Veille relative aux avancées scientifiques et techniques des approches EDA pour la surveillance des substances émergentes
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Partenariat 2010 – Chimie - Action 14 : Risques chimiques émergents pour les milieux aquatiques
priorisation des enjeux et outils de surveillance innovants
Veille relative aux
avancées scientifiques et
techniques des approches
EDA pour la surveillance
des substances
émergentes
Note de synthèse
Selim Aït-Aïssa, Nicolas Creusot, INERIS
Juin 2011Contexte de programmation et de réalisation
Ce document a été rédigé à la demande de l’ONEMA dans le cadre de la convention
INERIS /ONEMA 2010. Cette étude est liée à l’action 14 et s’inscrit dans le domaine « Chimie ».
Les auteurs
Selim Aït-Aïssa
Ingénieur Recherche
Email : selim.ait-aissa@ineris.fr
Unité Ecotoxicologie in vitro et in vivo
INERIS – Parc Technologique Alata - 60550 Verneuil-en-Halatte
Nicolas Creusot
Doctorant
Email : nicolas.creusot@ineris.fr
Unité Ecotoxicologie in vitro et in vivo
INERIS – Parc Technologique Alata - 60550 Verneuil-en-Halatte
Les correspondants
Onema : Pierre-François STAUB, Direction de l’Action Scientifique et Technique,
pierre-francois.staub@onema.fr
Référence du document : DRC-11-112048-04471A
Approbation INERIS Approbation ONEMA
M. Eric THYBAUD M. Pierre-François STAUB
Responsable du pôle Direction de l’Action
« Dangers et Impact sur le Vivant » Scientifique et Technique
13/04/2011 20/06/2011
Droits d’usage : Accès libre
Couverture géographique :
Niveau géographique [un seul National
choix] :
Niveau de lecture [plusieurs Citoyens, professionnels, experts
choix possibles] :
Nature de la ressource Document
[plusieurs choix possibles ] :
Page 2 sur 91. CONTEXTE
Dans un précédent rapport, nous décrivions le principe et l’intérêt des outils bio-analytiques
in vitro pour la surveillance de la qualité chimique des milieux, ainsi que leur couplage avec
les méthodes physico-chimiques d’analyses pour identifier, au sein de mélanges complexes,
les contaminants organiques effectivement responsables d’activités biologiques
(Aït-Aïssa 2009). La figure 1 présente une démarche générale d’utilisation de ces nouveaux
outils dans une optique de caractérisation des composés chimiques responsables d’effets
toxiques au sein de mélanges environnementaux complexes. Dans cette stratégie, une
première approche vise à quantifier et comparer des équivalents toxiques (TEQ) par
méthodes biologiques (e.g. tests in vitro) et analytiques (analyses quantitatives ciblées sur
des polluants prioritaires), afin d’établir un premier niveau de diagnostic. En fonction du
niveau d’information recherché, une approche dite EDA (pour Effect Directed Analysis) peut
alors être mise en œuvre dans le but d’identifier les molécules effectivement responsables
des effets observés. Ce type d’approche consiste à guider l’analyse chimique par les
résultats des tests biologiques et repose sur des techniques de fractionnement physico-
chimique de l’échantillon complexe dans le but de simplifier le mélange complexe en
différentes fractions et d’isoler les molécules toxiques afin de faciliter leur identification
chimique (Brack 2003). Si de nombreuses études ont démontré l’intérêt et la performance de
ce type d’approche pour l’identification de nouveaux contaminants associés à certaines
classes de toxiques (perturbateurs endocriniens, composés dioxin-like, génotoxiques…), il
existe encore un certain nombre de verrous scientifiques et techniques qu’il convient
d’identifier et de lever.
Figure 1 : Exemple de démarche bio-analytique intégrant outils in vitro et analyses chimiques
pour la caractérisation et l’identification de contaminants organiques dans des mélanges
environnementaux complexes.
Page 3 sur 9L’objectif de cette note est de dresser un état des lieux non exhaustif sur les acquis
scientifiques et opérationnels de l’approche EDA et les pistes actuelles de recherche pour
son développement dans un contexte de surveillance des milieux aquatiques. Des actions en
cours identifiées aux niveaux national et international sont ensuite mentionnées.
La première partie s’appuie en grande partie sur un article de synthèse présenté en Annexe
(Dévier et al, article accepté à la revue Compte Rendus Chimie) et dans lequel sont
présentés de manière relativement complète les challenges scientifiques et techniques
actuels inhérents à l’identification de molécules toxiques dans des mélanges complexes. Les
liens avec l’EDA sont explicités. Dans une seconde partie, nous faisons état des travaux en
cours au niveau national (programmes de recherche nationaux) et européens (groupes de
travail NORMAN) concernant le développement des approches EDA dans l’environnement
aquatique.
2. APPROCHES EDA : ETAT DES LIEUX
Définition et principe
Dans son principe, l’approche EDA se divise généralement en différentes phases
interdépendantes (Figure 2), (Brack 2003; Hecker and Hollert 2009).
Figure 2 : Principe général de l’EDA, schéma tiré de Brack (2003).
Dans une première phase, le mélange complexe est soumis à un ou plusieurs
fractionnements et l’activité toxique de chacune des fractions obtenues est évaluée par un
bioessai afin d’identifier et d’isoler les plus actives. Selon l’objectif de l’étude, différentes
stratégies de fractionnement sont possibles. Le cas le plus général implique un
fractionnement en fonction des propriétés physico-chimiques des molécules. Dans tous les
cas, des étapes de sous-fractionnement sont souvent nécessaires pour affiner l’isolement
des molécules actives et optimiser leur identification.
Lorsque la complexité du mélange est réduite à seulement quelques composés, les fractions
actives sont soumises à une phase d’identification et une quantification chimique par des
méthodes d’analyse physico-chimiques. Une combinaison de méthodes (spectrométrie de
masse, RMN, spectrométrie UV-visible…) peut et dans certains cas doit être employée selon
les composés et le degré d’identification moléculaire recherchés (Brack 2003). Enfin, une
fois la molécule identifiée, il s’agit de confirmer son effet biologique in vitro mais aussi
idéalement in vivo. Cette étape de confirmation est essentielle pour établir une relation de
cause à effet fiable et fournir une information utilisable pour la caractérisation du danger.
