée par toutes les cellules endothéliales du corps mais son
expression est augmentée suite à un traumatisme crânien ou en conditions
hypoxiques (28). De plus, l'expression de la protéine associée aux vésicules de
plasmalemma (PLVAP) est normalement élevée dans les cellules endothéliales de
la périphérie et relativement faible dans les cellules endothéliales du cerveau.
Cette protéine est impliquée dans le trafic de vésicules ainsi que dans la formation
de fenestration et son expression semble être augmentée dans l'endothélium
cérébral dans une variété de conditions pathologiques où il y a atteinte à la BHE,
tel que l'ischémie (29). Par conséquent, l'absence d'expression de PLVAP dans les
cellules endothéliales du système nerveux sain semble être importante pour limiter
la perméabilité de la BHE.
1.2.2 L'unité neurovasculaire en condition ischémique
Ainsi, l'homéostasie créée par la synergie des composants de l'unité
neurovasculaire ainsi que par le contrôle fin de la perméabilité par la BHE est
nécessaire au bon fonctionnement du cerveau. Cependant, en conditions
pathologiques, l'unité devient dysfonctionnelle et peut détériorer les mécanismes
de réparation du cerveau (30, 31). Par exemple, l'ischémie cérébrale va initier une
cascade complexe d'évènements pathophysiologiques qui évolueront dans le
temps et l'espace et qui incluent plusieurs mécanismes qui aggraveront le
dommage initial: excitoxicité, dépolarisations péri-infarctus, inflammation et mort
cellulaire programmée (Fig 1.4) (3).
7Figure 1.4. La cascade ischémique. Cascade putative d'événements dommageables dans l'ischémie cérébrale focale.
Très tôt après le début du déficit de perfusion focale, les mécanismes excitotoxiques peuvent endommager létalement les
neurones et les autres cellules. En outre, l'excitotoxicité déclenche un certain nombre d'événements qui peuvent
contribuer davantage au dommage du tissu. De tels événements comprennent les dépolarisations péri-infarctus et les
mécanismes plus retardés de l'inflammation et de la mort cellulaire programmée. L'axe des abscisses reflète l'évolution
de la cascade dans le temps, tandis que l'axe des ordonnées vise à illustrer l'impact de chaque élément de la cascade
sur le résultat final. (3) [tiré intégralement]
Perte d'énergie et excitoxicité
L'arrêt brusque de l'irrigation sanguine causée par un caillot sanguin lors d'un AVC
va diminuer de manière drastique les niveaux d'oxygène et de glucose ainsi que la
disponibilité des substrats pour la phosphorylation oxydative tels que la
nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) (32). Le cerveau est incapable de
survivre en respiration cellulaire anaérobie et dépend donc uniquement de la
phosphorylation oxydative pour subvenir à ses besoins élevés en adénosine
triphosphate (ATP) pour son fonctionnement normal (3). Ainsi, 30 minutes après
un AVC, la concentration en ATP dans les cellules est déplétée et la plupart des
processus cellulaires ATP-dépendant sont compromis. Particulièrement, les
pompes ioniques Na+/K+ et Ca2+/H nécessaires au maintient d'un gradient d'ions et
au potentiel de membrane des cellules arrêtent de fonctionner (33). L'accumulation
de sodium, de calcium et de bicarbonate à l'intérieur des cellules induit la diffusion
passive d'eau dans le cytoplasme et cause un œdème cytotoxique (34). L'œdème
est un facteur crucial dans la mortalité de patients puisqu'il inhibe la perfusion des
cellules péri-infarctus et augmente la pression intracrânienne (35). L'arrêt des
pompes ioniques entraîne aussi la perte du potentiel de membrane et donc la
dépolarisation massive des neurones et des cellules gliales du cerveau (36). Cette
8dépolarisation entraîne l'activation des canaux calciques (Ca 2+) voltage-
dépendants présynaptiques qui vont libérer dans l'espace extracellulaire du
glutamate, un acide aminé excitateur (37, 38). Le mécanisme de recapture de ce
neurotransmetteur par le transporteur de glucose GLUT-1 étant aussi dérégulé, le
glutamate atteint des niveaux très élevés dans le milieu extracellulaire et dans la
fente synaptique (39). Cette concentration anormale de glutamate extracellulaire
active les récepteurs perméables aux ions monovalents tels que le récepteur N-
méthyl-D-aspartate (NMDA) et le récepteur α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoazol-4-
propionate (AMPA) et cause l'entrée de Ca2+ dans la cellule (40).
