Ontogenèse du microbiote chez le poisson vivipare Brachyistius frenatus. Transmission verticale de symbiotes microbiens pionniers? - Mémoire ...
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Ontogenèse du microbiote chez le poisson vivipare
Brachyistius frenatus. Transmission verticale de
symbiotes microbiens pionniers?
Mémoire
Aurélie Boilard
Maîtrise en biologie - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Aurélie Boilard, 2021
Ontogenèse du microbiote chez le poisson vivipare
Brachyistius frenatus. Transmission verticale de
symbiotes microbiens pionniers?
Mémoire
Aurélie Boilard
Sous la direction de :
Nicolas Derome, directeur de recherche
Résumé
Chez les Mammifères, le recrutement du microbiote débute in utero, ce qui restait à démontrer chez
d'autres classes de Vertébrés. L’objectif général du projet était de tester si un tel recrutement se
produit chez un Vertébré non Mammifère. Nous avons testé, chez le Poisson vivipare Brachyistius
frenatus, l'hypothèse selon laquelle la poche utérine est colonisée par un microbiote transmissible
aux alevins, conférant à leur propre microbiote une ontogenèse semblable à celle des Mammifères.
Le projet visait l’atteinte des objectifs suivant : i) caractériser le mode de transmission du
microbiote, ii) établir la composition, la diversité et les relations des communautés bactériennes du
microbiote des femelles, des juvéniles et de leur environnement et iii) déterminer l’ontogenèse du
microbiote chez B. frenatus. Ce projet a permis de caractériser le mode de transmission du
microbiote, sa séquence de recrutement, ainsi que la contribution respective de différentes
communautés sources en caractérisant la diversité bactérienne du microbiote des femelles, des
juvéniles et de leur environnement avec une approche métagénomique de type code barre. La région
V4 du gène de l'ARNr 16S a été ciblée comme marqueur taxonomique bactérien pour identifier les
taxons des différents échantillons. Cette étude nous a permis d’identifier le premier cas d’une
transmission verticale du microbiote in utero chez un vivipare non Mammifère et les résultats sous-
entendent que B. frenatus est peut-être un tout nouveau modèle d’ontogenèse du microbiote. Cette
étude a permis l’acquisition des connaissances sur la transmission du microbiote et, dans le contexte
de convergence évolutive de la viviparité, elle ouvre à de nouvelles perspectives quant aux
avantages évolutifs d'une telle transmission de symbiotes microbiens.
ii
Abstract
In Mammals microbial recruitment starts in utero, something that had not been shown in any other
Vertebrate class. The main goal of this project was to test whether this type of recruitment happens
in a non-mammalian Vertebrate. We tested in the viviparous fish Brachyistius frenatus the
hypothesis under which the uterine pouch is colonized by a microbiome transmissible to the
juveniles, conferring them an ontogeny similar to Mammals. This project also aimed to i)
characterize the mode of transmission of the microbiota, ii) establish the composition, diversity and
relationships between the microbial communities of pregnant females, juveniles and their
environment and iii) determine the ontogeny of the microbiota in B. frenatus. We characterized the
mode of transmission of the microbiome, explored its recruitment and the contribution of different
source communities with a metagenomic approach (bar coding). We targeted the hyper variable
region V4 of the small subunit (16S) rRNA gene to determine the presence of a vertical
transmission of the microbiome In this study, we confirmed the presence of a vertically
transmissible microbiome in the viviparous fish B. frenatus. We documented for the first time an in
utero transmission of the microbiota in a non-mammalian viviparous species. Our results also hint
that B. frenatus might be a new model of microbiota ontogeny. This study contributes to the
acquisition of knowledge on microbiome transmission and, in the context of evolutionary
convergence of viviparity, allows the formulation of hypotheses concerning the evolutionary
advantages of in utero microbiome transmission.
iii
Table des matières
Résumé ................................................................................................................................................ ii
Abstract............................................................................................................................................... iii
Table des matières .............................................................................................................................. iv
Glossaire .............................................................................................................................................. v
Remerciements .................................................................................................................................. vii
Avant-propos .................................................................................................................................... viii
Introduction ......................................................................................................................................... 1
1.1 Stratégies de reproductions chez les Vertébrés ......................................................................... 1
1.2 L’holobionte .............................................................................................................................. 2
1.2.1 L’importance du microbiote pour la santé de l’hôte ......................................................... 2
1.2.2 L’acquisition du microbiote chez les Mammifères ............................................................ 5
1.2.3 L’ontogenèse et stratégies d’acquisition initiale du microbiote........................................ 6
1.3 Approche expérimentale ............................................................................................................ 8
1.4 Brachyistius frenatus, espèce modèle pour notre étude ............................................................ 9
1. 5 Objectifs et hypothèses ........................................................................................................... 11
Chapitre 1 Viviparity : cutting edge strategy for microbiota ontogeny ............................................. 12
1.1 Résumé .................................................................................................................................... 12
1.2 Abstract.................................................................................................................................... 12
Introduction ................................................................................................................................... 13
Methodology.................................................................................................................................. 16
Sampling and dissections .......................................................................................................... 16
Bacterial DNA extraction and amplification ............................................................................ 16
Bioinformatic analyses ............................................................................................................. 17
Statistical analyses .................................................................................................................... 17
Results ........................................................................................................................................... 19
Discussion...................................................................................................................................... 21
Conclusion ..................................................................................................................................... 27
Acknowledgements ....................................................................................................................... 28
Conflicts of Interests...................................................................................................................... 28
References ..................................................................................................................................... 29
List of tables and figures ............................................................................................................... 33
Conclusion ......................................................................................................................................... 45
Bibliographie ..................................................................................................................................... 48
Annexe A : Supporting informations ................................................................................................ 58
iv
Glossaire
ARNr 16S
Sous unité 16S du gène de l’ARN ribosomique mitochondrial (ARNr 16S). Fréquemment utilisé
comme marqueur taxonomique bactérien puisque ces régions hyperconservées sont entourées de
régions hypervariables, qui permettent l’identification des taxons bactériens jusqu’au genre ou à
l’espèce.