Page 4 sur 9Application au diagnostic environnemental
Depuis la fin des années 90, la démarche EDA a montré son utilité pour identifier les
contaminants (déjà connus ou nouvellement identifiés) associés à certaines activités
toxiques détectées in situ comme des perturbateurs endocriniens, des composés dioxin-like,
des composés génotoxiques ou écotoxiques. Plusieurs études menées ces 10 dernières
années ont ainsi permis d’identifier les molécules responsables d’effets dans divers
contextes environnementaux ; ces études ont fait l’objet de plusieurs articles de synthèses
(Hecker and Hollert 2009) et, très récemment, d’un ouvrage dédié aux approches EDA
(Brack 2011). En particulier, la publication de (Brack et al. 2007) propose une synthèse de
plusieurs études réalisées sur différents bassins versants européens démontrant la
pertinence et l’efficacité de l’approche EDA pour identifier différentes substances toxiques
dans diverses matrices environnementales telles que des sédiments, eaux de surface ou
effluents.
D’une manière générale, l’approche EDA, au même titre qu’une approche analytique, trouve
son application pour tous types de mélanges complexes. Récemment, le couplage des outils
bio-analytiques avec des échantillonneurs passifs de type POCIS (Polar Organic Compound
Integrative Sampler) ou SPMD (Semi-Permeable Membrane Device) a permis de montrer
l’intérêt de ces apporches pour la détection de composés actifs dans la colonne d’eau
(Creusot et al. 2010; David et al. 2010; Tapie et al. 2011; Vermeirssen et al. 2005).
Toutefois, peu d’études à notre connaissance rapportent le développement d’une démarche
EDA à partir de ce type d’échantillon eut égard au caractère récent du développement de ce
type d’échantillonneurs.
Challenges scientifiques et techniques
Si les démarches EDA développées jusqu’alors ont apporté beaucoup d’informations
nouvelles sur les contaminations chimiques en complément aux approches analytiques plus
classiques, il n’en reste pas moins que plusieurs verrous scientifiques et techniques
demeurent et constituent autant de questionnements de recherche qui sont actuellement
appréhendés pour développer et améliorer les approches EDA. Plusieurs de ces axes de
travail font l’objet d’un article de revue récemment accepté à la revue Compte Rendus
Chimie et présenté en Annexe 1 (Dévier et al. accepté). Cet article dresse une liste
relativement complète des challenges scientifiques majeurs dans l’analyse et la bio-analyse
des mélanges complexes et des développements actuels mis en œuvre pour les prendre en
compte. Nous dressons ci-dessous une liste sommaire de ces défis ; le lecteur pourra se
reporter à l’article de synthèse présenté en Annexe 1 pour une description plus détaillée des
différents aspects énumérés ci-dessous.
- Besoin de nouveaux tests biologiques : l’augmentation du nombre et du type de
polluants aquatiques émergents implique d’une part une meilleure connaissance de leurs
effets pour les populations exposées, mais également de disposer de bioessais pertinents
pour les évaluer. En particulier, des études récentes montrent la présence de nouveaux
types de pharmaceutiques comme les corticoïdes (glucocortocïdes, minéralocorticoïdes) ou
certains stéroïdes comme les androgènes et les progestagènes (Runnalls et al. 2011).
A l’aide de biotests in vitro, des activités toxiques liées à ce type de contaminants ont été
rapportées dans des effluents d’eaux usées (Schriks et al.) ou des sédiments de rivières
(Kinani et al. 2010; Weiss et al. 2009). Ces quelques études récentes plaident pour une
meilleure caractérisation de la contamination des hydrosystèmes par ce type de
contaminants et de leurs impacts sur les organismes aquatiques. Ceci passera entre autre
par le développement de bioessais in vivo sur espèces aquatiques modèles, dans une
perspective de caractérisation du danger de ces molécules, mais également pour leur
détection dans les matrices environnementales. A ce titre, l’utilisation de modèles
transgéniques in vivo basés sur le mode d’action des molécules s’avère très prometteuse
pour la surveillance de ces substances (Brion et al. 2010 ; Fini et al. 2009).
Page 5 sur 9- La connaissance du devenir des substances émergentes, incluant leur transformation
biotique et abiotique, est un point crucial dans l’évaluation du risque. Des études récentes
ont montré l’intérêt de l’EDA pour isoler et identifier des métabolites toxicologiquement actifs
de composés émergents comme des composés pharmaceutiques tels que le diclofénac
(Schulze et al. 2010) ou des cosmétiques tels que la benzophénone (Hayashi et al. 2006).
- Prise en compte de la biodisponibilité dans les tests de toxicité. Les conditions de tests
posent actuellement question quant à la fraction effectivement en contact avec le système
biologique au sein des systèmes d’essais. Le développement de système permettant
d’évaluer et de prendre en compte la fraction effectivement biodisponible dans les approches
EDA est un sujet de développement actuel (Brack et al. 2009).
- Nouvelles stratégies de fractionnement : un des points limitant de l’EDA est l’étape de
confirmation des molécules identifiées au sein de fractions actives, lesquelles sont très
souvent associées à d’autres molécules non actives au sein des mêmes fractions. Pour
pallier cet aspect, l’utilisation de chromatographies d’affinité aux récepteurs cibles permet
d’envisager une purification sélective des polluants selon leur mode d’action toxique
(Fechner et al. 2010; Pillon et al. 2005). Si la preuve de l’utilité du concept a été apportée et
que ce dernier apparaît comme très prometteur (Pillon et al. 2005; Riu et al. 2008),
l’intégration de cet outil dans une démarche EDA complète afin d’éprouver l’outil à différents
types d’échantillons reste à démontrer. Un autre point limitant de l’EDA réside dans la mise
en œuvre de protocole plus ou moins complexes, qui limite son utilisation en routine.
L’utilisation de systèmes automatisés est indéniablement une voie de progrès futur pour
une utilisation relativement plus routinière de cet outil.
- Intégration des approches in silico dans l’identification de molécules actives. Au même
titre que les bioessais in vitro, les modèles de criblage par QSAR peuvent potentiellement
être utilisés pour orienter l’identification des molécules actives au sein d’un mélange
complexe (Balaam et al. 2009).
