LEUCOCIDINE DE PANTON VALENTINE : FACTEUR INDEPENDANT DE GRAVITE DES PNEUMONIES A STAPHYLOCOCCUS
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LEUCOCIDINE DE PANTON VALENTINE :
FACTEUR INDEPENDANT DE GRAVITE
DES PNEUMONIES A STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
Investigateur Coordinateur
Pr. F. Vandenesch
Centre National de Références des Staphylocoques
Centre de Biologie et Pathologie Est
59 bd Pinel
69677 Bron cedex
tel: (33) (0)4 72 35 72 52
fax: (33) (0)4 72 35 73 35
francois.vandenesch@univ-lyon1.fr
Collaborateurs référents
Réanimation : Pr. L. Argaud
laurent.argaud@chu-lyon.fr
Pédiatrie : Dr. Y. Gillet
yves.gillet@chu-lyon.fr
Epidémiologie : Dr. M. Saadatian-Elahi
Mitra.saadatian-elahi@recherche.univ-lyon1.fr
Responsable Bio-thèque
Dr. M.T. Zabot
marie-therese.zabot@chu-lyon.fr
Responsable étude génétique
Dr. C. Picard
capucine.picard@inserm.fr
Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 -1-TABLE DE MATIÈRE
SYNOPSIS............................................................................................................................................................................. 4
RESUME ........................................................................................................................................................................... 5
1. INFORMATIONS GÉNÉRALES ..................................................................................................................................... 6
2. JUSTIFICATION SCIENTIFIQUE ET DESCRIPTION GÉNÉRALE DE LA RECHERCHE ......................................................... 7
2.1. INTRODUCTION ............................................................................................................................................................ 7
2.2. DONNÉES DE LA LITTÉRATURE ET PRÉ-REQUIS..................................................................................................................... 7
2.2.1. La pneumonie nécrosante à S. aureus PVL+..................................................................................................... 7
2.2.2. Aspects thérapeutiques.................................................................................................................................... 8
2.2.3. Immunité innée anti staphylococcique............................................................................................................. 8
2.3. DESCRIPTION DE LA POPULATION D’ETUDE ...................................................................................................................... 10
2.4. BENEFICES ET RISQUES PREVISIBLES ................................................................................................................................ 10
3. OBJECTIFS DE LA RECHERCHE .................................................................................................................................... 11
3.1. OBJECTIF PRINCIPAL.................................................................................................................................................... 11
3.2. OBJECTIF SECONDAIRES................................................................................................................................................ 11
4. CONCEPTION DE LA RECHERCHE................................................................................................................................. 12
4.1. CRITÈRES D’ÉVALUATION .............................................................................................................................................. 12
4.2. METHODOLOGIE DE LA RECHERCHE ............................................................................................................................... 12
4.3. DEROULEMENT DE LA RECHERCHE ................................................................................................................................. 12
4.3.1. Mode de recrutement des patients ............................................................................................................... 12
4.3.2. Recueil des données ....................................................................................................................................... 13
4.3.3. Actes, examens et prélèvements.................................................................................................................... 13
Bactériologie ............................................................................................................................................................ 13
Biochimie et immunologie........................................................................................................................................ 14
4.3.4. Acheminement des prélèvements .................................................................................................................. 14
4.3.5. Mise en bio-thèque ........................................................................................................................................ 15
4. 4. DETAILS DIVERS ......................................................................................................................................................... 15
5. SÉLECTION ET EXCLUSION DES PERSONNES DE LA RECHERCHE ................................................................................ 16
5.1. CRITÈRES D’INCLUSION ................................................................................................................................................ 16
PROPOSANTS .................................................................................................................................................................... 16
PARENTS ET FRATRIE DU PROPOSANT ..................................................................................................................................... 16