Acquisition horizontale du microbiote
Acquisition de symbiotes microbiens par contact direct avec l’environnement.
Acquisition verticale du microbiote
Transmission de symbiotes microbiens d’un parent à sa progéniture.
Dysbiose
État de déséquilibre entre le microbiote et l’hôte, peut être causé par différents facteurs intrinsèques
et extrinsèques, mène potentiellement à des maladies voir à la mort.
Eubiose
État d’équilibre au sein de l’holobionte.
Gonopodium
Modification de la portion antérieure de la nageoire anale chez les mâles de B. frenatus qui forme
une structure complexe tubulaire pour le transfert du sperme lors de la reproduction.
Holobionte
La combinaison de l’organisme hôte et de son microbiote en tant qu’unité interdépendante.
Lécithotrophie
Stratégie de nutrition du juvénile chez les vivipares au cours du développement in utero où les
nutriments proviennent d’un vitellus.
Longueur standard
Méthode de mesure des poissons allant de l’extrémité de la bouche à celle de la queue (i.e. base de
la nageoire caudale).
Longueur totale
Méthode de mesure des poissons allant de l’extrémité de la bouche jusqu’à celle de la queue.
v
Matrotrophie
Stratégie de nutrition du juvénile chez les vivipares au cours du développement in utero où les
nutriments sont exclusivement de provenance maternelle.
Microbiote
Ensemble des microorganismes (Archées, Bactéries, Virus, et Eucaryotes unicellulaires) colonisant
les surfaces corporelles d’un organisme hôte.
Ontogenèse
Processus du développement et maturation d’un juvénile, de la fécondation à l’âge adulte.
Ontogenèse du microbiote
Processus de la formation du microbiote par le recrutement et la sélection (active et passive) de
souches microbiennes tout au long du cycle de vie de l’organisme hôte.
PCR
Technique moléculaire pour amplifier de l’ADN : Réaction de polymérase en chaîne, « Polymerase
Chain Reaction ».
Poche utérine
Ovaire modifié en une structure formant un réseau de poches interconnecté pour le développement
des juvéniles chez les poissons vivipares de la famille des Embiotocidae.
vi
Remerciements
Je tiens à remercier mon Directeur, Nicolas Derome, et Giacomo Bernardi, collabotateur du projet,
pour m’avoir donné l’occasion de travailler sur un projet aussi ambitieux et passionnant, et pour
leur soutien tout au long du projet. Je tiens aussi à remercier May Roberts, Daniel Wright et Alessio
Bernardi pour leur participation aux efforts d’échantillonnage, sans lesquels le projet n’aurait pu
avoir lieu. Un grand merci à la chercheure Rachel Meyers pour m’avoir permis de travailler dans
son laboratoire et bénéficier des équipements nécessaires pour la réalisation des travaux laboratoires
(dissections et extractions d’ADN) en conditions stériles. Un merci tout particulier à Jim et Midjann
Velzy de m’avoir accueilli chez eux durant mon séjour à Santa Cruz et durant la pandémie. Merci à
Sidki Bouslama et François-Étienne Sylvain pour leurs contributions aux analyses bioinformatiques
et aussi à tous les membres des équipes des laboratoires Derome et Bernardi.
Le soutien financier du Conseil de Recherche en Sciences Naturelles et en Génie (CRSNG), du
Fond de Recherche Québec – Nature et Technologies (FRQNT) et de Ressources Aquatiques
Québec (RAQ) a permis la réalisation de ce projet.
vii
Avant-propos
L’article joint à ce mémoire de maîtrise ne fait office d’aucun état de publication au moment de la
soumission du mémoire. Toutes modifications proposées suite à la soumission dans le journal choisi
seront dans la version finale de l’article, lors de la publication. L’auteure principale du mémoire, qui
est aussi l’auteure principale de l’article joint à ce mémoire, a participé à toutes les étapes de la
réalisation du projet (échantillonnage, préparation des échantillons, analyses des données) et a
procédé à la rédaction de l’article. Les coauteurs ont participé à la préparation des échantillons
(Pierre-Luc Mercier) et aux analyses bioinformatiques (Sidki Bouslama). Giacomo Bernardi,
collaborateur au projet, a effectué les échantillonnages en mer, coordonné les opérations terrain,
participé à la conception du projet et révisé le manuscrit. Le directeur, Nicolas Derome, a conçu et
coordonné le projet, et révisé le manuscrit.
viiiIntroduction
1.1 Stratégies de reproductions chez les Vertébrés
Lorsqu’il est question de mode de reproduction chez les Vertébrés, il existe deux grandes stratégies
évolutives : l’oviparité et la viviparité. L’oviparité est caractérisée par la production et la ponte
d’œufs par la femelle, dans lesquels les embryons se nourrissent d’une substance riche en réserves
énergétiques, le vitellus (Wourms and Lombardi 1992, Blackburn 1999). Pour sa part, la viviparité
est caractérisée par le développement des jeunes à l’intérieur du tractus reproducteur de la femelle,
avec la mise-bas de jeunes complètement développés (Blackburn 1999, 2015). La viviparité
présente un gradient en ce qui concerne la nutrition fœtale, allant d’un extrême, où les nutriments
sont exclusivement de provenance maternelle (matrotrophie), à l’autre, où les jeunes sont nourris
par un vitellus tout au long de leur développement (lécithotrophie) (Wourms 1981, Blackburn 1992,
2015). Ce qui est appelé ovoviviparité correspond à une série peu définie de stratégies qui se situent
entre l’oviparité et la viviparité, incluant une oviparité avec rétention d’œufs et une viviparité
complètement lécithotrophe (Blackburn 1999).