- Les challenges analytiques porteront notamment sur le développement de nouveaux outils
(e.g. bases de données) pour l’identification et l’élucidation structurale des composés
inconnus, et particulièrement des composés polaires, dans les matrices complexes.
- Besoin de validation de méthode : il s’agira d’avancer dans la fonctionnalité et
l’opérationnalité de l’approche EDA qui, pour la majorité des laboratoires utilisateurs, reste
un outil de recherche avant tout. Une réflexion est actuellement menée dans ce sens au sein
d’un groupe de travail du réseau Norman (groupe WG3, cf. chapitre suivant) dont l’un des
objectif est de démontrer l’utilité de l’approche EDA et son opérationnalité dans le cadre de
contrôles d’enquête et pour la priorisation des substances polluantes.
La majorité des points d’amélioration énoncés ci-dessus sont autant d’axes de recherches
qui sont abordés à différents niveaux dans le cadre de programmes de recherche et de
groupes de travail décrits ci-après.
Page 6 sur 93. ACTIONS ACTUELLES D’APPLICATION ET DE DEVELOPPEMENT DE
L’APPROCHE EDA
Face à l’intérêt maintenant reconnu de l’approche EDA dans les études de surveillance
environnementale de la pollution chimique, un nombre croissant de programmes de
recherche et d’études a vu le jour aux niveaux national et international. Ces travaux
démontrent l’intérêt de l’approche et la nécessité de travailler en réseau eu égard au
caractère multidisciplinaire de la discipline.
Au niveau Européen, plusieurs organismes se sont structurés depuis une dizaine d’années
autour de projets intégrés visant à développer et appliquer les méthodologies EDA.
En particulier, le programme européen MODELKEY (2005-2010, FP6) a permis différentes
avancées tant en termes de développement scientifique et technique que d’application de la
méthode à une problématique de surveillance et de développement de connaissances des
contaminants chimiques toxiques de bassins versants modèles.
Plus récemment, sous l’égide du réseau européen NORMAN, un groupe de travail (WG3,
http://www.norman-network.net/public_docs/divers/norman_wg3_eda_mandate_final_web.pdf) dédié
à l’approche EDA en support aux actions réglementaires de surveillance de la qualité
chimique de la directive cadre sur l’eau a été créé en 2010. Ce WG3 coordonné par
l’université de Leipzig (Dr Werner Brack) regroupe plusieurs acteurs scientifiques,
réglementaires et industriels européens majeurs qui ont contribué au développement de ce
type d’approche. Les principaux objectifs de ce groupe de travail sont 1) de statuer sur les
enjeux actuels de recherche et développement (publication en cours d’un document de
position), 2) de concevoir et proposer un protocole simplifié qui soit utilisable par des
laboratoires chargés de la surveillance, 3) de démontrer l’opérationnalité d’un tel protocole
simplifié au sein d’un programme de démonstration à l’échelle européenne, afin de proposer
des outils fonctionnels et opérationnels aux gestionnaires de l’environnement. Dans ce but,
un réseau intégré de formation (Integrated Training Network, FP7 Marie Curie action)
impliquant plusieurs partenaires du WG3 a été accepté en 2011. Enfin, l’implication du JRC
dans le groupe de travail assurera le transfert d’information vers la DG Environnement.
En France, la structuration de projets partenariaux intégrant des approches EDA est plus
récente mais tend néanmoins à se développer de plus en plus. Ainsi, plusieurs programmes,
intégrant des partenaires académiques et industriels, ont été mis en œuvre et visent à
développer les stratégies EDA. Ces programmes visent soit à aborder des verrous
scientifiques et techniques dans le but d’améliorer les stratégies existantes ou à les étendre
à certaines familles spécifiques de polluants, soit à appliquer des méthodologies existantes à
des études de cas. Les exemples de programme donnés ci-après ne constituent en aucun
cas une liste exhaustive des travaux de recherche menés en France sur le sujet.
Le programme ECOPI, soutenu par le programme 189 du MEEDT, vise à mettre en œuvre
une démarche EDA pour identifier des polluants perturbateurs endocriniens dans les
systèmes aquatiques. Ce projet, qui implique 4 partenaires (INSERM U896, INERIS,
LPTC/CNRS Bordeaux et INRA Toulouse) met en œuvre des outils originaux de détection
biologiques (panel de tests in vitro spécifiques de plusieurs familles de perturbateurs
endocriniens, récepteurs nucléaires recombinants) et analytiques (spectrométrie de masse
très haute résolution) et contribue à la validation et à l’amélioration des stratégies EDA
existantes, notamment en les étendant à des PE actuellement très peu renseignés en
France comme les composés androgéniques ou les polluants polaires (utilisation de
capteurs passifs). Le projet ANR-ECHIBIOTEB, piloté par le Cemagref de Lyon, vise à
appliquer ce type d’outils innovants à la caractérisation de différents procédés de traitement
d’eaux urbaines usées. D’autres projets ANR en cours utilisent ces outils bio-analytiques
pour la caractérisation d’effluents comme par exemple des effluents hospitaliers (ANR-
PANACEE, coord. LGC Toulouse) ou d’élevage agricole (ANR-DIPERPHA, coord INRA
Narbonne) ou leur couplage avec des échantillonneurs passifs (ANR-EMESTOX). D’autres
projets visent à prendre en compte le devenir et la transformation de contaminants
émergents dans les effluents (e.g. projets ANSES/TOXSTEP, Seine-Aval/MEDSEINE, coord.
LPTC Bordeaux).
Page 7 sur 94. CONCLUSION
L’intérêt de l’approche EDA pour le diagnostic environnemental est d’identifier les molécules
dangereuses effectivement présentes sur site, lesquelles sont le plus souvent non prises en
compte par les analyses ciblées a priori. Cette démarche peut s’avérer particulièrement utile
dans le cas de contrôles d’enquête pour identifier les causes responsables d’impacts
constatés sur sites. De plus, l’identification de polluants chimiques responsables d’effets
permettra d’alimenter les réflexions sur l’établissement de listes de substances à surveiller
en priorité.
