LES CHAMPIGNONS PARASITES (CHYTRIDES) DANS LES LACS D'AUVERGNE
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Serena Rasconi Directeur de thèse: Télesphore Sime-Ngando LES CHAMPIGNONS PARASITES (CHYTRIDES) DANS LES LACS D’AUVERGNE Un lac est un écosystème complexe, comprenant une zone littorale où les interactions avec les sédiments sont importantes, et une zone strictement aquatique, dite zone pélagique. Dans cette dernière zone, la biodiversité est très importante et principalement représentée par des virus et des organismes microscopiques (phytoplancton, zooplancton et autres micro-organismes). Ces microorganismes, via les multiples interactions qui les relient, gouvernent le fonctionnement de l’écosystème lacustre entier. Plus en détail, les micro-algues (phytoplancton) réalisent la photosynthèse et constituent les producteurs primaires de la matière organique. Cette nouvelle biomasse produite peut être consommée directement par le zooplancton via la prédation, ou également en tant que matière organique dissoute, produite sous forme d’exsudats excrétés suite à la photosynthèse, et qui constituent la ressource nutritive primaire des bactéries dites hétérotrophes. Ces bactéries sont ensuite consommées par des microorganismes bactérivores de plus grande taille (protistes), qui sont à leur tour les proies du zooplancton métazoaire. L’ensemble de ces microorganismes pélagiques forment ainsi une chaine trophique complexe (dite microbienne; Pomeroy 1974, Azam et al 1983) dont le fonctionnement est essentiel au transfert de matière et d’énergie entre maillons trophiques, grâce au rôle clé des prédateurs (Fig. 1). Fig. 1 La chaine trophique microbienne dans les milieux pélagiques et les différents microorganismes impliqués. En raison de leur taille, ces microprédateurs sont difficiles à étudier à l’aide de méthodes microscopiques classiques. En conséquence, la connaissance de leur diversité et de leurs rôles écologiques dans le fonctionnement des écosystèmes aquatiques a longtemps été limitée. Ces limites méthodologiques sont en train d’être repoussées avec le développement des techniques de la biologie moléculaire, notamment celles des d’empreintes génétiques qui, aujourd’hui, permettent de relier identité et fonction chez les microorganismes non cultivables. Il faut préciser que ces microorganismes non cultivables représentent l’essentiel (plus de 99%) des microorganismes de notre environnement. On peut ainsi déterminer des microorganismes inconnus par affiliation 1
phylogénétique de leurs séquences ADN, par rapport à celles de micro-organismes déjà décrits présentes dans les bases de données moléculaires internationales. C’est ainsi que des études récentes, initiées dans les lacs d’Auvergne (Lefranc et al 2005, Lepère et al 2008, Lefèvre et al 2007, 2008), ont permis de se rendre compte de la diversité et des fonctions écologiques potentielles associées à la communauté des protistes hétérotrophes qui, jusque là, étaient tous considérés comme prédateurs des bactéries dans les modèles de fonctionnement de la chaine trophique microbienne des écosystèmes aquatiques. Un de résultat le plus remarquable de ces études a été la mise en évidence de l’omniprésence de champignons (Eumycètes) microscopiques, dont le sous-groupe dominant était celui des Chytridiomycètes (chytrides). Les travaux effectués au cours de cette thèse, ont clairement démontré l’omniprésence, la diversité et l’importance quantitative et fonctionnelle des chytrides dans les écosystèmes lacustres. Ces champignons sont caractérisés par un cycle de vie complexe, considéré comme une adaptation au mode de vie pélagique, puisqu’il comporte un stade infectieux, le sporange, qui se développe fixé sur les algues planctoniques qui constituent leurs hôtes dont ils se nourrissent. Au terme de sa croissance, le sporange produit les stades de dissémination constitués par des zoospores flagellées, dont les flagelles assurent la mobilité nécessaire à la recherche d’un nouvel hôte en milieu aqueux. Dans la littérature scientifique, les chytrides sont décrits comme des parasites d’algues. Ils ont été observés dès le milieu du siècle dernier à l’aide de techniques de microscopie classique (Canter 1950, 1953a, b, 1972) et, relativement plus récemment, par microscopie électronique (Beakes et al. 1992a, b, 1993). Leur présence a été rapportée dans des aires biogéographiques contrastées (Kobb 1966, Van Donk et Ringelberg 1983, Sen 1987a, b) et serait caractéristique des milieux lacustres. Cependant, ces études sont essentiellement descriptives (morphologie et cycle de développement des espèces), et ne resituent pas le rôle des chytrides dans le fonctionnement des réseaux trophiques microbiens. En fait, des outils de routines adaptées à l’étude du rôle de ces organismes font défaut dans le contexte de l’écologie aquatique, en raison de leur petite taille et de la complexité des formes de vie. C’est ainsi que dans un premier temps, les objectifs de la thèse ont été donc d’utiliser les technologies récentes pour développer de nouveaux outils permettant d’identifier, de quantifier et de déterminer la prévalence et l’intensité d’infection des chytrides parasites du phytoplancton dans les écosystèmes aquatiques, en tenant compte des différentes formes de vie. Des outils adaptés ont été mis au