RÔLE D'UNE MUTATION GAIN DE FONCTION DE CXCR4 DANS LA TAILLE DU COMPARTIMENT MÉMOIRE DES LYMPHOCYTES T CD8 - Pierre-Edouard Debureaux Stage de ...
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RÔLE D’UNE MUTATION GAIN DE FONCTION DE CXCR4 DANS
LA TAILLE DU COMPARTIMENT MÉMOIRE DES
LYMPHOCYTES T CD8
Pierre-Edouard Debureaux
Stage de Master 2 – Supervision : Dr. Mélanie Wencker
SFH 2021 – Jeudi 8 septembre 2021
VIE D’UN LYMPHOCYTE T CD8
Lymphocytes T CD8
Nombre de cellules
TCR
Co-signaux
CPA
Antigène
Cellules cancéreuses ou
infectées par un virus Temps après infection/cancer
VIE D’UN LYMPHOCYTE T CD8
Expansion
Lymphocytes T CD8
Nombre de cellules
Cellules cancéreuses ou
infectées par un virus Temps après infection/cancer
VIE D’UN LYMPHOCYTE T CD8
Expansion Contraction
Lymphocytes T CD8
Nombre de cellules
Temps après infection/cancer
VIE D’UN LYMPHOCYTE T CD8
Expansion Contraction Mémoire
(6 semaines)
Lymphocytes T CD8
Nombre de cellules
▪ Maintien d’un pool de cellules antigène-
spécifique
▪ Nouvelle rencontre -> réponse robuste et
rapide
Temps après infection/cancer
GÉNÉRATION D’UN POOL DE LYMPHOCYTES MÉMOIRES
Lymphocytes T
CD8 mémoires
Intensité du signal TCR Co stimulation Métabolisme Cytokines
Tissus préalablement inflammés, organes lymphoïdes secondaires
(rate, moelle osseuse [MO], ganglions lymphatiques [GG])
Lim et al. Cell 2016
MAINTENANCE D’UN POOL DE LYMPHOCYTES MÉMOIRES
Lymphocytes T
CD8 mémoires
IL-7 IL-15
Prolifération /Survie
Cellules
Cui et al. PNAS 2014
MAINTENANCE D’UN
CHIMIOKINE POOL DEDE
: PRINCIPE LYMPHOCYTES MÉMOIRES
FONCTIONNEMENT
Lymphocytes T
CD8 mémoires
Récepteur aux
chimiokines
ChimiokineMAINTENANCE D’UN
CHIMIOKINE POOL DEDE
: PRINCIPE LYMPHOCYTES MÉMOIRES
FONCTIONNEMENT
Lymphocytes T
CD8 mémoires
ChimiokineMAINTENANCE D’UN POOL DE LYMPHOCYTES MÉMOIRES
Lymphocytes T
CD8 mémoires CXCR4
CXCL12
IL-7 IL-15
Prolifération / Survie
Cellules stromales Moelle
et réticulaires
osseuse
Cui et al. PNAS 2014Impact de CXCR4 sur la maintenance des lymphocytes T CD8 mémoires ?
AXE CXCR4-CXCL12
Warts (Verrue)
Normal Syndrome WHIM Hypogammaglobulinémie
Infections bactérienne
Myelokathesis
CXCL12 CXCL12
NH2 NH2
Extracellulaire
CXCR4 CXCR4 .
P Intracellulaire
P
COOH COOH
3 3
Désensibilisation Désensibilisation
Internalisation 1 1
Internalisation
B-arrestin Activation B-arrestin Activation
2 2
Migration Migration
Liu et al. Blood, 2012 / Morgan O'Hayre et al. Biochem. J. 2008 / Balabanian et al. Blood, 2012AXE CXCR4-CXCL12
Warts (Verrue)
Normal Syndrome WHIM Hypogammaglobulinémie
Infections bactériennes
Myelokathesis
CXCL12 CXCL12
NH2 NH2
Extracellulaire
CXCR4 CXCR4 .