Aujourd’hui, scientifiques, utilisateurs et gestionnaires de l’environnement semblent
s’accorder sur l’intérêt et l’apport potentiel de cet outil pour une meilleure caractérisation de
l’état chimique des milieux aquatiques. Cependant, si l’utilisation des bioessais est
aujourd’hui opérationnelle en termes de capacité de criblage et d’information sur la qualité
chimique et commence à trouver son application dans la surveillance de sites, l’outil EDA
proprement dit reste pour le moment principalement dédié à des questionnements de
recherche appliquée. En effet, la grande diversité des contaminants environnementaux, tant
en termes de propriétés physico-chimiques que de leurs effets toxicologiques, fait qu’il
n’existe pas une stratégie EDA unique à mettre en œuvre mais qu’il s’agit avant tout
d’adapter et de combiner un panel d’outils disponibles pour répondre à une question
spécifique posée dans un contexte environnemental donné. Un des défis actuels, qui
constitue notamment un objectif phare du groupe de travail WG3 du réseau européen
Norman, consistera donc à rendre accessible cet outil aux utilisateurs finaux et gestionnaires
de l’environnement. L’établissement de protocoles simplifiés, d’un programme de
démonstration et la formation de jeunes chercheurs devrait permettre de poser les bases de
l’utilisation en routine de ce type d’approche pour l’évaluation de la qualité chimique des
milieux aquatiques.
5. REFERENCES
Aït-Aïssa, S. (2009) Outils bio-analytiques in vitro : principe et apports pour la surveillance des
contaminants organiques dans le milieu aquatique. INERIS, Convention cadre INERIS-ONEMA
2008, Verneuil-en-Halatte, p. 26.
Balaam, J.L., Chan-Man, Y., Roberts, P.H. and Thomas, K.V. (2009) Identification of Nonregulated
Pollutants in North Sea-Produced Water Discharges. Environ. Toxicol. Chem. 28, 1159-1167.
Brack, W. (2011) Effect-Directed Analysis of Complex Environmental Contamination, Springer.
Brack, W. (2003) Effect-directed analysis: a promising tool for the identification of organic toxicants in
complex mixtures? Anal. Bioanal. Chem. 377, 397-407.
Brack, W., Bandow, N., Schwab, K., Schulze, T. and Streck, G. (2009) Bioavailability in effect-directed
analysis of organic toxicants in sediments. Trac-Tr. Anal. Chem. 28, 543-549.
Brack, W., Klamer, H.J.C., de Ada, M.L. and Barcelo, D. (2007) Effect-directed analysis of key
toxicants in European river basins - A review. Environ. Sci. Poll. Res. 14, 30-38.
Brion, F., Piccini, B., Le Page, Y., Tong, S., Porcher, J., Chung, B. and Kah, O. (2010) A novel in vivo
assay to assess the estrogenic activity of chemical substances using transgenic cyp19a1b-GFP
zebrafish embryos., The zebrafish embryo model in toxicology and teratology, Karlsruhe, 2nd-3rd
September 2010.
Creusot, N., Kinani, S., Balaguer, P., Tapie, N., LeMenach, K., Maillot-Maréchal, E., Porcher, J.M.,
Budzinski, H. and Aït-Aïssa, S. (2010) Evaluation of an hPXR reporter gene assay for the detection
of aquatic emerging pollutants: screening of chemicals and application to water samples. Anal.
Bioanal. Chem. 396, 569-583.
David, A., Gomez, E., Ait-Aissa, S., Bachelot, M., Rosain, D., Casellas, C. and Fenet, H. (2010)
Monitoring organic contaminants in small French coastal lagoons: comparison of levels in mussel,
passive sampler and sediment. J. Environ. Monitor. 12, 1471-1481.
Fechner, P., Gauglitz, G. and Gustafsson, J.A. (2010) Nuclear receptors in analytics - a fruitful joint
venture or a wasteful futility? Trac-Tr. Anal. Chem. 29, 297-305.
Fini, J.B., Pallud-Mothre, S., Le Mevel, S., Palmier, K., Havens, C.M., Le Brun, M., Mataix, V.,
Lemkine, G.F., Demeneix, B.A., Turque, N. and Johnson, P.E. (2009) An Innovative Continuous
Flow System for Monitoring Heavy Metal Pollution in Water Using Transgenic Xenopus laevis
Tadpoles. Environ. Sc. Technol. 43, 8895-8900.
Page 8 sur 9Hayashi, T., Okamoto, Y., Ueda, K. and Kojima, N. (2006) Formation of estrogenic products from
benzophenone after exposure to sunlight. Toxicol. Lett. 167, 1-7.
Hecker, M. and Hollert, H. (2009) Effect-directed analysis (EDA) in aquatic ecotoxicology: state of the
art and future challenges. Environ. Sci. Poll. Res. 16, 607-613.
Kinani, S., Bouchonnet, S., Creusot, N., Bourcier, S., Balaguer, P., Porcher, J.M. and Aït-Aïssa, S.
(2010) Bioanalytical characterisation of multiple endocrine- and dioxin-like activities in sediments
from reference and impacted small rivers. Environ Pollut 158, 74-83.
Pillon, A., Boussioux, A.M., Escande, A., Aït-Aïssa, S., Gomez, E., Fenet, H., Ruff, M., Moras, D.,
Vignon, F., Duchesne, M.J., Casellas, C., Nicolas, J.C. and Balaguer, P. (2005) Binding of
estrogenic compounds to recombinant estrogen receptor alpha : Application to environmental
analysis. Environ. Health Perspect. 113, 278-284.
Riu, A., Balaguer, P., Perdu, E., Pandelova, M., Piccinelli, R., Gustafsson, J.A., Ledercq, C.,
Schramm, K.W., Dagnino, S., Debrauwer, L., Cravedi, J.P. and Zalko, D. (2008) Characterisation
of bioactive compounds in infant formulas using immobilised recombinant estrogen receptor-alpha
affinity columns. Food Chem. Toxicol. 46, 3268-3278.
Runnalls, T.J., Margiotta-Casaluci, L., Kugathas, S. and Sumpter, J.P. (2011) Pharmaceuticals in the
Aquatic Environment: Steroids and Anti-Steroids as High Priorities for Research. Hum. Ecol. Risk
Assess. 16, 1318-1338.
