PROCESS DEVELOPMENT STUDIES FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL MUCOSAL IGA ANTLBODLES
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PROCESS DEVELOPMENT STUDIES FOR THE PRODUCTION
OF MONOCLONAL MUCOSAL IgA ANTlBODlES
ÉCOLE POLYTECHNIQUE FÉDÉRALE DE LAUSANNE
P W R L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR ÈS SCIENCES TECHNIQUES
PAR
Thibaud STOLL
lngenieur chimiste diplorné EPF
et Master of Science in Chemical Engineering, Massachusettslnstitute of Technology. Cambridge, MA, USA
originaire de Schaffhouse (SH) et Osterfingen (SH)
accepth sur propcsiiion du jury:
Prof. U. von Stcckar. directeur de thèse
Prof. J . 4 . Engasser. corapporteur
Dr C. Leisi, corapporteur
Dr 1. Madson. corapporteur
Prof. F. Wum. corapporteur
Lausanne. EPFL
1995sIgA antibodies are the most abundant immunoglobulins i n secretions and play a key role in the so-called mucosal immune system. The importance of these antibodies is reflected by their daily production far exceeding that of al1 other immunoglobulins combined. These antibodies have a unique molecular structure, made of 4 protein units: two monomenc units, a cysteine-rich polypeptide (J-chain) and a highly glycosylated protein (secretory component, SC). I n vivo, sIgA molecules are produced by two distinct ce11 types: the dimenc IgA with J-chain is synthesized by mucosal lymphocytes, while SC is produced by epitheliai cells lining the mucosal surfaces and is complexed to IgA when this molecule is secreted ont0 mucosal surfaces. SC is thought to stabilize sIgA against protease attack and digestion by intestinal secretion. The unique characteristics of sIgA make this molecule very promising for the passive protection, by oral immunization, of immunocompromised or immunologically inexperienced individuals, or for the treatment of infections for which no efficient vaccine is available. I t has been recently shown in animal models that IgA and sIgA are efficient against a wide vanety of pathogens. The purpose of this work was to conduct development studies for the in vitro production of IgA antibodies by hybndoma cells. Three ce11 lines have been grown, producing IgA against Vibrw cholerae (Zac3),respiratory syncytial virus (HNIL20) and Helicobacter felis (HF3). In a first step, a simple HPLC method was successfully developed, that enabled, by a single injection, the accurate dekction of key metabolites such as glutamine, glucose, lactate, alanine and glutamate, in addition to pyrrolidone carboxylic acid. An anti a-chain ELISA was also improved, leading to a more accurate and reproducible detedion of I g k Efforts were then devoted to the systematic improvement of a chemically- defined protein-free medium (FMX-Turbodoma). On the basis of a literature survey, a small number of supplements was selected and their effect individually teskd on the growth and IgA production of the Zac3 celi line, in T-flask and stirred- tank reactor batch cultures. Glucose, glutamine, Pluronic F-68 and several amino acids had important beneficial effects. Unbalanced supplementations of amino acids were however found to be undesirable because of the toxicity of some of them a t high concentration. A balanced supplementation, of consumed species only, resulted in a better performance. Compared to the basal medium, the maximum viable ceIl concentration was increased by 130% and the final IgA concentration by 700%, to 114 mg 1-1,in the final version of the protein-free medium, whereas the IgA molecular weight pattern and the active fraction were not aRected. Thanks to its price, this medium is perfectly suitable for a large-scale process. The contribution of the duration of cell adaptation to the performance of the protein- free medium was also exarnined. The Zac3 ce11 lines was then grown in different reactors (in vivo, T-fiasks, a stirred-tank reactor (1.6 1) and hollow-fiber reactors (Tecnomouse, 300 cm2; Acusyst-Maximizer, 1.1 m2)) and media (RPMI 1640 + 10% FCS and FMX- Turbodoma). Ce11 growth, metabolic rates and IgA concentration, quality and