De manière générale, les Mammifères sont l’exemple par excellence de la viviparité, étant tous
vivipares à l’exception des Monotrèmes (un rare cas d’oviparité matrotrophe) (Blackburn 1999). La
viviparité est cependant un trait beaucoup plus répandu, qui a fait l’objet de convergences
évolutives chez les Vertébrés : au cours de l’évolution, elle est apparue de façon répétée et
indépendante au moins 150 fois dans l’ensemble des classes de Vertébrés, à l’exception des
Oiseaux (Wourms 1981, Blackburn 2015). On note par exemple sa présence chez des espèces telles
que le Requin tigre (Galeocerdo cuvier) chez les Poissons (Whitney and Crow 2007), la
Salamandre tachetée fastueuse (Salamandra salamandra fastuosa) chez les Amphibiens (Buckley et
al. 2007) et le Boa constricteur (Boa constrictor) chez les Reptiles (Bauer 1998).
Les diverses conséquences liées à la viviparité ont été largement documentées en termes de
physiologie (un espace limité menant à une réduction du nombre de jeunes produits et qui peut
affecter négativement la locomotion de la mère et sa capacité à se nourrir (Blackburn 1999)) et
d’écologie (la protection contre les variations des conditions environnementales (Lambert and
Wiens 2013), la prédation et les infections microbiennes (Blackburn 1999)). À ce jour, bien que cet
aspect soit capital (Huurre et al. 2008, Sevelsted et al. 2015, Tamburini et al. 2016), ces avantages
n’ont pas été abordés en ce qui a trait à la transmission verticale de symbiotes microbiens (i.e. de la
mère à sa progéniture).
11.2 L’holobionte
Le microbiote désigne l’intégralité de la flore microbienne symbiotique qui colonise nos surfaces
corporelles et forme des écosystèmes microbiens, appelés microbiomes (O'Hara and Shanahan
2006, Consortium 2010, Clemente et al. 2012, Cui et al. 2016). Des organismes des trois règnes y
sont présents, soit des Bactéries, des Eucaryotes, au moins une espèce d’Archée
(Methanobrevibacter smithii) (Chow et al. 2010, Clemente et al. 2012, Lozupone et al. 2012) et une
grande diversité de virus (Minot et al. 2011, Columpsi et al. 2016, De La Cruz Peña et al. 2018). On
estime que le corps humain (Homo sapiens) serait l’hôte d’environ 3.8*1013 cellules microbiennes
(Sender et al. 2016b, a), ainsi que de 1015 virus (Haynes and Rohwer 2011). La surface cutanée et
les muqueuses (buccales et digestives) sont les principaux habitats colonisés par ces organismes
(Shanahan 2002, Chow et al. 2010, Doré and Corthier 2010). Plusieurs facteurs sont susceptibles
d’influencer la composition du microbiote humain, comme des facteurs environnementaux
(Thompson et al. 2008, Benson et al. 2010, Spor et al. 2011), génétiques (Benson et al. 2010,
Huttenhower et al. 2012, Parks et al. 2013, Tamburini et al. 2016), alimentaires (Turnbaugh et al.
2009, Maslowski and Mackay 2010, Walker et al. 2011) ou encore l’âge (Tiihonen et al. 2010,
Yatsunenko et al. 2012).
Ensemble, le microbiote et l’hôte forment une entité appelée l’holobionte (Margulis 1991), un
métaorganisme dont les parties sont interdépendantes (Simon et al. 2019). L’équilibre au sein de
l’holobionte est fragile, des perturbations peuvent potentiellement amener l’holobionte d’un état
d’eubiose (symbiotique) à un état de dysbiose (état malsain) (Iebba et al. 2016). C’est pourquoi le
microbiote a un impact direct sur la prédisposition de nombreuses maladies à caractère
inflammatoire ou infectieux (Khosravi and Mazmanian 2013, Kho and Lal 2018). Il est donc
critique pour un organisme de recruter un microbiote avec toutes les fonctions essentielles à sa santé
et son développement.
1.2.1 L’importance du microbiote pour la santé de l’hôte
Chez les Mammifères, cette symbiose est très bien documentée, et des recherches à ce sujet ont
permis de mettre en évidence la coévolution hôte-symbiote (bactéries à génome réduit auxquelles
des gènes essentiels sont manquants (Andersson and Kurland 1998, Moran and Wernegreen 2000)
et/ou bactéries possédant des gènes qui bénéficient principalement à l’hôte (Ochman and Moran
2001, Xu and Gordon 2003, Heinken et al. 2013)). Jusqu’à présent, l’essentiel des études sur les
interactions hôte-microbiote se sont concentrées sur le microbiote intestinal. Ces études ont permis
d’établir que l’intégrité du microbiote intestinal est indissociable de l’état de santé de son hôte
2autant chez les Mammifères (Sekirov et al. 2010, Holmes et al. 2012, Marchesi et al. 2015), que
chez les Poissons (Legrand et al. 2020).
Chez les Mammifères, comme chez les Poissons, les interactions symbiotiques entre les
communautés bactériennes et l’hôte ont des impacts à plusieurs niveaux essentiels : le métabolisme
(Gill et al. 2006, Hooper et al. 2012, Tremaroli and Bäckhed 2012, Butt and Volkoff 2019, Legrand
et al. 2020), le comportement (Logan and Katzman 2005, Desbonnet et al. 2010, Cryan and Dinan
2012, Butt and Volkoff 2019), le développement (Hooper et al. 2012, Sommer and Bäckhed 2013,
Dinan and Cryan 2017) et les prédispositions à certaines maladies (Pérez et al. 2010, Yang et al.
2013, Keku et al. 2014, Louis et al. 2014).
Au niveau du métabolisme, le microbiote intestinal influence la performance énergétique (Gill et al.