P Intracellulaire
P
COOH COOH
3 3
Désensibilisation Désensibilisation
Internalisation 1 1
Internalisation
B-arrestin Activation B-arrestin Activation
2 2
Migration Migration
Liu et al. Blood, 2012 / Morgan O'Hayre et al. Biochem. J. 2008 / Balabanian et al. Blood, 2012MODÈLE D’ÉTUDE : INFECTION PAR VIRUS DE LA VACCINE
Lymphocytes T CD8
Virus vaccine (VV)
TCR transgénique F5
NP68MODÈLE D’ÉTUDE : CO-TRANSFERT
F5-WT F5-CXCR4WHIM
CD45.1+/CD45.2- CD45.1-/CD45.2+
Co-transfert de
lymphocytes T CD8+ naïfs
F5-WT F5-CXCR4WHIM
Virus Vaccine-NP68
Infection intra-nasale
Mutation CXCR4WHIM
uniquement au sein des CD8
CD45.1+/CD45.2+
Hôte
J-2 J0MODÈLE D’ÉTUDE : CO-TRANSFERT
Co-transfert de
lymphocytes T CD8+ naïfs
F5-WT F5-CXCR4WHIM
Virus Vaccine-NP68
Infection intra-nasale Suivi par cytométrie en flux
Mémoire → CD44+
CD45.1+/CD45.2+
Hôte
J-2 J0 Phase mémoire (> 6 semaines)RÉSULTATS PRÉLIMINAIRES (1)
Répartition des lymphocytes T CD8 F5-WT et F5-CXCR4WHIM parmi les F5
GG Rate Poumon MO
Distribution préférentielle dans la moelle osseuse des F5-CXCR4WHIMRÉSULTATS PRÉLIMINAIRES (2)
Nombre absolu de Lymphocytes T F5 CD8+ (Somme de GG+MO+Rate+Poumon)
6 semaines post infection > 1 an post infection
p= 0,0313
1.5×106 1.5×107
Abs Nbs F5-CD8 T-cells
Abs Nbs total F5-CD8+
1.0×106 1.0×107
5.0×105 5.0×106
0.0 0.0
WT CXCR4Whim WT CXCR4Whim
Augmentation F5-CXCR4WHIM au cours du temps (MO > sang > rate)OBJECTIFS
Lymphocytes T Phase mémoire à très long terme
CD8 CXCR4WHIM (> 18 mois)
Mécanismes
Application en immunothérapie : CAR T CellsGATING EN CYTOMÉTRIE EN FLUX (CMF)
Co-transfert lymphocytes
T CD8 naif
F5-WT et F5-CXCR4WHIM
F5-WT F5-CXCR4WHIM
CD45.1+/CD45.2- CD45.1-/CD45.2+
Infection pulmonaire par
virus de la vaccine-NP68
CD45.1+/CD45.2+
Hôte
Sacrifice à 18 mois post
infection et analyse en
CMFNOMBRE TOTAL DE LYMPHOCYTES T CD8 EN PHASE MÉMOIRE
Nombre absolu de Lymphocytes T F5 CD8+ CD44+ (Somme de GG+MO+Rate+Poumon)
> 18 mois post infection
0.0342
10 7
10 6
10 5
10 4
Lymphocytes T CD8+ CD44+ avec mutation CXCR4WHIM > WT
N=12 , Expériences indépendantes = 3ANALYSE PAR ORGANE
Ratio : Nombre de lymphocytes F5 T CD8 mémoires CXCR4WHIM / WT
40
30
20
10
6
4
2
Ratio 1:1
0
MO Rate Poumon GG
Lymphocytes T CD8+ CD44+ CXCR4WHIM > WT dans les organes
MO -> localisation préférentielle
N=12 , Expériences indépendantes = 3OBJECTIFS
Lymphocytes T Phase mémoire à très long
CD8 CXCR4WHIM terme (> 18 mois)
Mécanismes :
Prolifération et Survie
Application en immunothérapie : CAR T CellsKI67 : ANALYSE DE PROLIFÉRATION
Organes Analyse ex-vivo Ki67 : marqueur de cellule en cycle (cytométrie en flux)
Pas de différence de % de prolifération
Nombre de lymphocytes T F5 CD8+ CD44+ en cycle
Ki67+ Ki67-
0.0342 0.03 0.03 0.20
1×10 7
1×10 6
1×10 5
1×10 4
1×10 3
1×10 2
1×10 1
1×10 0
Rate MO Poumon Ganglion
Nombre de F5-CXCR4WHIM en cycle > F5-WT
→ accumulation au long cours ? N=12 , Expériences indépendantes = 3CAPACITÉ DE SURVIE
Rate MO Culture 2 jours Mortalité sur marqueur de viabilité