5.2. CRITÈRES DE NON INCLUSION ........................................................................................................................................ 16
6. TRAITEMENT ADMINISTRÉ AUX PERSONNES QUI SE PRÊTENT À LA RECHERCHE ...................................................... 16
7. ÉVALUATION DE L’EFFICACITÉ ................................................................................................................................... 17
8. ÉVALUATION DE LA SÉCURITÉ ..................................................................................................................................... 17
9. EVENEMENTS INDÉSIRABLES ....................................................................................................................................... 17
9.1. DÉFINITIONS ......................................................................................................................................................... 17
9.2. MODALITÉS DE DÉTECTION ET DE RECUEIL DES ÉVÈNEMENTS INDÉSIRABLES .................................................. 17
9.3. CONDUITE À TENIR PAR L’INVESTIGATEUR EN CAS D'ÉVÉNEMENT GRAVE ........................................................ 17
10. STATISTIQUES............................................................................................................................................................. 18
10.1. DESCRIPTION DES MÉTHODES STATISTIQUES PRÉVUES ..................................................................................................... 18
10.2. NOMBRE PRÉVU DE PERSONNES À INCLURE ................................................................................................................... 18
11. DROIT D'ACCÈS AUX DONNÉES ET DOCUMENTS SOURCE .......................................................................................... 19
12. CONTRÔLE ET ASSURANCE DE LA QUALITÉ .............................................................................................................. 19
Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 -2-13. CONSIDÉRATIONS ÉTHIQUES ..................................................................................................................................... 20
13.1. CONSENTEMENT ÉCLAIRÉ ÉCRIT ................................................................................................................................... 20
13.2. ANONYMAT, CONFIDENTIALITÉ .................................................................................................................................... 20
13.3 COMITE DE PROTECTION DES PERSONNES ET AUTORITÉ COMPÉTENTE ................................................................................. 21
13.4 MODIFICATIONS SUBSTANTIELLES.................................................................................................................................. 21
13.5 INTERDICTION DE PARTICIPATION SIMULTANÉE A UNE AUTRE RECHERCHE ET PÉRIODE D’EXCLUSION ............................................ 21
14. TRAITEMENT DES DONNÉES ET CONSERVATION DES DOCUMENTS ET DES DONNÉES RELATIVES À LA RECHERCHE
.......................................................................................................................................................................................... 21
15. FINANCEMENT ET ASSURANCE................................................................................................................................... 21
16. RÈGLES RELATIVES À LA PUBLICATION .................................................................................................................... 21
17. LISTE DES ANNEXES ................................................................................................................................................... 22
Lettres d’information ..................................................................................................................................................... 22
Consentement éclairé...................................................................................................................................................... 22
Fiche de recueil des données .......................................................................................................................................... 22
Fiche d’observation famille............................................................................................................................................ 22
18. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.............................................................................................................................. 22
Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 -3-SYNOPSIS
Titre de l’étude Leucocidine de Penton Valentine : Facteur indépendant de
gravité des pneumonies à Staphylococcus Aureus.
Promoteur Hospices Civils de Lyon, Délégation à la Recherche Clinique et à
l’Innovation. 3, quai des Célestins. BP2251, 69229 LYON Cedex
02
Centre coordinateur Centre National de Références des Staphylocoques
Centre de Biologie et Pathologie Est, 59 bd Pinel
69677 Bron cedex
Soutien financier PHRC interrégional 2010
Etablissements participants Plusieurs établissements de santé à travers la France (voir pages
6 et 7).
Période d’étude 3 ans
Design de l’étude Etude de cohorte comportant :
- Un volet observationnel parmi les personnes présentant une
pneumonie communautaire à s. aureus
- Un volet interventionnel immunogénétique parmi les patients
présentant une pneumonie à s. aureus producteur de PVL et les
membres de leur famille
Objectifs - Confirmer le rôle de la PVL comme facteur de gravité
indépendant des pneumonies à S. aureus.
- Rechercher une éventuelle prédisposition génétique rendant
certains patients susceptible aux pneumonies nécrosantes à s.
aureus producteur de PVL.