Summary activity were determined in each case. In vivo (ascites fluid), a n IgA concentration of 2200 mg 1-1 and a production of 2 mg per week and mouse were measured. In T- flasks and stirred-tank reactor cultures performed with RPMI 1640 + FCS, glutamine and glucose were found to be limiting; supplementation of these species together with amino acids (5x the normal content) resulted in an increase of the maximum viable cell concentration by 90% in comparison with the basal medium and in a n increase of the final IgA concentration by 210%, to 148 mg 1-1.Zac3 was successfully grown in the Tecnomouse for several months, using both media. IgA a t high concentrations (> 1 g 1-II were harvested; the very low productivity however limits the use of this system to the milligram-scale production of MAbs. In the Acusyst-Maximizer, high concentrations of IgA (> 1 g 1-1) and production rates were measured; within about 2 months, 10 g were produced in RPMI 1640 + FCS and 5 g in FMX-Turbodoma. IgA produced in the stirred-tank reactor using the protein-free medium had the highest active fraction. Highly concentrated material, typically from hollow-fiber reactors, was characterized by a relatively low active fraction and a relatively important fraction of polymers and aggregates. To automatically run the Acusyst-Maximizer under non-limiting and non-toxic conditions, a FIA-system was developed for the on-line monitoring of ammonia and glutamine. A LabViEW program was wntten to pilot the FIA and to keep these two species in the reactor a t set concentrations, by controlling two peristaltic pumps, delivering the medium and a concentrated solution of glutamine. This monitoring and control system was successfully validated during a culture for about 1200 h. For comparison with Zac3, the HNK20 and H F 3 ceIl lines were grown in T- flasks, the stirred-tank reactor and the Tecnomouse, using the same media. Supplementation of glucose, glutamine and amino acids had beneficial effects on the maximum viable cell concentration and the final IgA concentration in both RPMI 1640 + FCS and FMX-Turbodoma. Important differences in IgA specific productivity and molecular weight pattern were obsemed between the three ce11 lines. The influence of the reactor type on the IgA molecular weight pattern was different for each ceii line. Although the Acusyst-Maximizer hollow-fiber reactor was found to be suitable for the production of gram quantities of IgA a t high concentration, a stirred-tank reactor is probably the best solution for a large-scale commercial process. For the development of such a process, more accurate and additional assays are required for a better characterization of the product. Furthermore, the development of a purification process may influence the selection of the best culture conditions and reactor configuration. Possible strategies for the production of the complete molecule (sIgA) are finally discussed as perspectives.
Les anticorps sIgA sont les immunoglobulines les plus abondantes dans les
sécrétions e t jouent un rôle clé dans ce qu'on appelle le système immunitaire
muqueux. Le fait que la production journalière de ces anticorps dépasse de loin celle
de toutes les autres immunoglobulines réunies illustre leur importance. Ces
anticorps ont une structure moléculaire unique, composée de 4 unités de protéines:
deux unités monomériques, u n polypeptide riche en cystéine ("J-chain") e t une
protéine fortement glycosylée (composant sécrétoire, SC). Zn vivo, les molécules de
sIgA sont produites par deux types distincts de cellules: I'IgA dimérique avec la "J-
chain" est synthétisé par des lymphocytes muqueux, tandis que le SC est produit
par des cellules épithéliales recouvrant les muqueuses e t est complexé à 1'IgA
lorsque cette molécule est sécrétée sur les surfaces muqueuses. On considère que
le SC stabilise la molécule de sIgA contre les attaques de protéases e t la digestion
par des sécrétions intestinales. Les caractéristiques uniques des sIgA en font des
molécules très intéressantes pour la protection passive, par immunisation orale,
des personnes immunocompromises ou immunologiquement inexpérimentées, ou
pour le traitement d'infections contre lesquelles il n'existe pas de vaccin efficace.
On a récemment montré s u r des modèles animaux que les IgA e t sIgA sont
efficaces contre une grande variété de pathogènes.