Stress oxydatif et nitrosatif
Le Ca2+ est un second messager universel important dans la cellule et coordonne
plusieurs processus métaboliques et signalétiques. Son augmentation
intracellulaire à des niveaux anormaux entraînera une série d'évènements
nucléaires et cytoplasmique qui influenceront profondément l'apparition et le
développement des dommages. D'abord, il entraîne l'activation d'enzymes
protéolytiques qui dégraderont les protéines du cytosquelette telles que l'actine et
la spectrine ainsi que les protéines de la matrice extracellulaire comme la laminine,
compromettant l'intégrité des cellules et de la vasculature (41, 42). Ensuite,
l'augmentation de calcium intracellulaire induit la production de dérivés réactifs de
l'oxygène (ROS) et d'oxyde nitrique (NO). Ces radicaux libres vont causer des
dommages à la membrane via la peroxydation des lipides et vont promouvoir
l'activation des mécanismes d'apoptose (43, 44). La phospholipase A2 sera aussi
activée par les niveaux élevés de calcium, ce qui relâchera de l'acide
arachidonique qui à son tour engendra la production d'anion superoxyde O2.- par la
voie du cyclo-oxygénase. La Ca2+/calmoduline-dépendante oxyde nitrique
synthase est aussi activée et synthétise de l'oxyde nitrique (NO) qui interagit avec
le O2.- pour former du peroxynitrite (ONOO-), un oxydant hautement instable qui
interagit et endommage l'ADN, les protéines et d'autres composants cellulaires
(45). Des radicaux libres sont aussi produits par la mitochondrie lors de la
reperfusion et entraînent un dommage supplémentaire appelé dommage de
9reperfusion. Les ROS et le calcium intracellulaire promeuvent le gonflement de la
mitochondrie et la rupture de son potentiel membranaire, la rendant incapable de
générer de l'ATP. De même, cela cause la relâche additionnelle de radicaux libres
dans l'espace intracellulaire et éventuellement la mort cellulaire (46). En somme, le
stress oxydatif et nitrosatif induisent des processus fortement préjudiciables qui
vont enclencher autant la formation de dommages structuraux que le
déclenchement des processus de mort cellulaire.
Dépolarisations péri-infarctus
Une autre conséquence de l'augmentation de glutamate et de potassium dans
l'espace extracellulaire est la formation de vagues de dépolarisation. En effet, au
cœur de la lésion, les neurones se dépolarisent selon le mécanisme expliqué plus
haut mais ne pourront jamais se repolariser en raison du manque crucial d'énergie.
Cependant, dans la pénombre, les cellules parviennent lentement à rétablir leur
potentiel de membrane et le tissu endure donc des vagues massives de
dépolarisations qui peuvent durer des heures et qui vont se transmettre aux tissus
environnants (47). Ces dépolarisations en vagues ne causent pas de dommages
aux tissus sains puisqu'ils sont en mesure de se repolariser rapidement et de
rétablir leurs gradients ioniques. Cette alternance polarisation-dépolarisation va
cependant épuiser les réserves énergétiques des cellules qui sont déjà fortement
éprouvées par les processus de la cascade ischémique et contribuer à augmenter
le volume de la lésion, induisant la transition entre la région pénombre vers des
régions du cœur (48). Les dépolarisations péri-infarctus peuvent aussi induire des
dommages structuraux aux épines dendritiques qui sont seulement réversibles en
présence d'un débit sanguin adéquat (49). Il a été démontré que des antagonistes
des récepteurs NMDA, un récepteur ionotrope activé par le glutamate, administrés
chez le rat ont pour effet de réduire les dépolarisations et diminuer le volume de la
zone ischémique (50). En résumé, des évènements électriques normalement bien
tolérés dans le parenchyme cérébral sain causent des effets dévastateurs dans la
zone pénombre en raison du microenvironnement chimique et ionique altérés par
la cascade ischémique.