Schriks, M., van Leerdam, J.A., van der Linden, S.C., van der Burg, B., van Wezel, A.P. and de Voogt,
P. (2010) High-Resolution Mass Spectrometric Identification and Quantification of Glucocorticoid
Compounds in Various Wastewaters in The Netherlands. Environ. Sci. Technol. 44, 4766-4774.
Schulze, T., Weiss, S., Schymanski, E., von der Ohe, P.C., Schmitt-Jansen, M., Altenburger, R.,
Streck, G. and Brack, W. (2010) Identification of a phytotoxic photo-transformation product of
diclofenac using effect-directed analysis. Environ. Pollut. 158, 1461-1466.
Tapie, N., Dévier, M.H., Soulier, C., Creusot, N., Le Menach, K., Aït-Aïssa, S., Vrana, B. and
Budzinski, H. (2011) Passive samplers for chemical substance monitoring and associated toxicity
assessment in water. Water Science and Technology 63, 2418-2426.
Vermeirssen, E.L.M., Korner, O., Schonenberger, R., Suter, M.J.F. and Burkhardt-Holm, P. (2005)
Characterization of environmental estrogens in river water using a three pronged approach: Active
and passive water sampling and the analysis of accumulated estrogens in the bile of caged fish.
Environ. Sci. Technol. 39, 8191-8198.
Weiss, J.M., Hamers, T., Thomas, K.V., van der Linden, S., Leonards, P.E.G. and Lamoree, M.H.
(2009) Masking effect of anti-androgens on androgenic activity in European river sediment unveiled
by effect-directed analysis. Anal. Bioanal. Chem. 394, 1385-1397.
6. ANNEXE
Annexe 1 : Article de Dévier et al, Comptes Rendus chimie, accepté en mars 2011.
Page 9 sur 9Annexe 1 - Article accepté à Comptes Rendus Chimie
New challenges in environmental analytical chemistry: Identification of toxic
compounds in complex mixtures
Nouveaux défis en chimie analytique environnementale : Identification des composés
toxiques en mélanges complexes
Marie-Hélène Dévier1a,b, Patrick Mazellier1a,b, Sélim Aït-Aïssa2, Hélène Budzinski1a,b*
1
Institut des Sciences Moléculaires (ISM, UMR 5255 CNRS), Laboratoire de Physico- et
Toxico-Chimie de l’Environnement (LPTC), Université Bordeaux 1, 351 cours de la
Libération, 33405 Talence cedex, France
a
Université de Bordeaux, UMR 5255, ISM, Groupe LPTC, Talence, F-33405 France
b
CNRS, UMR 5255, ISM, Groupe LPTC, Talence, F-33405 France
2
Institut National de l’Environnement Industriel et des Risques (INERIS), Unité
Écotoxicologie in vitro et in vivo, Parc ALATA, BP2, F-60550 Verneuil-en-Halatte, France
* Corresponding author: Hélène Budzinski
E-mail: h.budzinski@ism.u-bordeaux1.fr
Phone: +33 5 40 00 69 98
Fax: +33 5 40 00 22 67
Abstract
Toxic effects evidenced the environment are most often caused by mixtures of known
and unknown pollutants. One of the key challenges in environmental chemistry and
ecotoxicology is to characterize and identify those toxicants in relation with the effect.
However, many of the current bottlenecks in the assessment of organic contaminants in our
environment are related to the difficulty of evaluating various chemical classes and biological
effects within complex mixtures and more precisely to link both approaches. To tackle these
analytical challenges, the bioanalytical concept has emerged during the last decade.
In this paper, we describe through some outstanding examples the current limitations
in the chemical-driven approach such as problems encountered for a correct evaluation of
water quality when the continuous introduction of new chemicals has to be taken into account
in monitoring for correct evaluation of this quality and could led to tremendous analytical
costs or some of the integrated bioanalytical approaches as promising powerful tools to
improve environmental risk assessment by taking into account the link presence/effect.
Keywords: emerging contaminants; transformation products; mass spectrometry; bioanalysis;
effect-directed analysis1. Introduction
In Europe, increasingly restrictive regulations take into account the problem of release
of chemicals and especially of organic chemicals in the environment: the European Water
Framework Directive (WFD – 2000/60/EC), the European Marine Strategy Directive (MSD –
2008/56/EC), the European Soil Framework Directive (SFD – 2004/35/EC), the Biocides
Directive (Council Directive 98/8/EC) and more recently, the European Regulation for
Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals (REACH). However, to
date, about 16 million compounds are known and registered in the Chemical Abstracts
Service (CAS) and of course all these compounds are not subjected to specific regulations.
For example, chemical quality assessment of water resources is based on chemical analysis of
priority pollutants as laid down in the WFD. About 60 compounds have been selected as
priority pollutants in different priority categories. Concerning the quality of water resources
used for drinking water production, maximal concentration have been established for several
water contaminants (Council Directive 98/83/EC). Among these organic contaminants, the
level of pesticides is particularly controlled. The regulation concerning drinking water
production also includes some relevant metabolites or some relevant degradation products.
There is a tremendous discrepancy between the number of compounds potentially
present in the environment and the number of regularly monitored priority pollutants.
Actually, one of the difficulties encountered in accurately assessing the organic contamination
of environmental systems is that there are multiple contaminants (multiple sources, multiple
chemical classes) associated with both low concentration levels and considerable temporal
and spatial variability. Analyzing several classes of compounds present at trace or ultra-trace
concentrations (ppb or ppt) requires the use of different, apparatus, protocols, and each
protocol involves different sample preparation methods. These requirements are very time-
consuming and costly. It clearly appears that the chemical monitoring of all compounds in
every compartment is impossible and target analysis of preselected sets of pollutants often
misses site specific toxicants (that in addition remain unknown for many of them) and is
therefore not able to explain ecotoxic effects of complex environmental samples.