Taille de l’échantillon
Volet observationnel - 97 patients avec une pneumonie à s. aureus producteur de PVL
(PVL+) et 97 patients PVL-
Volet immunogénétique - 40 patients PVL+ et 90 membres de leurs familles
Critères d’inclusion - Patient âgé de 2 mois minimum et pesant au minimum 5 kgs
- Consentement éclairé
Volet observationnel - Sujets affiliés (ou bénéficiaire) à un régime de sécurité sociale.
- Présence de signes cliniques, biologiques et radiologiques de
pneumopathie à S. aureus dont l’état clinique justifie une
hospitalisation dans une unité de réanimation ou de surveillance
continue
Volet immunogénétique - Présence de s. aureus producteur de PVL
Critères de non inclusion - Proposant infectés par le VIH
- Proposants hospitalisés depuis plus de 48 heures au moment du
diagnostic de pneumopathies,
- Proposants hospitalisés au cours des trois mois précédents
excepté en hospitalisation du jour
Analyse des données - Statistiques descriptives
- Analyses de survie, régression logistique
- Analyse de liaison génétique
Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 -4-RESUME Staphylococcus aureus est un agent pathogène colonisant 20 à 30% de la population générale et entrainant un large spectre de maladies. Environ 3% des souches de S. aureus expriment un facteur de virulence appelé la Leucocidine de Panton-Valentine (PVL). Les pneumonies nécrosantes à S. aureus producteur de PVL sont des pneumonies sévères mise en évidence pour la première fois en 2002 par notre équipe du Centre National de Référence des Staphylocoques à Lyon. La comparaison des caractéristiques cliniques et biologiques de 16 cas de pneumonie à S. aureus PVL+ et de 36 cas PVL- a permis de démontrer que cette infection sévère survenait préférentiellement chez des enfants ou des adultes jeunes (âge médian 14.8 ans) avec d’emblée un tableau clinique bruyant nécessitant souvent une hospitalisation en réanimation. Les caractéristiques cliniques associées étaient l’hyperthermie supérieure à 39°C, la tachycardie supérieure à 140/min, les hémoptysies, les épanchements pleuraux et la leucopénie. L’évolution clinique rapidement défavorable dans plus de la moitié des cas conduisait vers un décès rapide en moyenne moins de 5 jours après le début de l’hospitalisation. Le taux de survie des patients PVL+ était de 25% contre 53% pour les patients PVL-. Néanmoins, la différence en terme de survie n’était statistiquement significative que pour le sous-groupe des patients ne présentant pas de co-morbidité. Dans une étude plus récente, basée sur l’analyse d’une cohorte de 50 patients, nous avons montré que les facteurs de mauvais pronostic de la pneumonie nécrosante à S. aureus PVL+ étaient essentiellement la leucopénie et dans une moindre mesure la présence d’hémoptysies. Bien que d’autres études aient montré des résultats similaires et que notre groupe ait mis en évidence le rôle de la PVL dans un modèle murin de pneumonie nécrosante, le rôle de la PVL en tant que facteur de gravité indépendant dans les pneumonies à S. aureus reste un sujet de controverse. En se basant sur une prévalence de portage nasal de 25%, le nombre de souches de S. aureus PVL+ circulantes en France pourrait être d’environ 0,6 Millions. Cependant sur la base des déclarations spontanées au CNR des staphylocoques, moins de 30 cas de pneumonie à S. aureus PVL+ sont notifiés annuellement en France. Ceci nous permet de postuler que les patients présentant ces infections extrêmement sévères pourraient avoir une susceptibilité particulière pour cette bactérie. Par ailleurs, la prévalence de la résistance à la méticilline des souches responsables de pneumonies nécrosantes, qui oriente la stratégie du traitement probabiliste, reste imprécise et a doublé entre l’étude de 2002 (6,2%) et celle de 20072 (12%). Dès lors, plusieurs questions se posent : - La PVL est-elle un facteur indépendant de