point en couplant les méthodes de microscopie et de la biologie moléculaire. Pour l’étude de la phase parasitaire (les sporanges), nous avons testé un colorant spécifique de la chitine qui est un composant de la paroi cellulaire des champignons. Après excitation sous ultra- violet, ce permet d’identifier et de distinguer les chytrides des autres micro-organismes présents dans le milieu (Fig. 2). Une estimation quantitative rapide et fiable de ces parasites dans des échantillons environnementaux a ainsi pu être réalisée. De plus, le protocole proposé (Rasconi et al 2009) permet également une saisie d’images de bonne qualité (Fig. 3), exploitables pour la détermination à la fois des parasites et de leurs hôtes à partir de critères morphologiques. Fig.2. La méthode de coloration développée permet de distinguer facilement les champignons parasites des autres organismes, grâce à la forte fluorescence bleue. 2
Fig. 3. Le protocole mis au point pour la détection et la quantification des sporanges de chytrides parasites a fait l’objet d’une publication dans une revue scientifique (Rasconi et al 2009) et une des photos prise au microscope a été retenue pour la couverture du numéro où l’article est paru. 3
Contrairement aux sporanges, le stade de dissémination est dépourvu de chitine et ne possède pas de composants cibles pour des colorants spécifiques. De plus, ces propagules sont de très petite taille et ne présentent pas de caractéristiques morphologiques pouvant permettre de les différencier d’autres microorganismes flagellés présents dans le milieu aquatique. Les outils moléculaires offrent une alternative pour pallier à ces inconvénients. C’est ainsi que nous avons mis au point une sonde moléculaire spécifique des chytrides, fonctionnant par hybridation d’un brin complémentaire de l’ARN ribosomal des chytrides présent dans l’environnement (Fig. 4). L'ARN ribosomal est une molécule hautement conservée, présente dans les cellules de tous les organismes, qui est produite à partir d’une matrice d’ADN. Avec cette technique de marquage fluorescent par la sonde moléculaire mise au point, a été possible d’identifier et de compter les zoospores au microscope (travail effectué en collaboration avec M. Jobard, Jobard et al 2010) (Fig. 5). Fig. 4. La méthode de coloration utilisée rend fluorescentes les zoospores des champignons qui deviennent ainsi visibles sous la lumière du microscope. Fig. 5. Le protocole mis au point pour la détection et la quantification des zoospores de champignons parasites a fait l’objet d’une publication dans une revue scientifique (Jobard et al 2010). Une fois les outils méthodologiques développés et validés, l’objectif de l’étude a été de décrire la dynamique saisonnière et l’incidence des communautés de chytrides parasites sur le développement des successions du phytoplancton lacustre. Deux lacs contrastés ont fait l’objet de ces suivis: le lac Pavin qui est un lac profond et relativement pauvre en nutriments (lac oligo- mésotrophe), et le lac d’Aydat qui est un lac peu profond et riche en nutriments (lac eutrophe). L’étude a été conduite en 2007 et les échantillons ont été prélevés tous les 15 jours au point central des lacs. 4
Pour ce qui concerne l’étude de la phase parasitaire, l’exploitation de la méthode de coloration développée et des clés taxonomiques disponibles dans les ouvrages de référence (Sparrow 1960, Canter 1950, Canter and Lund 1951) ont permis d’identifier les espèces rencontrées sur des bases morphologiques et de mettre en évidence que plusieurs espèces d’algues étaient infectées dans les lacs étudiés (Fig. 6). Fig. 6. Photographies de chytrides (stade sporanges) parasitant des algues prises au microscope pendant le suivi saisonnier dans le lac Pavin et le lac d’Aydat. L’observation des champignons parasites a abouti à l’identification sur bases morphologiques de la plupart des espèces présentes dans les échantillons récoltés, ainsi que des différentes phases de leur cycle de vie. Fig. a-f différents stade de développement des parasites sur des algues diatomées dans le lac Pavin (a- d) et le lac d‘Aydat (e, f). Fig. g-h exemple de Chlorophytes parasitées dans le lac Pavin (stade mature); Fig. i-l exemple de Cyanobactéries parasitées dans le Lac d’Aydat (i-k stade mature, l début de l’infection). Echelle 10 µm. 5
Ce travail a permis de relier la dynamique des parasites à celle de leurs hôtes et d’évaluer l’incidence du parasitisme en utilisant des paramètres tels que la proportion d’individus infectés dans une population (prévalence de l’infection) et le rapport entre le nombre de parasites et le nombre d’individus infectés dans la population hôte (intensité de l'infection). La comparaison des dynamiques saisonnières a montré que la période de présence maximale des chytrides dans le lac Pavin est le printemps et que le groupe d’algues le plus attaqué par les parasites est celui de diatomée. Dans le lac d’Aydat les parasites de diatomées sont également plus abondant au printemps. Cependant, le pic d’abondance des chytrides a été observé en automne, lors de la prolifération des Cyanobactéries. Dans les deux lacs, au moment de l’année ou les parasites prolifèrent, ils peuvent influencer et limiter le développement des populations phyoplanctoniques hôtes, en changeant, profondément, la structure saisonnière