Le but de ce travail était d'effectuer des études de développement pour la
production in vitro d'anticorps de type IgA par des hybridomes. Trois lignées
cellulaires ont été cultivées, produisant des IgA contre Vibrio cholerae (Zac3), le
virus respiratoire syncytial (HN1120) et Helicobacter felis (HF3).
Dans une première étape, une méthode HPLC simple a été développée avec
succ&s,permettant, en une seule injection, la détermination précise de métabolites
clés tels que la glutamine, le glucose, le lactate, l'alanine et le glutamate, en plus de
l'acide pyrrolidone carboxylique. Un ELISA anti chaîne a a également été amélioré,
permettant la détection précise et reproductible des IgA.
Nous nous sommes ensuite consacrés à l'amélioration syst4matique d'un milieu
sans protéines (FMX-Turbodoma) et défini chimiquement. S u r la base d'une
recherche de littérature, un petit nombre de suppléments a été choisi et leur effet
testé individuellement sur la croissance et la production des IgA de la lignée &S.
Les cultures ont été faites en mode "batch", dans des "T-flasks" e t dans un
réacteur "cuve agitée". Le glucose, la glutamine, le Pluronic F-68 e t plusieurs
acides aminés ont eu des effets bénéfiques importants. Une supplémentation de
tous les acides aminés s'est révélée non désirable à cause de la toxicité de certains
d'entre eux à haute concentration. Une supplémentation basée sur les espèces
consommées seulement s'est avérée meilleure. En comparaison avec le milieu de
base, la concentration maximum de cellules viable dans la version finale du milieu
a ainsi été augmentée de 130%et la concentration finale d'IgA de 700%, atteignant
114 mg 1-1. Grâce à son prix, ce milieu convient parfaitement pour un procédé à
grande échelle. La proportion des différentes formes d'IgA ainsi que la fraction
active n'ont cependant pas été affectées. Nous avons aussi examiné l a
contribution de la durée d'adaptation des cellules aux performances de ce milieu
sans protéines.vi Résumé La lignée Zac3 a ensuite été cultivée dans différents réacteurs (in vivo, "T- flasks", cuve agitée (1.6 l) e t réacteurs à fibres creuses (Tecnomouse, 300 cm2; Acusyst-Maximizer, 1.1 m2)) e t milieux (RPMI 1640 + 10% FCS e t FMX- Turbodoma). Dans chaque cas, la croissance cellulaire, des vitesses métaboliques ont été déterminées, de même que la concentration, qualité et activité des IgA. Zn vivo, une concentration d'IgA de 2200 mg 1-1 e t une production de 2 mg par semaine et par souris ont été mesurées. Dans des cultures en "T-flasks" et en cuve agitée avec RPMI 1640 + FCS, la glutamine et le glucose ont été identifiés comme étant limitants; la supplémentation de ces substance ainsi que d'acides aminés (5x la concentration normale) a conduit à une augmentation de la concentration maximum de cellules viables de 90% en comparaison avec le milieu de base e t à une augmentation de la concentration finale d'IgA de 210% (148 mg l-l).ZacJ a été cultivé avec succès dans le Tecnomouse pendant plusieurs mois, avec les deux types de milieu. Des IgA fortement concentrés (> 1g 1-1) ont été récoltés; la très faible productivité limite cependant l'utilisation de ce système à une production d'anticorps de l'ordre d u milligramme. Dans 1'Acusyst-Maximizer, de grandes concentrations d'IgA (> 1g 1-1)e t vitesses