mauvais pronostic des pneumopathies communautaires graves à S. aureus. - Quels sont les facteurs (cliniques, biologiques, thérapeutiques) de pronostic favorable associés à la maladie? - Quel est le niveau de sensibilité aux antibiotiques des souches de pneumonie nécrosante ? - Existe-t-il une susceptibilité génétique de l’hôte à l’origine de la rareté et de la sévérité de cette maladie ? Afin de répondre à ces questions ce projet de recherche comportera un volet observationnel et un volet immunogénétique. Tous les hôpitaux français seront sollicités pour rapporter les cas définis comme une pneumonie communautaire sévère (nécessitant une hospitalisation) à S. aureus producteur ou non de PVL. Sur la base d’une fréquence attendue de PVL de 10%, le calcul du nombre de sujets nécessaires pour mettre en évidence une surmortalité d’un facteur 2 (risque relatif de 2.5) avec une puissance de 80% et un risque α de 5% donne un nombre minimum de sujets à inclure de 97 patients PVL+ et 97 patients PVL-. L’étude sera donc réalisée sur une période de trois ans afin d’avoir le nombre de sujet requis permettant des analyses statistiques appropriées. Les caractéristiques de la population étudiée seront analysées par des tests de statistiques descriptives tels que pourcentages, test de Chi-2, test t de Student, et l’analyse de la variance. Les déterminants associés au pronostic seront analysés par des modèles de survie univariés et multivariés (Cox). Si ces modèles ne peuvent être appliqués pour cause de durée d’observation, une approche par régression logistique pourrait être une alternative. La partie immunogénétique comprendra 40 patients présentant une pneumonie communautaire sévère à S. aureus producteur de PVL et 130 membres de leurs familles et consistera à une prise de sang et un entretien médical. L’arbre généalogique de la famille sera réalisé dans le cadre de cette étude. Des analyses spécifiques de génétique épidémiologique (analyse de liaison génétique) seront menées si l’échantillon recueilli le permet. Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 -5-
1. INFORMATIONS GENERALES
- Le numéro d’enregistrement de la recherche : 2010-A01132-37
- Le titre complet de la recherche : Leucocidine de Penton Valentine : Facteur indépendant de gravité
des pneumonies à Staphylococcus Aureus.
Le nom et les coordonnées du promoteur : Hospices Civils de Lyon, Délégation à la Recherche Clinique et à
l’Innovation. 3, quai des Célestins. BP2251, 69229 LYON Cedex 02 ;
Le nom et la qualité de la ou des personnes autorisées à signer le protocole et ses modifications éventuelles
au nom du promoteur : Mme Odile GELPI, DRCI – Hospices Civils de Lyon
- Le nom, la qualité et les coordonnées du responsable de la recherche agissant pour le compte du
promoteur : Mme Odile GELPI, DRCI – Hospices Civils de Lyon ;
- Le nom et la qualité du ou des investigateurs et les coordonnées du ou des lieux de recherches.
Investigateur principal : Pr. François Vandenesch
Centre National de Références des Staphylocoques
Centre de Biologie et Pathologie Est
59 bd Pinel
69677 Bron cedex
Tel: (33) (0)4 72 35 72 52
Fax: (33) (0)4 72 35 73 35
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Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 -6-2. JUSTIFICATION SCIENTIFIQUE ET DESCRIPTION GENERALE DE LA RECHERCHE 2.1. INTRODUCTION Staphylococcus aureus est une bactérie commensale de l’homme et des animaux à sang chaud qui colonise environ 30% des sujets caucasiens principalement au niveau nasal [Wertheim et al. 2005]. Cette bactérie est aussi l’une des principales bactéries pathogènes de l’homme chez qui elle entraine un très large spectre d’infections suppuratives (cutanée, pulmonaire, cardiaque, osseuse, osteo-articulaire, ...) et de maladies toxiniques, aussi bien dans un contexte nosocomial que communautaire [Lowy et al. 1998]. Parmi les infections pulmonaires