10L'inflammation
L'inflammation fait partie intégrante de la réponse suite à l'ischémie cérébrale et
est caractérisée par l'activation des cellules gliales résidentes, par l'infiltration des
leucocytes dans le cerveau et par la production de cytokines pro-inflammatoires.
Le système immunitaire remplit normalement un rôle bénéfique dans le corps en
éliminant les agents étrangers qui menacent l'intégrité des tissus. Cependant, en
condition ischémique, le système immunitaire peut promouvoir une réponse
inflammatoire chronique qui exacerbe les dommages cellulaires et compromet la
viabilité de la pénombre ischémique en empêchant ou en favorisant le recrutement
de certaines cellules à la lésion (51). La réponse neuroinflammatoire stimule les
cellules gliales, plus précisément les microglies et les astrocytes, qui entourent les
neurones endommagés. Ces cellules contribuent normalement à la santé
neuronale. Les microglies rétractent leurs processus et adoptent alors une
morphologie amiboïde qui est caractéristique de leur activation tandis que les
astrocytes deviennent hypertrophiques (52). Une fois activées, les cellules gliales
sécrètent des médiateurs pro et anti-inflammatoires qui vont promouvoir l'œdème,
l'angiogenèse et la plasticité, dégrader des protéines, phagocyter les débris et
compromettre la BHE (51, 53, 54). Ces médiateurs incluent des cytokines pro-
inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale (TNF-α), l'interleukine-1β
(IL-1β), des médiateurs de l'inflammation comme le facteur d'activation plaquettaire
(PAF), des chimiokines telles que la protéine chimiotactique des monocytes (MCP-
1) et des métalloprotéinases matricielles (MMP) (54). En plus d'être libérées par
les cellules immunitaires, certaines cytokines vont être libérées par les neurones
endommagés. Ces médiateurs vont aggraver la lésion ischémique en favorisant
encore plus la sécrétion de cytokines et de molécules d'adhésion, en activant les
cellules gliales et en inhibant la recapture de glutamate dans les cellules (55). En
parallèle, la réponse inflammatoire a aussi des effets bénéfiques sur la lésion.
Lorsque des cellules deviennent ischémiques, les microglies migrent et entourent
ces cellules de manière à ce qu'elles soient rapidement éliminées de
l'environnement et ne puissent pas libérer le contenu toxique de leur cytoplasme
(56). De plus, les astrocytes vont former ce qu'on appelle une cicatrice gliale au
11pourtour de la lésion pour prévenir les infections et la création d'autres dommages
cellulaires (57). Des cytokines anti-inflammatoires et des facteurs de croissance
comme le facteur neurotrophique issu du cerveau (BDNF) et le facteur neurotrophe
dérivé de la glie (GDNF) sont libérés et ont des effets neuroprotecteurs en
promouvant la survie cellulaire (54). Par exemple, le facteur de croissance
transformant (TGF-β) et IL-10 sont les deux médiateurs anti-inflammatoires
majeurs retrouvés après un AVC qui sont capables de diminuer le dommage
tissulaire. Ils sont capable de diminuer l'activation des cellules gliales et vont
inhiber la sécrétion de IL-1β et TNF-α (51, 53). Certaines cytokines peuvent avoir
des effets mixtes. Par exemple, TNF-α aura un effet pro-inflammatoire ou anti-
inflammatoire dépendamment de sa liaison avec le récepteur TNFR1 ou TNFR2
(52). De plus, l'AVC induit la libération d'une autre catégorie de médiateurs
inflammatoires, les chimiokines. Les chimiokines sont dans la famille des cytokines
et sont impliquées dans la migration des cellules immunitaires et inflammatoires,
telles que les neutrophiles et les monocytes. Les chimiokines sont généralement