2006, Hooper et al. 2012, Tremaroli and Bäckhed 2012) en permettant par exemple l’absorption de
nutriments autrement indigestes pour l’hôte, tel que certains polysaccharides (Smith et al. 2007,
Sommer and Bäckhed 2013), ou par la sécrétion de certaines vitamines essentielles à la santé de son
hôte (par exemple, B et K chez les Mammifères) (Smith et al. 2007, LeBlanc et al. 2013) ou
d’enzymes digestives chez les Poissons (Legrand et al. 2020).
Les implications comportementales sont tout aussi importantes, chez l’Humain des recherches
récentes ont commencé à associer la santé du microbiote intestinal et la santé mentale. Par exemple,
l’anxiété (Logan and Katzman 2005, Desbonnet et al. 2010, Cryan and Dinan 2012), la dépression
(Stevens et al. 2020), l’humeur (Steenbergen et al. 2015), la cognition (Heijtz et al. 2011, Cryan and
Dinan 2012) et la douleur (Niedzielin et al. 2001, Cryan and Dinan 2012) sont tous des éléments
pouvant être influencés par le microbiote intestinal grâce à la communication entre le système
nerveux entérique et le système nerveux central via le nerf vague (i.e. «gut-brain axis »). Cette voie
de communication bidirectionnelle entre le microbiote et le système nerveux central s’effectue par
le biais de signaux immunitaires, neuronaux et endocriniens (Romijn et al. 2008, Grenham et al.
2011, Capuco et al. 2020). Des bactéries des genres de Lactobacilli et Bifidobacteria sont
bénéfiques à la santé de l’hôte en diminuant sa perception de la douleur, voire en la soulageant,
dans les cas de douleurs viscérales causées par le stress ou des maladies inflammatoires (Niedzielin
et al. 2001, Cryan and Dinan 2012). De plus, ces taxons ont un effet bénéfique sur la santé mentale
en réduisant les symptômes de détresse psychologique (Logan and Katzman 2005, Desbonnet et al.
2010, Cryan and Dinan 2012, Pirbaglou et al. 2016). Chez les poissons, des évidences pointent dans
la même direction, où le microbiote aurait des impacts sur l’anxiété (Davis et al. 2016).
3En ce qui concerne les prédispositions à certaines maladies, les recherches chez l’Humain
démontrent que des perturbations au niveau de l’intestin favorisent le développement de maladies
inflammatoires chroniques (syndrome du côlon irritable, maladie de Crohn ou des colites
ulcératives) (Yang et al. 2013, Keku et al. 2014) et du cancer du côlon. De plus, l’inflammation
chronique mène à des risques plus élevés de cancer du côlon (Yang et al. 2013, Keku et al. 2014).
Le régime alimentaire serait un élément clé dans le maintien de cet équilibre et l’induction de
déséquilibre (Keku et al. 2014). Par exemple, un régime alimentaire riche en fibre réduit les risques
de cancer du côlon (Louis et al. 2014) en diminuant les risques d’inflammations chroniques, en
induisant l’apoptose et en inhibant la prolifération des cellules tumorales (Keku et al. 2014). D’un
autre côté, un régime alimentaire riche en protéines augmente les risques d’inflammation et de
cancer du côlon, puisque plusieurs produits du métabolisme des protéines sont mutagènes et
génotoxiques (Keku et al. 2014).
Enfin, le microbiote intestinal des Mammifères et des Poissons joue un rôle crucial au niveau du
développement du système immunitaire (Chow et al. 2010, Hooper et al. 2012, Kelly and Salinas
2017), de la maturation du cerveau (Heijtz et al. 2011, Sampson and Mazmanian 2015, Phelps et al.
2017), en contribuant notamment à l’initiation de mécanismes de signalisation, qui ont un impact
sur les circuits neuronaux et qui affectent les capacités motrices et l’anxiété (Heijtz et al. 2011).
D’ailleurs, en ce qui a trait au développement du cerveau, le microbiote aurait un effet sur le
développement social (Archie and Tung 2015, Dinan et al. 2015) et sur le développement de
l’autisme (Li and Zhou 2016, Vuong and Hsiao 2017) chez l’Humain, et sur l’hyperactivité chez les
Poissons (Phelps et al. 2017).
Les souches bactériennes composant le microbiote intestinal possèdent différentes fonctions pour
contribuer à la santé de l’hôte. C’est pourquoi, tout au long du développement de l’hôte, différentes
souches avec des fonctions bien spécifiques devront être recrutées. Pour assurer le bon
développement de l’hôte, il est donc essentiel de recruter toutes les souches nécessaires aux étapes
clés du développement, car l’équilibre écosystémique du microbiome est particulièrement instable
aux premiers stades de développement (Schluter and Foster 2012) et des perturbations peuvent
avoir des impacts considérables sur la santé présente et future de l’organisme (Guaraldi and
Salvatori 2012, Yang et al. 2013, Keku et al. 2014).
41.2.2 L’acquisition du microbiote chez les Mammifères
Pendant longtemps, il était établi que le milieu utérin était stérile et que l’inoculation initiale se
faisait durant l’accouchement par le contact du jeune avec la muqueuse vaginale (Tissier 1900). En
outre, la présence de bactéries dans le milieu utérin était fortement associée à des infections menant
à des naissances prématurées (Gonçalves et al. 2002). Par contre, au cours des dernières années, la
recherche a établi que les techniques employées auparavant n’étaient pas assez puissantes pour
détecter la présence des bactéries pouvant être transmise dans le milieu utérin (DiGiulio 2012). Des
preuves que le transfert initial du microbiote de la mère vers son jeune se ferait in utero ont été
récemment mises au jour (Jiménez et al. 2005, Jiménez et al. 2008, Collado et al. 2016, Neu 2016,
Younge et al. 2019). En effet, des bactéries de plusieurs genres (e.g. Firmicutes, Tenericutes,
Proteobacteria Bacteroidetes, Fusobacterium(Aagaard et al. 2014)) ont finalement été détectées au
niveau du placenta (Younge et al. 2019) et des différents fluides irriguant les structures placentaires
(Collado et al. 2016, Younge et al. 2019), comme le sang du cordon ombilical (Jiménez et al. 2005)
et le fluide amniotique (Jiménez et al. 2008). L’analyse du méconium des nouveau-nés appuie aussi
cela, puisqu’il n’est pas stérile et contient des communautés bactériennes (entre 1 et 5 espèces ont
été identifiées, dont les principales sont Enterococcus fecalis, Staphilococcus epidermidis et
Escherichia coli), quoi que beaucoup moins diversifiées que ce qui est retrouvé dans le microbiote
intestinal des adultes chez l’Humain (Jiménez et al. 2008).