à S. aureus, la pneumonie nécrosante à S. aureus producteur de PVL est une entité clinique décrite pour la première fois en 2002 par l’équipe du Centre National de Référence des Staphylocoques à Lyon [Gillet et al. 2002]. Cette infection sévère survient préférentiellement chez des enfants ou des adultes jeunes (âge médian 14.8 ans) avec d’emblée un tableau clinique bruyant nécessitant souvent une hospitalisation en soins intensifs. L’évolution clinique est rapidement défavorable dans plus de la moitié des cas avec l’apparition d’une détresse respiratoire aigue puis d’une défaillance multi-viscérale qui évolue vers un décès rapide en moyenne moins de 5 jours après le début de l’hospitalisation. La leucocidine de Panton-Valentine (PVL) est une exotoxine synergohymenotropique (action synergique de deux composés LukS-PV et LukF-PV) appartenant à la famille des toxines formant des pores. LukS-PV et LukF-PV sont codés sur divers bactériophages comme phi SLT, phi PVL et d’autres [Narita et al. 2001]. In vitro, la PVL induit une lyse des cellules sanguines mononuclées de l’hôte comme les polynucléaires neutrophiles, les monocytes et les macrophages [König et al. 199]. Des concentrations sub-lytique de PVL purifiée induisent une libération importante d’histamine par les basophiles et stimulent la libération par les neutrophiles d’enzymes (β-glucuronidase et lysozyme), de cytokines chimiotactiques (leukotrien-B4 and interleukin-8) et de métabolites oxydatifs. Plus récemment, nous avons montré qu’à forte dose (200 nM), la PVL a un effet nécrotique sur les polynucléaires humains tandis qu’à faible concentration (5 nM), elle induit une apoptose dépendant de la voie mitochondriale et relevant des caspases 9 et 3 sans intervention de la voie initiée par les récepteurs de mort [Genestier et al, 2005]. Les souches de S. aureus hébergeant la PVL sont classiquement associées à des infections cutanées comme les furoncles, des infections ostéo-articulaires sévères et des pneumonies nécrosantes [Lina et al. 1999; Dohin et al. 2007]. Les S. aureus producteurs de PVL représentent environ 3% des souches de S. aureus, ce qui constitue une population importante de souches PVL+ circulante si l’on se base sur une prévalence du portage nasal à S. aureus d’environ 25% [Wertheim et al. 2005]. Ainsi, en France, le nombre de souches circulantes PVL+ pourrait d’être d’au moins 0,6 millions. Cependant, malgré cette prévalence importante le nombre des pneumonies nécrosantes associées à cette bactérie est très faible, estimé à environ 30 cas par an en France sur la base des déclarations spontanées au CNR des Staphylocoques (données du CNR, site web : http://nte- serveur.univ-lyon1.fr/hcl2004/CNR_staphylocoques/). Cette constatation nous permet de postuler que les patients qui présentent ces infections extrêmement sévères pourraient avoir une susceptibilité particulière pour cette bactérie. Nous formulons donc l’hypothèse que ces patients présentent un déficit immunitaire les rendant susceptibles aux pneumonies nécrosantes à S. aureus producteurs de PVL. Ce déficit pourrait toucher les voies de la réponse inflammatoire entraînant une réponse déficiente de l’hôte à l’infection ou au contraire à une sur- activation de la réponse inflammatoire avec production exagérée de cytokines. 2.2. DONNEES DE LA LITTERATURE ET PRE-REQUIS 2.2.1. La pneumonie nécrosante à S. aureus PVL+ En 2002, Gillet et al. ont décrit pour la première fois l’association entre les pneumopathies nécrosantes sévères et les souches de S. aureus producteur de PVL [Gillet et al. 2002]. Dans cette étude, les caractéristiques cliniques et biologiques de 16 cas de pneumonies communautaires dues à des souches PVL+ ont été comparées à 33 cas de pneumonies communautaires dues à des souches PVL-. Les pneumopathies à S. aureus PVL+ étaient associées à un âge de survenue très inférieur à celui des patients avec pneumonies à S. aureus PVL– (14,8 ans contre 70,1 ans) ; un antécédent d’épisode pseudo-grippal était retrouvé de façon significativement plus importante dans les deux jours précédant l’infection bactérienne chez les patients présentant une pneumopathie à S. aureus PVL+. Par ailleurs, les caractéristiques cliniques associées aux pneumopathies à S. aureus PVL+ étaient l’hyperthermie supérieure à 39°C, la tachycardie supérieure à Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 -7-