peu exprimées dans un cerveau en condition physiologique mais l'ischémie
cérébrale en induit la production rapide et cause l'infiltration des cellules
immunitaires de la circulation (58). En effet, les molécules d'adhésion exprimées à
la surface des cellules endothéliales lésées comme la molécule d'adhésion
intercellulaire (ICAM-1), VCAM-1 ou les P-sélectines et E-sélectines vont
s'associer avec les récepteurs complémentaires spécifiques présents sur les
leucocytes et les monocytes (59, 60). S'ensuit alors les étapes de la diapédèse,
soit le mécanisme par lequel les cellules immunitaires traversent les cellules
endothéliales d'un vaisseau sanguin ou d'un capillaire dans l'objectif de migrer à la
zone lésée. La délétion de ICAM-1 ou P-sélectine induit des lésions ischémiques
plus petites et une plus faible infiltration de neutrophiles, suggérant que ces
molécules modulent le dommage ischémique durant la réponse inflammatoire (61).
Chez l'humain toutefois, un essai clinique avec des anticorps anti-ICAM-1 s'est
avéré inefficace et a même aggravé les signes cliniques des patients (62). Il
semblerait donc que l'inflammation peut aggraver les lésions suite à un AVC selon
différents mécanismes. Par exemple, les leucocytes recrutés dans les micro-
12vaisseaux peuvent les obstruer et induire de l'hypoxie (ce qu'on appelle le
phénomène de no-reflow) (63) ou les médiateurs toxiques sécrétés par les cellules
inflammatoires activées comme l'iNOS qui induit l'oxyde nitrique et qui est un gaz
toxique pour les cellules (64). Ainsi, le rôle néfaste ou bénéfique de l'inflammation
dans la guérison des dommages liés à l'AVC reste ambigü et est encore
aujourd'hui un sujet de débats dans la littérature.
L'apoptose
L'ischémie cérébrale, en causant l'activation excessive des récepteurs glutamates,
la surchage de Ca2+, l'expression de radicaux libres et des dommages
mitochondriaux ou à l'ADN, va pousser les cellules à mourir soit par apoptose ou
par nécrose (65). La nécrose est le processus de mort cellulaire principal qui se
produit dans le cœur de la lésion et survient durant les premières phases de l'AVC
tandis que l'apoptose survient plus tardivement et est plus observé dans la zone
pénombre (3). Contrairement au démantèlement cellulaire de l'apoptose qui est un
processus contrôlé et organisé, la nécrose implique des dommages à la
membrane cellulaire et aux organelles. Les principales caractéristiques de la
nécrose sont l'agglutination de la chromatine, le gonflement et la dégénérescence
des organites, plus particulièrement de la mitochondrie, la destruction de l'intégrité
membranaire pour finir avec la dissolution de la cellule et le déversement de son
contenu dans l'espace extracellulaire. Puisque le déversement de ce contenu
contient des débris intracellulaires antigéniques actifs, il est accompagné d'une
réponse inflammatoire qui va alors causer une infiltration leucocytaire et de
l'œdème tissulaire. Les enzymes protéolytiques relâchées sont aussi capables
d'aller endommager les cellules environnantes, exacerbant le dommage (66).
L'apoptose se manifeste dans un intervalle de temps pouvant aller à des jours ou
des semaines après le début de l'AVC et est principalement confinée en dehors du
cœur de la lésion. L'apoptose est un processus actif dépendant de l'expression de
gènes spécifiques qui vont mener à l'autodestruction cellulaire et implique les
caspases (67). Au niveau morphologique, il y a d'abord la condensation de la
chromatine puis du cytoplasme qui est associé avec la formation de vacuoles
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