Chez l’Humain, le recrutement du microbiote intestinal commence donc in utero (Jiménez et al.
2005, Jiménez et al. 2008, Neu 2016), et se poursuit très tôt après la naissance sous l’influence de
quatre facteurs principaux : i) le mode d’accouchement (naturel ou par césarienne) (Tormo‐Badia
et al. 2014, Mueller et al. 2015) ; ii) la nourriture donnée au nouveau-né (lait maternel ou
préparation pour nourrissons) (Guaraldi and Salvatori 2012) ; iii) l’environnement (contact avec la
peau maternelle, avec le personnel de l’hôpital ou les appareils) (Dominguez-Bello et al. 2010,
Fallani et al. 2010), et iv) l’exposition à des antibiotiques (Tormo‐Badia et al. 2014, Mueller et al.
2015). D’autres facteurs peuvent influencer le recrutement et la composition du microbiote, mais
puisque ceux-ci ne peuvent être directement modifiés ou ne s’appliquent pas à ce stade (génétique
(Benson et al. 2010, Parks et al. 2013, Tamburini et al. 2016), âge (Tiihonen et al. 2010,
Yatsunenko et al. 2012), régime alimentaire (De Filippo et al. 2010, Graf et al. 2015)), ils ne seront
que mentionnés.
Le mode d’accouchement exerce une grande influence sur le recrutement subséquent des symbiotes.
La voie naturelle met le nouveau-né en contact avec la flore vaginale, voire même intestinale de la
5mère (Di Mauro et al. 2013, Tamburini et al. 2016) permettant une transmission verticale de divers
taxons bactériens (e.g Lactobacillus spp. (Tamburini et al. 2016)) entre la mère et son enfant
(Dominguez-Bello et al. 2010, Fallani et al. 2010). Chez les enfants nés par césarienne, les
communautés bactériennes transmises sont essentiellement celles de la peau de leur mère
(Dominguez-Bello et al. 2010) et de l’environnement (Fallani et al. 2010) (Staphyloccucus,
Streptocuccus, Propionibacteria (Tamburini et al. 2016)). Cette différence dans la transmission du
microbiote affecte le développement du système immunitaire (Huurre et al. 2008, Sevelsted et al.
2015) et favorise la prédisposition à certaines pathologies à base inflammatoire telles que l’asthme
(Renz‐Polster et al. 2005, Tollånes et al. 2008, Sevelsted et al. 2015), les allergies (Grönlund et al.
2000, Renz‐Polster et al. 2005) et d’autres maladies inflammatoires (Sevelsted et al. 2015,
Kristensen and Henriksen 2016).
En ce qui concerne le type de nourriture donné au nourrisson, l’allaitement est à prioriser pour
plusieurs raisons. D’une part, le colostrum permet la transmission de l’immunité de la mère à son
enfant (Ogra et al. 1977). D’autre part, toujours chez l’Humain, le lait maternel contient une grande
quantité de symbiotes (Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium (Tamburini
et al. 2016)). Des évidences de transmission de symbiotes intestinaux maternels via le lait maternel
ont récemment été découvertes (Perez et al. 2007, Jost et al. 2014) et les symbiotes recrutés dans la
petite enfance sont déterminants pour la tolérance et la réponse immunitaire au niveau des
muqueuses (De Palma et al. 2012).
À court terme, la transmission de symbiotes microbiens clés via l’allaitement pourrait contribuer à
prévenir les entérocolites nécrosantes (Barlow et al. 1974), les diarrhées chez les nouveau-nés
(Lopez-Alarcon et al. 1997, Morrow et al. 2005), les allergies (Kull et al. 2002), l’obésité (Von
Kries et al. 1999, Arenz et al. 2004, Owen et al. 2005) et les maladies auto-immunes dans la petite
enfance (maladie coeliaque (Ivarsson et al. 2002, Fasano and Catassi 2005, De Palma et al. 2012).
À plus long terme, l’allaitement est associé à une réduction des risques de maladies inflammatoires,
cardiovasculaires (Rich-Edwards et al. 2004), d’obésité (Horta et al. 2015, Tamburini et al. 2016) et
de diabète de type 2 (Stuebe et al. 2005, Owen et al. 2006, Horta et al. 2015).
1.2.3 L’ontogenèse et stratégies d’acquisition initiale du microbiote
Ainsi, le microbiote joue des rôles essentiels à la biologie de son organisme hôte (Hooper et al.
2012, Sommer and Bäckhed 2013, Dinan and Cryan 2017). Par conséquent, le microbiote a un effet
direct sur la prédisposition à certaines maladies (Yang et al. 2013, Keku et al. 2014, Louis et al.
2014). Il est donc essentiel pour un organisme de recruter un microbiote doté de toutes les fonctions
6indispensables à son développement. L’étude de l’ontogenèse du microbiote intestinal, soit le
processus de recrutement des espèces de microorganismes tout au long du développement d’un
organisme, devient donc incontournable pour mieux comprendre les rôles clés de ces
microorganismes.