140/min, les hémoptysies, les épanchements pleuraux et la leucopénie. Enfin le taux de survie des patients présentant une pneumopathie à S. aureus PVL+ était considérablement abaissé par rapport aux patients PVL- (25% contre 53%). Néanmoins, la différence en termes de survie n’était statistiquement significative que pour le sous-groupe des patients ne présentant pas de co-morbidité, vraisemblablement en raison d’un effectif insuffisant. L’autopsie des patients décédés de pneumopathie nécrosante révélait une nécrose extensive de l’épithélium respiratoire avec la présence d’une hémorragie intra-alvéolaire massive et une forte adhésion de cocci à Gram positif. Dans une étude plus récente, sur la base de l’analyse d’une cohorte de 50 patients colligée par le CNR, il a été montré que le principal facteur clinique associé à une évolution défavorable était l’hémoptysie et le principal facteur biologique était la leucopénie. En analyse multivariée le seul facteur indépendamment associé à un pronostic défavorable est la leucopénie (0 à 1000 GB à l’admission, [risque relatif (95% CI) = 7.38 (1.6- 34.02)] et une érythrodermie dans les 24 premières heures [risque relatif (95% CI)= 2.84 (0,94-8,56)] [Gillet et al. 2007]. Si l’érythrodermie ne trouve pas d’explication physiopathologique, en revanche l’hémoptysie témoigne de l’étendue de la nécrose alvéolaire alors que la leucopénie pourrait témoigner de l’action directe de la PVL qui est bien documentée in vitro [Genestier et al. 2005]. Bien que d’autres études cliniques aient montré des résultats similaires en terme de sévérité des pneumonies à S. aureus PVL+ [Kallen et al. 2009], le rôle de la PVL en tant que facteur de gravité indépendant dans les pneumonies à S. aureus reste un sujet de controverse, notamment pour certains auteurs américains sur la base d’études in vitro [Bubeck-Wardenburg et al. 2008 ; Voyich et al. 2006 ; Villaruz et al. 2009] 2.2.2. Aspects thérapeutiques Sur le plan thérapeutique, il n’existe pas de consensus pour le traitement de ces pathologies invasives et sévères [Morgan et al. 2007]. On constate, sur les séries de patients étudiés, qu’il n’y a pas de différence en terme de pronostic entre les patients ayant reçu un traitement antibiotique adapté d’emblée au microorganisme par rapport aux patients ayant reçu un traitement inapproprié. In vitro, certains antibiotiques inhibent la synthèse de PVL au niveau transcriptionnel alors que l’oxacilline en augmente l’expression [Dumitrescu et al. 2007] ; par ailleurs, les immunoglobulines polyvalentes contiennent à des taux utilisables en thérapeutique, des anticorps neutralisant l’action de la toxine sur les polynucléaires [Gauduchon et al. 2004]. Ainsi, certains auteurs préconisent pour le traitement des infections sévères à S. aureus producteurs de PVL, des antibiotiques à activité anti-toxinique comme le linézolide et la lincomycine [Rubinstein et al. 2008]. De plus, par analogie avec le traitement du syndrome de choc toxinique du au Streptocoque A, des traitements par immunoglobulines polyclonales intraveineuses ont été essayés avec parfois des améliorations cliniques spectaculaires. Aucune de ces thérapeutiques n’a été testée dans un essai clinique randomisé en raison de la rareté des pneumonies nécrosantes à S. aureus producteurs de PVL. C’est pourquoi l’évaluation rétrospective des mesures thérapeutiques