Mortalité lymphocytes T F5 CD8+ CD44+
Proportion (%) Valeur absolue
0.0024 0.004 0.38 0.0005
1×10 7
100
1×10 6
80
1×10 5
60 1×10 4
1×10 3
40
1×10 2
20
1×10 1
0 1×10 0
Rate MO Rate MO
Avantage de survie pour F5-CXCR4WHIM N=12 , Expériences indépendantes = 3OBJECTIFS
Lymphocytes T Phase mémoire à très long
CD8 CXCR4WHIM terme (> 18 mois)
Mécanismes
Application en immunothérapie : CAR T CellsL’AVÈNEMENT DES CAR T CELLS Expression d’un récepteur Chimérique = CAR
EFFICACITÉ DANS LA LEUCÉMIE AIGUE LYMPHOBLASTIQUE B MAIS…
Avant CAR T CELLS Avec CAR T CELLS de 2ème génération anti-CD19
Survie globale
70%
30%
Kantarjian et al. New England 2017 // Dourthe et al. Leukemia 2021…MAIS PRÉSENCE DE RECHUTE
Incidence cumulée de rechute
45%
Dourthe et al. Leukemia 2021DÉFAUT DE PERSISTANCE DES CAR T CELLS
% (nombre) de patients avec CAR T CELLS détectables dans le sang
Nombre total de patients
Mois
Maude et al. Blood 2018RECHUTE DES CAR T CELLS
Perte d’aplasie B :
effet off-tumor on-target des CAR T CELLS anti-CD19 et reflet de la persistance des CAR T Cells
CD19 Incidence cumulée de rechute CD19+
scFv anti-CD19
LAL B
CAR T CELLS Perte précoce aplasie B
anti-CD19
p=0,01
Lymphocytes Pas de perte précoce aplasie B
B normaux
CD19
Années
Dourthe et al. Leukemia 2021Comment améliorer la persistance des CAR T CELLS ?
APPLICATION EN IMMUNOTHÉRAPIE
Ac-CD19
CD28TM CD28 CD3z P2A
(FMC63)
Ac-CD19
CD28TM CD28 CD3z P2A
(FMC63) WT Humain
CXCR4
Signal
Présent sur lymphocyte B
Costimulation intracellulaire
(lymphome B et LAL B)
voie du TCR
Ac-CD19
CD28TM CD28 CD3z P2A
(FMC63) CXCR4WHIMEXPÉRIENCE DE TRANSFECTION
Ac anti-Biotin-PE
Plasmide Ag CD19-biotin
scFv anti-CD19
Cytométrie
Transfection en flux
CXCR4
Culture dans DMEM
Ac anti-CXCR4-biotin
HEK 293T
Streptavidin-PEEXPÉRIENCE DE TRANSFECTION
Vide CAR CAR + CXCR4
scFv anti-CD19
CXCR4CONCLUSION Phase mémoire à très long terme : • Pool de lymphocytes T CD8 mémoires avec la mutation CXCR4WHIM supérieur au pool de WT Mécanismes potentiels : • Capacité de survie augmentée • Pas de différence de proportion de prolifération • Plus grande nombre de cellules en cycle Début de production d’un modèle de CAR T CELLS : • Validation des plasmides • Capacité de transfection
PERSPECTIVES
Ki 67 + DNA staining (prolifération), Tunnel assay (survie)
Co-transfert dans modèles tumoraux (murins)
CAR T CELLS → lymphome (collaboration Dr Saitaki et Dr Amigorena)MERCI DE VOTRE ATTENTION
Equipe du Dr Jacqueline Marvel :
Dr Mélanie Wencker Severine Valsesia, Sophia Djebali, Dr Mathilde
Calvez, Daphné Laubreton, Candice Sakref, Lyvia
Moudombi, Olivia Taty, Dr Yann Leverrier
Dr Emiliano Ricci, Dr David Cluet, Laura Guiguettaz
Thibaut Sohier, Dr Emmanuel Labaronne, Dr Anissa Guillemain, Dr Christelle Morris
Dr Sebastian Amigorena, Dr Karl Balabanian :
Dr Michael Saitaki
modèle de souris CXCR4WHIM
ARS Ile de France / APHP :
Plateau de cytométrie Animalerie PBES
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