L’acquisition initiale du microbiote s’opère selon deux grandes stratégies : l’acquisition horizontale,
par le contact direct avec les communautés microbiennes de l’environnement, et la transmission
verticale du microbiote d’un parent à sa progéniture. Chez les Ovipares, il est généralement admis
que l’acquisition du microbiote se fait principalement par acquisition horizontale via
l’environnement (Romero et al. 2014, Egerton et al. 2018), même si la présence de symbiotes a
récemment été détectée au niveau du sac vitellin avant la formation de la coquille de l’œuf
(Trevelline et al. 2018).
Chez les Vivipares, la transmission initiale verticale du microbiote de la mère à sa progéniture est
suivie par une acquisition horizontale de symbiotes de l’environnement. Chez les Mammifères, la
transmission verticale de symbiotes commence in utero, pour se poursuivre lors de l’accouchement
(Collado et al. 2016, Perez-Muñoz et al. 2017), puis post-partum via le lait maternel (Jiménez et al.
2005, Jiménez et al. 2008, Neu 2016). Parallèlement, l’acquisition horizontale se fait par contact
avec l’environnement.
Chez plusieurs ovipares, notamment chez les Insectes, les Oiseaux et les Poissons, il existe une
gamme de stratégies alternatives pour l’intégration d’une transmission verticale de symbiotes
microbiens à un mode de transmission favorisant une acquisition horizontale. Chez l’Abeille
(Kwong and Moran 2016), le Pigeon (Gillespie et al. 2012), le Discus et potentiellement plus de 28
autres espèces de poissons (Sylvain and Derome 2017), une transmission verticale du microbiote
par le nourrissage parental a effectivement été observée. En ce sens, la caractérisation d’un mode de
transmission vertical des symbiotes microbiens pionniers chez des organismes non-mammifères
ouvrira des pistes de réflexion quant au rôle potentiellement critique des microorganismes
symbiotes dès les premiers stades de développement de l’organisme hôte.
Considérant d’une part l’importance du microbiote pour la santé de l’organisme hôte, et d’autre
part, la présence de stratégie alternative pour l’intégration d’une transmission verticale à un mode
de reproduction favorisant une acquisition horizontale, une question s’impose. La viviparité serait-
elle, entre autres choses, une stratégie d’optimisation de la transmission du microbiote? Cette
question demeure non résolue puisqu’une telle transmission verticale in utero du microbiote n’a pas
encore été mise en évidence chez un Vertébré non-mammifère. C’est que nous avons proposé de
7faire avec cette étude en étudiant le mode de transmission du microbiote chez un poisson vivipare.
1.3 Approche expérimentale
Considérant l’importance du microbiote, beaucoup d’efforts ont été mis en œuvre pour développer
des techniques pour son analyse. L’approche métagénomique, soit une analyse génomique des
communautés de microorganismes à l’aide de techniques de biologie moléculaire (amplification par
PCR, séquençage parallèle à haut débit, approche code barre, etc.) est très prisée actuellement, car
elle permet une caractérisation exhaustive de la composition taxonomique et fonctionnelle des
communautés de microorganismes à analyser (Frank and Pace 2008), ce que ne permet pas la
méthode de culture avec laquelle seuls 5% des souches en présence sont détectées. Deux approches
métagénomiques sont possibles: la caractérisation des communautés à l’aide d’un seul gène ou la
caractérisation du profil de tous les gènes de la communauté avec une approche « shotgun »
(fragmentation génomique aléatoire) (Gilbert and Dupont 2010). L’analyse génétique par code-
barre (DNA barcoding) se base sur la première voie et rend possible l’identification d’organismes à
l’aide d’un marqueur génétique spécifique, soit une séquence conservée entre organismes d’une
même espèce, mais qui diffère entre organismes d’espèces différentes (Hebert et al. 2003,
Hajibabaei et al. 2007). Parmi ces marqueurs fréquemment utilisés se trouve la sous-unité 16S du
gène de l’ARN ribosomique mitochondrial (ARNr 16S) (Hebert et al. 2003, Hajibabaei et al. 2007,
Janda and Abbott 2007). D’ailleurs, c’est la technique la plus utilisée de nos jours pour l’étude de la
phylogénie et de la taxonomie bactérienne. La présence de ce gène est presque universelle chez les
Bactéries et son évolution est relativement lente. Sa séquence d’environ 1500 pb est suffisante pour
identifier les espèces, voire les souches bactériennes, grâce à l’analyse bioinformatique et les
banques de données pour l’identification des bactéries à partir de ce gène contiennent un nombre
grandissant de taxons (Janda and Abbott 2007). Parmi les banques de données utilisées pour
l’assignation taxonomique, on retrouve SILVA, RDP-II (« Ribosomal database project »),
Greengenes, NCBI (« National Center for Biotechnology Information ») ou OTT (« Open tree of life
taxonomy ») (Balvočiūtė and Huson 2017). Le choix d’utilisation d’une banque de données varie en
fonction des besoins, comme le niveau d’assignation taxonomique recherché (genre ou espèce) et le
type d’organisme à identifier (Eucaryote, Archées, Bactéries) (Balvočiūtė and Huson 2017). De
plus, le mode d’assignation taxonomique peut varier entre les différentes banques de données, en
fonction des différentes sources d’informations considérées (Balvočiūtė and Huson 2017). Par
contre, la plateforme la plus utilisée pour les études basées sur le gène de l’ARNr 16S reste SILVA,
mais la plateforme NCBI est aussi utilisée pour les études avec le gène de l’ARNr 16S et lors de
8séquençage à l’aide d’une approche « shutgun » (Balvočiūtė and Huson 2017). Le choix des
amorces pour l’amplification du gène de l’ARNr 16S est aussi un enjeu. D’une part, elles doivent
correspondre à des séquences très conservées afin de permettre l’amplification d’ADN chez un
maximum de taxons. D’autre part, elles doivent entourer une séquence dite hyper variable, soit une
séquence propre à chaque taxon, pour permettre une assignation taxonomique fiable (Hartmann et
al. 2010). Par exemple, la région hypervariable V4 est une bonne séquence à amplifier puisqu’elle
est entourée de régions très conservées. Cependant, les techniques actuelles de séquençage à haut
débit ne permettent que d’amplifier des fragments de 300 à 400 nucléotides, ce qui rend
l’assignation taxonomique possible jusqu’au rang du genre, voire de l’espèce (Vincent et al. 2017).