reçues par les patients est pertinente afin d’essayer de dégager les traitements associés à une évolution clinique favorable. Cependant, une telle évaluation n’est possible que si la cohorte de patients est importante. Enfin, l’efficacité antibiotique, notamment dans le cas d’un traitement probabiliste, est à priori étroitement dépendante du niveau de résistance bactérienne aux antibiotiques. Ainsi, la prévalence de la résistance à la méticilline des souches responsables de pneumonies nécrosantes est une donnée importante à connaitre. Dans l’étude princeps de 2002, seulement une (6,2%) des 16 souches référées au CNR de 1986 à 1999 était résistante à la méticilline [Gillet et al. 2002]. Cette proportion passe à 6 (12%) des 50 souches référées entre 1986 et 2005 [Gillet et al. 2007], pour atteindre 18 (54%) des 33 souches référées au CNR en 2007 et 2008 (données du CNR). On notera que les souches résistantes à la méticilline appartiennent dans la quasi totalité des cas au clone européen de SARM communautaire ST80 dont la prévalence reste par ailleurs faible dans les hôpitaux français avec seulement 1.6% de SARM PVL parmi les 6614 SARM étudiés par le réseau ONERBA en 2008 [Robert et al ; données non publiées]. 2.2.3. Immunité innée anti staphylococcique L’immunité anti-staphylococcique nécessite la présence de polynucléaires neutrophiles et de cellules phagocytaires permettant entre autres une reconnaissance par les récepteurs de l’immunité innée, une destruction du pathogène et une production de cytokines pro-inflammatoires entraînant l’initiation et la propagation de la réponse inflammatoire. Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 -8-
Plusieurs déficits immunitaires héréditaires (DIH) sont connus pour entraîner une susceptibilité accrue aux
infections à Staphylocoque [Bustamante et al. 2008]. Ces pathologies sont des déficits primitifs de l’immunité
qui se compliquent pour la plupart d’infections invasives ou récurrentes dés la petite enfance. Les enfants
atteints de ces déficits présentent fréquemment des abcès et des pneumopathies à S. aureus mais également
des infections à d’autres pathogènes comme les autres pyogènes, certaines mycobactéries, ou encore des
champignons.
Le complément est composé de trois voies, la voie classique (C1, C2 et C4), la voie alternative (properdine,
facteurs I, H et D) et la voie des lectines (mannose-binding protein ou MBP). Ces trois voies convergent sur
le C3 et le complexe d’attaque membranaire (C5-C9). Si le complément joue un rôle essentiel dans
l’immunité anti-pneumococcique par sa participation à l’opsonisation [Picard et al. 2003b], son implication
dans l’immunité anti-staphylococcique est moins établie et repose essentiellement sur des données
expérimentales chez la souris [Shi et al. 2004 ; Takahashi et al. 2005].
Les DIH pouvant être associés à des infections graves à Staphylocoque sont la granulomatose septique
chronique, les défauts d’adhésion leucocytaires (LAD de type 1, 2 et 3), les neutropénies congénitales, les
déficits de l’immunité innée (défaut complet en IRAK4 et en MyD88), et le syndrome d’hyper IgE
autosomique dominant (déficit hétérozygote en STAT3).
- La granulomatose septique chronique (CGD) (déficit en CYBB, en CYBA, en NCF1 et en NCF2)
est un déficit immunitaire touchant la phagocytose. Les phagocytes ne sont pas capables de produire des
anions superoxydes et des dérivés oxygénés bactéricides. Cette inactivité du complexe de la NADPH oxydase
entraîne une incapacité des phagocytes à tuer les micro-organismes préalablement endocytés. Les patients
atteints de CGD ont une susceptibilité à développer des infections bactériennes et fungiques Les germes les
plus fréquemment incriminés sont Staphylococcus aureus et S. epidermidis, des bactéries Gram négatif
comme Salmonella spp et Pseudomonas spp et des champignons du type Aspergillus et Candida.