production ont été mesurées; en environ 2 mois, 10 g ont été produits dans RPMI 1640 + FCS et 5 g dans FMX-Turbodoma. Une comparaison de tous les réacteurs a montré que la fraction active des IgA la plus élevée a été obtenue dans des cultures "batch", avec FMX-Turbodoma. Des IgA très concentrés, typiquement produits dans les réacteurs à fibres creuses, sont caractérisés par une fraction active relativement faible e t une fraction de polymères et d'agrégats relativement importante. Pour faire fonctionner automatiquement 1'Acusyst-Maximizer dans des conditions non-limitantes e t non-toxiques, un système FIA a été développé pour l'analyse en ligne de l'ammoniac et de la glutamine. Un programme LabVIEW a été écrit pour piloter le FIA et pour maintenir ces deux substances dans le réacteur à des concentrations désirées, en contrôlant deux pompes péristaltiques, fournissant le milieu e t une solution concentrée de glutamine. Ce système d'analyse e t de contrôle a été validé avec succès lors d'une culture durant environ 1200 h. Par comparaison avec Zac3, les lignées HNK20 et HF3 ont été cultivées en "T- flasks", cuve agitée e t dans le Tecnomouse, avec les mêmes milieux. La supplémentation de glucose, glutamine et d'acides aminés a eu un effet bénéfique sur la concentration maximum de cellules et sur la concentration finale d'IgA, aussi bien dans RPMI 1640 + FCS que dans FMX-Turbodoma. Des différences importantes dans la productivité spécifique d'IgA et dans les proportions des différentes formes d'IgA ont été observées entre les trois lignées. L'effet du type de réacteur s u r les proportions des différentes formes s'est révélé différent pour chaque lignée. Bien qu'il ait été montré que le réacteur à fibres creuses "Acusyst-Maximizer" convienne à la production de grammes d'IgA à haute concentration, un réacteur "cuve agitée" est probablement la meilleure solution pour un procédé commercial à grande échelle. Pour le développement d'un tel procédé, des méthodes d'analyse plus précises e t supplémentaires sont nécessaires, permettant une meilleure caractérisation du produit. De plus, le développement d'un procédé de purification peut jouer un rôle dans la sélection des meilleures conditions de culture e t du meilleur réacteur. Des stratégies possibles pour la production de la molécule complète (sIgA) sont finalement discutées comme perspectives.
TABLE OF CONTENTS
iii
TABLE OF CONTENTS vii
1. STRUCTURE AND FUNCTION OF sIgA
1.1 Introduction
1.2 Structures of IgA and sIgA
1.3 sIgA and the mucosal defense
1.3.1 Introduction
1.3.2 Function of sIgA in vivo
1.3.3 Passive protection by (s)IgA
1.3.4 Active protection through irnmunization
1.3.5 Pathogens associated with the IgA produced in this work
2. MAMMALIAN AND HYBRIDOMA CELLS
2.1 Introduction
2.2 Hybridomas and monoclonal antibodies
2.2.1 Hybridoma preparation and characteristics
2.2.2 Monoclonal antibodies
2.3 Metabolism and nutritional requirements
2.3.1 Introduction
2.3.2 Glucose
2.3.3. Glutamine
2.3.4 Amino acids
2.3.5 Serum
2.3.6 Oxygen
2.3.7 Vitamins
2.3.8 Growth limitation by ammonia
2.3.9 Other limiting factors
2.3.10 MAbs production
2.3.11 Protein glycosylation
2.3.12 Media formulation
3. PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES
3.1 Culture systems
3.1.1 Introduction
3.1.2 in vivo system...