1.4 Brachyistius frenatus, espèce modèle pour notre étude
Le modèle que nous avons utilisé pour cette étude est la Perche côtière des forêts de varech
(Brachyistius frenatus). Il s’agit d’une espèce relativement peu étudiée, n’étant pas une espèce
d’intérêt commerciale vu sa petite taille (Feder et al. 1974). Cette espèce est un Poisson vivipare de
la famille des Embiotocidae (Reisser et al. 2009, Longo and Bernardi 2015). Les Embiotocidae,
famille de poissons appartenant à l’infraclasse des Téléostéens et qui comprend 24 espèces dont 18
vivants le long de la côte californienne (Reisser et al. 2009, Longo and Bernardi 2015), possède la
particularité d’avoir un mode de reproduction sans stade larvaire pélagique : les mères portent les
jeunes dans une poche utérine (Behrens 1977, Wourms 1981, Reisser et al. 2009, Longo and
Bernardi 2015). Chez les Vertébrés non-mammifères, la tendance est à la viviparité lécitotrophe,
mais l’une des grandes particularités des Embiotocidae dans ce contexte d’étude est sa viviparité
matrotrophe, soit le même trait qui caractérise les Mammifères euthériens (Blackburn 2015). Les
jeunes se développent dans la poche utérine jusqu’à un stade juvénile avancé, en étant nourris par
une sécrétion de la muqueuse utérine au début du développement, puis par diffusion du sang
maternel via leurs nageoires (Behrens 1977, Wourms 1981, Reisser et al. 2009, Longo and Bernardi
2015).
Chez les Embiotocidae, les cycles de vies sont variables, avec une espérance de vie variant entre 2
et 10 ans et un âge à la première reproduction allant de 1 à 3 ans (Baltz 1984). Malgré la présence
de ces variations, le cycle de vie semble être très consistant selon la taille des poissons. Baltz (1984)
propose un tel classement des espèces et a établi trois classes selon la longueur totale: i) petites
(jusqu’à 215mm) , ii) moyennes (215 à 335mm) et iii) grandes (335mm et plus). B. frenatus est une
petite espèce, avec une longueur standard entre 84 et 114mm.
Cette espèce vit dans la zone intertidale (Baltz 1984) en très intime association avec les forêts
9d’algues (varech) du genre Macrocystis, où tous les stades de développement de l’espèce vivent
(Hubbs and Hubbs 1954). B. frenatus est une espèce carnivore, qui se nourrit entre autres
d’ectoparasites présents sur les algues de M. pyrifera et sur d’autres poissons (Feder et al. 1974).
Comme la plupart des autres petites espèces, B. frenatus a une espérance de vie relativement courte,
soit de 2 ans (Hubbs and Hubbs 1954, Baltz 1984). Les mâles et les femelles sont de même taille et
ont un taux de croissance similaire et l’âge à la première reproduction est d’un an (Hubbs and
Hubbs 1954, Baltz 1984). Contrairement à ce qui est observé chez d’autres espèces d’Embiotocidae,
les juvéniles ne sont pas sexuellement matures à la naissance (Hubbs and Hubbs 1954). Le nombre
de juvéniles par portée est très variable (entre 2 à 50) et dépendrait de la qualité de l’habitat (i.e la
canopée formée par les algues), qui est lui-même variable d’une année à l’autre (Baltz 1984). Les
juvéniles naissent entre 32-33 mm, entre avril et juillet, et se reproduisent l’année suivante (Hubbs
and Hubbs 1954, Feder et al. 1974).
Chez B. frenatus, les femelles sont polyandres (elles se reproduisent avec plusieurs mâles)
(DeMartini 1988, Tootell and Steele 2012) et la reproduction a lieu en automne (débutant entre
septembre et octobre et se poursuivant jusqu’en décembre) (Feder et al. 1974). Les mâles déposent
le sperme dans la région urogénitale des femelles (Wourms 1981) à l’aide du gonopodium
(DeMartini 1988, Tootell and Steele 2012), une modification de la portion antérieure de la nageoire
anale pour former une structure complexe tubulaire pour le transfert du sperme (Wiebe 1968).
101. 5 Objectifs et hypothèses
L’objectif général de ce projet était de caractériser le mode de transmission du microbiote chez la
Perche côtière des forêts de varech et l’hypothèse générale testée était la suivante : il y a
transmission verticale du microbiote maternel in utero lors de la gestation chez B. frenatus, comme
observé chez les Mammifères. En effet, puisque la poche utérine est reliée au milieu externe par
l’orifice génital, ses parois devraient être colonisées par un microbiote.
De plus, au début de la gestation, une sécrétion utérine est produite et les alevins s’en nourrissent
durant les premières étapes du développement (Wourms 1981) de telle sorte que : (1) le microbiote
de la muqueuse utérine pourrait changer de composition selon le mode de nutrition principal
(sécrétion/diffusion) des alevins in utero et (2) les alevins, au contact de la muqueuse utérine et en
ingérant sa sécrétion, seraient colonisés par des souches microbiennes de la muqueuse utérine.
Ainsi, la transmission initiale du microbiote se ferait, in utero, dès l’éclosion des œufs, pour
s’intensifier dès la première alimentation. L’approche pour tester les hypothèses vise les objectifs
spécifiques suivants : i) déterminer la composition, la diversité et les relations des communautés
microbiennes des femelles gestantes (mucus cutané, intestinal et utérin), de juvéniles et du milieu
naturel de B. frenatus (algues et eau de mer), ii) déterminer l’ontogenèse (la séquence de
recrutement) du microbiote des juvéniles, ainsi que l’origine des symbiotes recrutés.