Moreover, as chemical compounds, organic contaminants are reactive compounds that
react in environmental and aquatic systems more or less rapidly. Well known transformation
reactions include physico-chemical processes (hydrolysis, reactions induced by light,
reactions with oxidants used in drinking water production) and biological processes (with free
bacteria or biofilm, or metabolization). These transformation reactions lead to the formation
of numerous transformation products for which, in most case, almost nothing is known. The
formation of several transformation products arising from the numerous contaminants present
in aquatic systems increases the complexity of the problem, notably because some of them
can be more persistent and/or more toxic than their parent compounds. The universe of
chemicals keeps expanding because of the need to include metabolites and transformation
products when evaluating the risk from a certain chemical [1].
Numerous studies combining chemical and biological approaches to hazard assessment of
complex environmental mixtures indicate that priority pollutant concentrations are a poor
indicator of toxicity [2,3]. Thus, it is evident that the aim to assess and forecast the impact of
chemical pollution cannot be met on the basis of priority pollutant analysis alone.Beside a chemical-driven strategy for assessing the ecological risk from pollutants, it
is necessary to explore and to apply new strategies, combining both biological responses and
chemical analyses, to identify toxic hot-spots, to characterize chemicals likely to cause
adverse biological effects, and, finally, to assess the ecological risk of the identified chemicals
at relevant spatial scales [4,5]. Combined biological and chemical-analytical approaches
provide an important progress towards an estimation of the portion of an effect that can be
explained by the analyzed chemicals. In particular, mechanism-based in vitro bioassays using
recombinant cell systems in which specific biological effects are directly measured can
provide valuable information about the expected total potency of the complex mixture of
chemicals in an environmental sample [6]. Nevertheless, the link between the two approaches,
i.e. linking chemical exposure and observed biological effects, is not straightforward when
dealing with complex mixtures of contaminants. In this connection, integrated strategies such
as effect-directed analysis (EDA) can be a powerful tool to elucidate unknown causative
toxicants in complex environmental samples and their combined effects, thus improving
environmental risk assessment. EDA approaches combine chemical and biological methods in
order to direct chemical analyses to those compounds that actually cause effects [7,8]. The
complexity of samples is sequentially reduced by removing non-toxic fractions while major
toxicants are isolated and identified [7].
In addition, using passive sampling instead of classical spot water sampling could also
help to improve environmental risk assessment; by their ability to concentrate bioavailable
sediment and waterborne pollutants (and thus to take also into account of pollutants
undetectable by conventional methods), these integrative passive devices allow increasing
representativeness and reliability of the data obtained [9]. Furthermore, they can collect
extracts of chemicals for either chemical analysis or bioanalysis and there are therefore
advantages to be gained from combining the use of passive sampler extracts and bioanalyses,
and in particular EDA.
In this paper, we describe through some outstanding examples the current limitations
in the chemical-driven approach when confronted to new chemicals that have to be integrated
in monitoring of water quality to take into consideration the continuous increase of used and
produced chemicals and their transformation products and some of the integrated
bioanalytical approaches as powerful tools to improve environmental risk assessment. Like
many of our colleagues from the scientific community, we encourage the development of new
monitoring strategies to respond more accurately to the current societal questions.
2. New challenging compounds: emerging contaminants and transformation products
The following paragraph does not aim at making an exhaustive review of what could
be found as emerging contaminants or as transformation and/or by-products (TPs) but just
focusses on some illustrative examples of new challenging compounds: polar forms that can
be addressed in relation with LC and especially LC/MS (MS/MS and TOF-MS) progresses,
new forms of problematic pollution (not due to classical persistence but to continuous
introduction in the environment), and the need to identified & monitored TPs for a better
environmental risk assessment of organic contaminants.2.1. Emerging contaminants
Many environmental questions arising from the presence of pollutants in
environmental and aquatic systems remain to be addressed, since new chemical compounds or
classes of new compounds are continuously developed, brought to the market and at the end
“arise” in the environment [10]. After having tackled priority pollutants from the seventies
(mainly coming from technical processes and products), it is now crucial to also turn toward
the emerging contaminants.
This group of organic compounds corresponds in most cases to unregulated
contaminants, which may be candidates for future water-quality regulation depending on their
potential health or ecotoxicological effects and on monitoring data regarding their occurrence.
They encompass a diverse group of compounds, including drugs of abuse, pharmaceuticals,
personal-care products (PCPs: fragrances, antimicrobials, UV screens, antioxidants and
preservatives, and insect repellents), steroids and hormones, surfactants, perfluorinated
compounds (PFCs), flame retardants, industrial additives and agents, and gasoline additives,
as well as their transformation products (TPs). In addition, three new classes have to be added
to the list of emerging pollutants: nanomaterials, 1,4-dioxane and swimming-pool disinfection
by-products (DBPs) beside classical DBPs regulated in drinking water production such as
THMs (trihalomethanes).
The issue of emerging contaminants is closely related to analytical performances
concerning their monitoring in various environmental compartments. With the development
of sophisticated and sensitive analytical apparatus and procedures (see also Section 3) more
and more pollutants, in particular pharmaceuticals and personal-care products (PPCPs), can be
detected at trace levels in the environment [11]. Consequently, a number of new or previously
ignored and/or unrecognized contaminants have been brought under scrutiny. However, it is
still necessary to further improve rapid and sensitive analytical procedures, in particular in
two directions: on one hand, high sensitivity at ultra-trace levels, and on the other hand,
versatility in simultaneous screening for a wide variety of compounds with large differences
in physicochemical properties (e.g., log Kow, high water solubility, zwitterionic form
according to pKa …) [12].
Of all the emerging contaminants, pharmaceuticals and personal-care products (PPCPs) are
currently the most studied compounds. Several data concerning their monitoring in surface
waters have been published in the last fifteen years due to a significant improvement of
analytical procedures and apparatus. The characteristic of these groups of contaminants is that
they do not need to persist in the environment since they are continuously introduced via
urban wastewaters. In this way, they can be considered as “pseudo-persistent” compounds.