des peuplements phytoplanctoniques qui est à la base de l’organisation biologique des écosystèmes lacustres. La dernière partie de ce travail a été consacrée à l’étude de la phase de dissémination des chytrides, à l’aide des outils moléculaires mises au point. Les zoospores des chytrides ont pu être visualisés et leurs dimensions évaluées, démontrant une forte homogénéité dans les deux lacs étudiés. De plus, tout comme pour la phase parasitaire, la dynamique saisonnière a été déterminée à partir d’échantillons naturels. La comparaison entre l’abondance des zoospores et celles des sporanges a mis en évidence l’importance des zoospores comme sources de nouvelles infections du phytoplancton et comme ressources nutritives pour le zooplancton. Un des résultats remarquables et récurrent dans les deux lacs a été l’importance de la taille des hôtes pour le développement de l’infection, aussi pour la phase parasitaire que pour les zoospores. Une corrélation positive a été observée entre la taille moyenne des espèces hôtes et le pourcentage des individus infectés dans la population. Les comptages et observations ont également fait ressortir que la production de zoospores (nombre de zoospores / sporange) était également positivement corrélée à la présence d’algues de grandes tailles. Ces résultats impliquent que la miniaturisation chez les hôtes constitue un véritable refuge contre les chytridiomycoses. D’un point de vue écologique, la préférence de parasites des algues de grandes tailles peut avoir des conséquences importantes pour le fonctionnement des écosystèmes lacustres et les cycles biogéochimiques associés. Du fait de leur taille, ces algues sont peut utilisées comme proies par le zooplancton, ce qui limite l’efficacité du transfert de carbone de ce compartiment algal vers les niveaux trophiques supérieurs. Ainsi, dans les modèle contemporains du fonctionnement des écosystèmes aquatiques, leur biomasse sédimenterait et serait donc, en grande majorité, ‘perdue’ pour les processus pélagiques. Ce travail a apporté la preuve que les parasites utilisent une partie de ces algues non seulement comme ressource nutritive, mais aussi pour la production de zoospores qui sont des ressources nutritives de qualité pour le développement du zooplancton métazoaire. En effet, on sait que les zoospores de chytrides sont riches en éléments essentiels, notamment en acides gras polyinsaturés et en cholestérol. Nos recherches aboutissent donc à une nouvelle vision du fonctionnement des écosystèmes aquatiques, et ont été depuis reprises par différents laboratoires dans le monde (Nascimento et al 2010, Gleason et al 2010, Marano et al 2011). Contrairement aux idées reçues, les efflorescences phytoplanctoniques, dont certaines sont nuisibles comme celles des cyanobactéries filamenteuses, ne seraient donc pas que de simples impasses trophiques. Nos travaux ouvrent donc des perspectives intéressantes en apportant une alternative biologique aux traitements chimiques de ces efflorescences. En effet, nous avons pu montrer, récemment, que ces traitements, notamment par le sulfate de cuivre, avait des effets néfaste sur l’ensemble des maillons et liens trophiques de l’écosystème lacustre (Le Jeune et al 2006, 2007). 6
Fig. 7. Une synthèse bibliographique sur le rôle des champignons dans le réseau trophic microbien lacustre a été rédigée pendant la thèse et acceptée pour être publiée dans une revue scientifique (Rasconi et al 2011). De suite une schématisation du rôle des chytrides dans le réseau trophique aquatique. Pour conclure, les développements méthodologiques récents, tels que les techniques de biologie moléculaire, ont amélioré considérablement notre connaissance de la composition taxonomique des organismes cellulaires de petite taille. Cela a permis de ‘redécouvrir’ la présence des Eumycètes dans les milieux pélagiques lacustres, où les Chytridiomycètes ont été reconnus comme le groupe le plus important. Il était donc important de préciser la diversité et l’importance quantitative et fonctionnelle des ces microorganismes pour les replacer dans le contexte des réseaux trophiques microbiens dans les écosystèmes aquatiques. En effet, une connaissance approfondie de la diversité et de la structure des communautés biologiques est nécessaire pour améliorer la compréhension des processus écologiques qui sont à la base du fonctionnement des écosystèmes naturels. A partir de là, il est important de noter que l’association de la biologie moléculaire à un savoir-faire permettant des analyses de qualité en microscopie, ainsi qu’une expérience de systématicien (spécialiste de la reconnaissance d’espèces à partir de critères morphologiques), aura permis d’aller au-delà d’études simplement descriptives. L’ensemble de ce travail, mené par une approche écosystémique, a donc permis d’intégrer les chytrides dans le fonctionnement des milieux pélagiques et d’évaluer l’incidence du parasitisme comme stratégie trophique dans le contexte général des réseaux trophiques microbiens. Ainsi, avec cette vision renouvelée des écosystèmes aquatiques, les champignons parasites ne constituent pas seulement un facteur de régulation de leurs hôtes, mais représentent une véritable force écologique dans le fonctionnement de l’écosystème. 7
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