vu Table of contents
3.1.3 Static systems
3.1.4 Stirred-tank reactors
3.1.5 Fluidized systems
3.1.6 Immobilized systems
3.2 Large-scale production of (s)IgA
4. AIMS 41
5. MATERIALS AND METHODS
5.1 Ceiis
5.1.1 Cell lines
5.1.2 Media
5.1.3 Cleaning procedures
5.1.4 Mycoplasma test
5.2 Reactor systems
5.2.1 Mouse
5.2.2 T-flask
5.2.3 Stirred-tank reactor
5.2.4 Tecnomouse reactor
5.2.5 Acusyst-Maximizer reactors
5.3 Assays
5.3.1 Ce11 density and viability
5.3.2 Glucose
5.3.3 Glutamine
5.3.4 Lactate
5.3.5 Ammonia
5.3.6 IgA
5.3.7 Amino acids analysis
5.4 Calculations
5.4.1 T-flask and stirred-tank reactor
5.4.2 Tecnomouse reactor
5.4.3 Acusyst-Maximizer reactors
6. DEVELOPMENT OF ANALYTICAL TECHNIQUES
6.1 HPLC technique for mammalian ceil metaboLites
6.1.1 Introduction
6.1.2 Materials and methods
6.1.3 Results
6.1.4 Conclusion
6.2 a-chah ELISA
6.2.1 Lntroduction
6.2.2 Materials and methods
6.2.3 Results and discussion
7. SYSTEMATIC IMPROVEMENT OF A CHEMICALLY-
DEFINED PROTEIN-FREE MEDIUM 89Table of contents ix
7.1 introduction 89
7.1.1 Incentives 89
7.1.2 S e m - f r e e media 90
7.1.3 Protein-free media 94
7.1.4 Strategies for the development of serum- and protein-fiee media
95
7.2. Materials and methods
7.2.1 Cellline
7.2.2 Medium and supplements
7.2.3 Bioreactors
7.2.4 Analyses
7.2.5 Optimization protocol
7.3 Results and discussion
7.3.1 Improvement of a protein-free medium
7.3.2 Growth of the Z a b ' population in protein-free media
7.4. Conclusion
8. COMPARISON OF DIFFERENT BIOREACTORS AND
MEDIA 121
8.1 introduction 121
8.2 Zn vivo culture 121
8.3 Cultures in T-flask and STR with senun 122
8.3.1 Cultures in basal medium (RPMI 1640 + 10% FCS) 122
8.3.2 Identification of bottlenecks 130
8.3.3 Effect of medium supplementation in STR cultures 134
8.3.4 Effect of pO2 139
8.4 Cultures in T-flasks and STR in protein-freemedia 140
8.4.1 Batch cultures 140
8.4.2 Effect of pO2 140
8.5 Cultures in the Tecnomouse 142
8.5.1 Introduction 142
8.5.2 Culture in RPMI 1640 + 10% FCS 143
8.5.3 Culture in FMX-Turbodoma 149
8.6 Cultures in the Acusyst-Maximizer 151
8.6.1 Introduction 151
8.6.2 Cultures in RPMI 1640 .c 10% FCS 152
8.6.3 Culture in FMX-Turbodoma 158
8.7 Comparison of reactors and media 163
8.7.1 IgA activity 163
8.7.2 IgA molecular weight pattern 164
8.7.3 IgA production 168
8.8 Conclusion 171
9. ON-LINE MONITORING AND CONTROL OF A HOLLOW-
FIBER REACTOR 173
9.1 Introduction 173x Table of contents
9.2 Monitoring and c o n h l strategy
9.3 Materials and methods
9.3.1 FIA
9.3.2 Bioreactor and pumps
9.3.3 Hardware and software
9.3.4 Safety and error detection
9.4 Resuits and discussion
9.4.1 Characterization of FIA rneasurements
9.4.2 LabVIEW program
9.4.3 Cultures in the Acusyst-Maximizer
9.5 Conclusion
10. COMPARISON OF DIFFERENT CELL LINES 217
10.1 Introduction 217
10.2 Results and discussion 218
10.2.1 HNK20 218
10.2.2 HF3 223
10.2.3 General cornparison of Zac3, HNK2O and HF3 228
10.3 Conclusion 229
11. CONCLUSION 231
11.1 General discussion on resuits 231
11.2 Commercial process for the production of (s)IgA 233
REFERENCES 237
SYMBOLS AND ABBREVIATIONS 259
APPENDIX
Appendix of Chapter 5
Appendix of Chapter 6
Appendix of Chapter 7
Appendix of Chapter 8
Appendix of Chapter 9
Appendix of Chapter 10
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