Numerous studies showed that pharmaceuticals are not completely eliminated in wastewaters
treatment plants (WWTPs) [e.g., 13-16] and that some of them can be present at levels up to
micrograms per liter, in rivers, streams, lakes, and even in groundwater [17-19]. The presence
of PPCPs in WWTP effluents may also lead to the contamination of drinking water resources
because of their quite polar structure and therefore high mobility [20]. Their occurrence has
already been reported in drinking water of several large European cities as Berlin [21] or
Milano [22]. The concentrations measured are far lower than those used in medical
prescriptions but the daily consumption of drinking water leads to chronic exposurefor which potential toxic effects are poorly known (e.g., bioresistance of bacteria to
antibiotics …). With increasing knowledge of their environmental occurrence, there is a
growing interest on their environmental fate and toxicological impact. Numerous studies
dealing with hormonal steroids illustrate their potential implication in endocrine disruption
phenomena but when considering the other pharmaceutical classes (e.g. antibiotics)
information on their ecotoxicity, persistence and fate of pharmaceuticals and their
transformation products in the environment are scarce [23-28]. All these substances have been
designed to be biologically active but their potential action on aquatic organisms has not been
described in details until now. Thus there is a real need to document their potential
ecotoxicological impact. A guideline has been recently published by the European Medicines
Agency (EMEA) to describe the assessment of potential environmental risks of human and
veterinary medicinal products, from general considerations to environmental risk assessment
and safety measures to be considered [29,30]. However, some studies have already evidenced
the toxicity of some pharmaceuticals [e.g., 31-34] and some PCPs have been suspected
endocrine-disrupting compounds (EDCs) [e.g., 35-39]. In the terrestrial environment, the
decline of the vulture population in Pakistan since the 1990ies due to renal failure is the most
important striking effect that has been reported for Diclofenac (anti-inflammatory) [31].
Moreover, there is some evidence of potential interactive effects of PPCPs, so that low doses
may lead to cumulative stress and synergic toxicity effects in exposed organisms [40,41]. As
shown for some β-blockers, even when their toxicity as individual compounds is negligible,
they might act in an additive manner in a mixture with other β-blockers exhibiting the same
mode of action [42]. Also, antibiotics present in the environment could lead to selection of
resistant bacterial strains [43].
Another aspect raised by Hogenboom et al. [44] in this field is that the European
REACH legislation will possibly drive producers to develop newly designed chemicals that
will be less persistent, bioaccumulative or toxic. If this innovation leads to an increased use of
more hydrophilic chemicals it may result in higher mobilities of chemicals in the aqueous
environment and of course in water resources used for drinking water production. As a result,
drinking water companies may face stronger demands on removal processes as the
hydrophilic compounds inherently are more difficult to remove by adsorption onto active
carbon (granular or powder) for example. Monitoring efforts will also experience a shift in
focus to more water-soluble compounds [44]. It should be also noticed that REACH is for the
moment limited to industrial chemicals and does not consider other compounds such as
pharmaceuticals and biocides.
The study of the ecotoxicity of an organic contaminant is hampered by the difficulty of
knowing the nature and toxicity of its transformation products. Shortly, faced with a great
number of emerging pollutants and the greatly larger number of metabolites and degradation
products, there is a crucial lack of reliable data to assess their environmental and human
health risks. For all these unknown compounds, very scarce information is available about
their chemical and biochemical properties, and their potential interactive effects within
complex mixture. Currently, there is an increasing concern regarding the formation of
transformation products since there are evidences indicating that they can be more toxic andpersistent than parent compounds. In fact, transformation products are considered
relevant within the group of emerging contaminants [45].
2.2. Transformation products
Some relatively inert molecules persist in the environment and are difficult to degrade.
These compounds can be toxic and accumulate in food chains to present additional human
and ecological risks. Others can be degraded to transformation products (TPs). Organic
pollutants undergo various degrees of transformation in processes and in the environment,
leading to a modification of the starting chemical structure and resulting in a cocktail of
parent compounds and TPs in the environment.
Chemical transformations of the organic compounds can be biotic or abiotic.
Photodegradation in sunlit aquatic systems can play a significant role beside biodegradation in
eliminating those chemicals in the environment. For chemicals that are only poorly
biodegraded, especially in biological treatments of WWTPs, photodegradation may represent
a major route of degradation. On the contrary, whereas some compounds can evade
photochemical reactions because they are not exposed to sunlight (e.g., when adsorbed onto
particles or in the subsurface), microbial transformation processes dominate in removal of
these organic compounds. As far as water resources are concerned, it is also necessary to
distinguish between degradation products arising from naturally occurring processes
(biodegradation, hydrolysis, sunlight photodegradation …) and degradation products arising
from reaction in water treatment processes (biodegradation within biofilms, reactions with
ozone and chlorine …). In the field of drinking water production, disinfection by-produts
(DBPs) are regulated for more than 30 years but the regulation only focused on small size,
final DBPs such as THM (trihalomethanes), HAA (halogenated acetic acid), NDMA
(nitrosodimethylamine) which mainly arise from reactions between disinfectants and
dissolved organic material including organic pollutants [46]. Their toxic (carcinogenic and/or
genotoxic) effects are well known [46]. However, these DBPs are formed after successive
oxidation reactions (final transformation products) but intermediate transformation products
from pesticides or PPCPs are rarely studied. Biological processes will similarly occur but
other processes may give rise to specific transformation products according to the reagent
involved.
In the environment, chemical transformation reactions mainly consist in hydrolysis
and light-induced reactions. The phototransformation reactions can be distinguished in direct
photoreactions when the contaminant absorbs light, and indirect reactions when absorption of
light by water components e.g. nitrate ions or organic matter generated reactive species
(radicals, electrons,…) able to provoke organic contaminants degradation. The set of
degradation reactions is strongly dependant of the molecular structures of the pollutant and of
the medium.
Hydrolysis processes are generally slow in natural aquatic medium with pH ranging between
6.5 and 8.5. Therefore, the formation of hydrolysis products is generally not considered.
However, some compounds may react quite efficiency and their lifetime in water may be
significantly impact by hydrolysis process. As an example, some carbamate (N-methyl
carbamate) pesticides are only very stable in water: the half-live of Oxamyl has beenreported to be about 30 h in water at pH=8 leading to the formation of oxime
derivative [47]. For this pesticide, solar phototransformation will not occur.