L’approche métataxonomique a été employée afin de caractériser la diversité et la structure
taxonomique des organismes microbiens retrouvés chez la mère, les juvéniles et l’eau du milieu afin
d’identifier l’origine des différents symbiotes bactériens des juvéniles (parentale vs
environnementale). La région hypervariable V4 de la sous-unité 16S du gène d’ARNr est ciblée
comme marqueur taxonomique bactérien universel. L’analyse de la composition taxonomique des
librairies d’amplicons d’ARNr 16S a été effectuée avec dada2 et phyloseq. Des analyses statistiques
telles que PERMANOVA, effectuées avec le logiciel R/vegan, ont permis notamment de déterminer
dans quelle mesure il y a transmission in utero de symbiotes microbiens pionniers.
11Chapitre 1 Viviparity : cutting edge strategy for
microbiota ontogeny
Boilard, Aurélie1, S. Bouslama1,2, P-L. Mercier1,2, G. Bernardi3 et N. Derome1,2
1
Département de biologie, Université Laval
2
Institut de biologie intégrative et des systèmes
3
Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of California Santa Cruz.
1.1 Résumé
Chez les Mammifères, le recrutement du microbiote débute in utero. L’objectif du projet était de
tester si un tel recrutement se produit chez le Poisson vivipare Brachyistius frenatus. Nous avons
testé l'hypothèse selon laquelle la poche utérine est colonisée par un microbiote transmissible aux
alevins. Nous avons caractérisé le mode de transmission du microbiote, sa séquence de recrutement,
et la contribution des communautés sources en caractérisant la diversité bactérienne des femelles,
des juvéniles et leur environnement avec une approche métagénomique de type code barre. La
région V4 du gène de l'ARNr 16S a été ciblée comme marqueur taxonomique bactérien pour
identifier une transmission verticale du microbiote. Cette étude nous a permis d’identifier la
première instance d’une transmission verticale du microbiote in utero, chez un vivipare non
mammifère et que B. frenatus pourrait être un tout nouveau modèle d’ontogenèse du microbiote.
1.2 Abstract
In Mammals microbial recruitment starts in utero, something that had not been proven in any other
Vertebrate class. The main goal of this project was to test whether this type of recruitment happens
in a non-mammalian Vertebrate. We tested in the viviparous fish Brachyistius frenatus the
hypothesis under which the uterine pouch is colonized by a microbiome transmissible to the
juveniles, conferring them an ontogeny similar to Mammals. We characterized the mode of
transmission of the microbiome, explored its ontogeny and established the bacterial diversity of the
microbiome of the females, juveniles and their environment with a metagenomic approach (bar
coding). We targeted the hyper variable region V4 of the small subunit (16 S) rRNA gene to
determine the presence of a vertical transmission of the microbiome. Our results confirmed the
presence of a vertically transmissible microbiome in B. frenatus. This study contributes to the
acquisition of knowledge on microbiome transmission and, in the context of evolutionary
convergence of viviparity, allows the formulation of hypotheses concerning the evolutionary
advantages of in utero microbiome transmission.
12Introduction
There are two main reproductive strategies in Vertebrates: Oviparity and Viviparity. Oviparity is
characterized by the females laying eggs and juveniles sustained by a vitellus during development
(Wourms and Lombardi 1992, Blackburn 1999), while Viviparity is characterized by juveniles
developing in their mother’s reproductive tract (Blackburn 1999, 2015).
When it comes to fetal nutrition, viviparity offers a gradient ranging from nutrients exclusively
provided maternally (matrotrophy) to nutrients provided to juveniles by a vitellus (lecitotrophy)
(Wourms 1981, Blackburn 1992, 2015). Matrotrophy is relatively rare, but characteristic of
eutherian Mammals (Blackburn 1999). Viviparity in itself is far more common, as the trait appeared
independently over 150 times in all Vertebrate classes, except Birds (Wourms 1981, Blackburn
2015). In terms of physiology, viviparity implies a limited space for juvenile development
(Blackburn 1999) which translates into a limited number of juveniles. In terms of ecology,
viviparity provides protection against predators and varying environmental conditions (Lambert and
Wiens 2013). Advantages and disadvantages of viviparity have been highly documented, but the
advantages of viviparity regarding microbiota acquisition have yet to be explored.
The microbiota regroups all microorganisms (Archeae, Bacteria, Viruses, etc.) colonizing a host and
form ecosystems called microbiomes (O'Hara and Shanahan 2006, Consortium 2010, Clemente et
al. 2012, Cui et al. 2016). In the past decades, increasing evidence has supported the essential roles
of the microbiota in its host health and development has become unavoidable. Together microbiome
and host form the holobiont, a tightly interconnected and interdependent symbiotic whole (Simon et
al. 2019).
For example, on the metabolic level, the microbiota plays a critical role in the absorption of
otherwise indigestible nutrients (i.e. polysaccharides (Smith et al. 2007, Sommer and Bäckhed
2013)) and vitamin secretion (such as vitamin B and K (LeBlanc et al. 2013)). The microbiota will
also play a critical role in immune development (Chow et al. 2010, Hooper et al. 2012) and brain
maturation (Heijtz et al. 2011, Sampson and Mazmanian 2015).
Many factors can affect the microbiota (diet, environment, genotype), potentially leading the
holobiont from eubiosis (healthy state) to dysbiosis (unhealthy, diseased state) (Iebba et al. 2016).
Thus, the microbiota can have direct impacts on the predisposition to some diseases, such as
chronic inflammatory diseases (irritable bowel syndrome, Crohn's disease and ulcerative colitis
(Yang et al. 2013, Keku et al. 2014)) and some cancers (e.g. colorectal, pancreatic, oral, etc.
(Karpiński 2019)). Holobiont equilibrium is especially fragile in early development (Schluter and
Foster 2012), where disruptions (dysbiosis) can lead to considerable long-term impact on the hosts’
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