Sunlight direct phototransformation processes firstly depend on the rate of light
absorption of pollutants. Usually direct phototransformation is low for example for pesticides
but several PPCPs and especially several pharmaceuticals undergo very rapid direct
phototransformation. It would be very long to review the published results concerning the
phototransformation of PPCPs but the several examples reported here show the complexity of
the phenomenon. The famous anti-inflammatory Diclofenac undergoes phototransformation
very efficiently into carbazole derivative and hydroxyl-diclofenac as the main photoproducts
[48]. There are a lot of data concerning the presence of Diclofenac in river water but no data
even qualitative is given concerning the presence of known photoproducts, although
phototransformed Diclofenac has been reported to be five times more toxic to green algae
compared to the parent compound [49]. Naproxen (anti-inflammatory) also undergoes rapid
solar phototransformation and the photoproducts were shown about ten fold more toxic than
parent compound for ceriodaphnia, but they did not induce any genotoxicity [50]. On the
opposite side, photoproducts of Furosemide (diuretic agent) shown a mutagenic potential
compared to parent drug [51] and phototransformation of corticosteroids (Prednisone,
Prednisolone, Dexamethasone) were more toxic than parent drugs (C. Dubia reproduction
7d.) [52,53]. Some others PPCPs keep the properties of the parent compound (e.g., antibiotic
activity) as demonstrated with some dehydrated products of tetracyclines [54] and
photodegradation products of fluoroquinolo
the ne antibiotic floxacin
o [ 55], or lose
antimicrobial activity and toxicity. No general rules can be given concerning the formation of
photoproducts since the efficiency and the reaction pathways strongly depend on product
chemical structures.
Indirect phototransformation processes in water are mainly due to the presence of
nitrate ions and natural organic matter. Nitrate ions, even if their concentration is usually quite
low, may provoke the formation of nitration products [56]. Few field studies reported low
concentration of nitration products arising from these processes, especially with phenylurea
and phenoxyacetic acid pesticides [57,78]. The formation of nitro derivative may increase the
long term genotoxic impact of these pesticides [59].
All environment-relevant processes are simultaneous and therefore the competition
will exist between all degradation processes. The case of reactions with reagents used in water
treatment (ozone, chlorine) can be illustrated by several examples. The resin monomer
Bisphenol A reacts very efficiently with chlorine to form chlorinated Bisphenol A in the early
stages of the reaction. The mixture shows strong estrogenic activity (24 times than BPA itself)
as demonstrated recently [60]. Similarly, the chlorination of Acetaminophen (Paracetamol)
leads to the formation of toxic compounds such as benzoquinone and benzoquinone-imine
[61].
Moreover, when the overall set of transformation reactions are taken into account, it is
necessary to consider that some transformation processes will be successive according to the
life cycle of a particular contaminant. Triclosan, a very common antimicrobial agent, can be
classified in the group PPCPs. Triclosan, released in wastewaters, reacts with residual
chlorine, leading to the formation of chlorinated derivatives. It has recently been
demonstrated that the sunlight photodegradation of these derivatives, not eliminated bywastewater treatment plants, leads to the formation of toxic polychlordibenzo-p-dioxin
[62]. Additionally, the sunlight phototransformation of Triclosan is a well-known process [63]
but it also generates chlorophenol derivatives [64].
Biotic processes commonly produce compounds of increased polarity whose different
physico-chemical properties result in distinct environmental behaviour. Plants and animals
can detoxify or excrete contaminants after uptake, but accumulation in adipose tissue or the
absence of appropriate enzyme systems necessary for biotransformation can hamper
elimination of the contaminants. Organic pollutants can also be microbiologically transformed
in WWTPs, which are not initially designed to reduce and to minimize the release of
potentially harmful compounds into the aquatic environment. Many organic compounds are
biodegraded by organisms that utilize the compounds as an energy source.
Either used for human consumption or as veterinary products, pharmaceuticals are
excreted in their original form or as metabolites (free or conjugated) [65]. Some examples of
metabolites of pharmaceuticals (human metabolites as well as microbial metabolites formed
during environmental biodegradation) in the environment can be found in recent reviews
[66,26]. In WWTPs, microorganisms play an important role in the transformation of emerging
pollutants. In a recent study, Kosjek et al. demonstrated that the biodegradation of Diclofenac
leads to the formation of quinone-imine, nitro-diclofenac and hydroxyl-diclofenac in a reactor
simulating a WWTP biological reactor [67]. The biological treatment of 17α-ethinylestradiol
(EE2) and 17β-estradiol (E2) in WWTPs to reduce the estrogenicity of the effluent, prior to it
being discharged into the environment, has been of great interest to many scientists and
engineers [68]. Few studies on EE2 and E2 biodegradation (using activated-sludge systems,
pure microorganism cultures or enzyme extracts) have identified some of their metabolites,
mainly estrone (E1), but also some polar organic acids or keto-, hydroxyl-, and glucoside-
derivatives [69-72]. Some metabolites of pollutants have also been shown to be more toxic
and/or to be more persistent than parent compounds. As a good example, DDE, a DDT
metabolite, is more persistent than DDT and was also shown to be more genotoxic than its
parent compound in the Zebra mussel (Dreissena polymorpha). The herbicide diuron
constitutes also good example, as demonstrated for its metabolite 3,4-dichloroaniline (DCA)
versus Vibrio Fisheri [73]. The biodegradation of alkylphenol polyethoxylates (APEOs) in
WWTPs leads to the formation of metabolites more toxic, more lipophilic, more estrogenic
and more persistent than the parent substances [74,75].
Some metabolites can be also used as biomarkers of exposure to different pollutants, notably
pesticides. For instance, the presence of TPs in farmer’s human biological fluids has shown to
be an indicator of occupational exposure to agrochemical compounds [76,77]. A very good
example of the usefulness of monitoring pollutant metabolites is the use of polycyclic
aromatic hydrocarbon (PAH) metabolites as PAH exposure biomarkers. To assess the
significance of PAH contamination on organisms, the quantification of bioaccumulated PAHs
in tissues is usually carried out. However, depending on the ability of organisms to metabolize
PAHs, measurement of the bioaccumulated part of the absorbed PAHs can be restrictive and
not representative of the environmental contamination [78]. Moreover, PAHs can be
extensively metabolized into more toxic molecules than parent ones [79]. In this way, the
study of PAH fate in marine organisms appears to be necessary in order to access
bioavailability and toxicity of those contaminants. Moreover, biliary metabolites of PAHsVous pouvez aussi lire