- Les défauts génétiques de l’adhésion leucocytaire sont quant à eux caractérisés par un mauvais
recrutement et un défaut de migration des polynucléaires neutrophiles. La cause génétique la plus souvent
identifiée est le déficit autosomique récessif en CD18 ou LAD de type 1. Ces déficits immunitaires se
compliquent par de fréquentes infections à S. aureus ainsi que par des infections fongiques. Le LAD de type
2 est également un déficit autosomique récessif secondaire à une anomalie de glycosylation de la sélectine, qui
est le ligand de CD18/CD11, les patients présentent également des infections, mais ils présentent aussi un
retard mental et statural. Le LAD de type 3 a une transmission autosomique récessif et est dus à une anomalie
du gène KINDLIN3/FERMT3 qui code pour une molécule intra cytoplasmique nécessaire à l’interaction avec
CD18/CD11, les patients présentent également des infections, mais ils présentent aussi un syndrome
hémorragique Glanzmann-like [Svensson et al. 2009].
- Les neutropénies congénitales sont définies par une diminution permanente ou intermittente des
polynucléaires neutrophiles circulants dans le sang. Plusieurs causes génétiques ont été identifiées, en
particulier les gènes codant l’élastase neutrophile ELA2, le proto-oncogène GFI1 et la protéine mitochondriale
HAX1 [Ward & Dale 2009]. L’ensemble de ces neutropénies congénitales se compliquent d’infections
bactériennes en particulier à S. aureus (abcès sous-cutanés, abcès tissulaires et pneumopathies).
Les déficits de l’immunité innée sont induits par un défaut dans les voies de signalisation des Toll-like
récepteurs et des récepteurs de la famille de l’IL-1/IL-18 dus à des déficits autosomiques récessifs en IRAK4
ou MyD88 [Picard et al. 2003a]. Ces anomalies génétiques se compliquent dans 27,5% des cas d’infections à
S. aureus, avec principalement des abcès tissulaires (hépatiques, cérébraux), des lymphadénites, des cellulites,
et des endophtalmies. Chez ces enfants les infections invasives à S. aureus représentent 16,7% des infections
[Communication personnelle].
Le syndrome hyper-IgE est un déficit immunitaire impliquant des mutations hétérozygotes du gène STAT3
[Minegishi et al. 2007]. La molécule STAT3 est impliquée dans la signalisation de nombreuses cytokines
telles que l’IL-10 et l’IL-6, mais aussi les cytokines reconnues par le récepteur de l’IL-6, la gp-130 (IL-6, IL-
11, IL-27, IL-31, OSM, CNTF et CT-1). Sur le plan infectieux, les patients se caractérisent par la survenue
d’abcès « froids » cutanés récurrents à staphylocoque et de pneumopathies bactériennes ou fongiques, et par
une augmentation importante des immunoglobulines E.
Enfin, récemment, un auto-anticorps anti-IL6 a été identifié chez un enfant présentant des infections cutanées
et sous-cutanées récurrentes à Staphylocoque, il semble que cet auto-anticorps entraine une déficience de la
Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 -9-réponse inflammatoire contre ce pathogène [Puel et al. 2008]. Il est intéressant de noter que ce déficit semble
être spécifique de S. aureus puisque cet enfant n’a présenté aucune infection sévère à d’autres pathogènes.
Certains des DIH décrits précédemment peuvent être associés plus particulièrement à des pneumopathies à
Staphylocoque. Il s’agit de la granulomatose septique chronique, des défauts génétiques de l’adhésion
leucocytaire, des neutropénies congénitales et des syndromes hyper-IgE. Ces observations renforcent notre
présomption qu’il existe des anomalies génétiques rendant certains sujets susceptibles aux infections à S.
aureus et en particulier aux formes graves représentées par les pneumopathies nécrosantes. En effet, dans ces
déficits, le bon fonctionnement de la phagocytose est compromis par un défaut quantitatif du nombre de
polynucléaires neutrophiles, un défaut de chimiotactisme, un déficit de l’explosion oxydative ou de la
sécrétion de cytokines. Le rôle des polynucléaires neutrophiles ainsi que les différents aspects de la
phagocytose semblent donc particulièrement intéressants à étudier chez les patients présentant une
pneumopathie nécrosante à S. aureus à la recherche d’un déficit entraînant une susceptibilité à ce pathogène.
Comme indiqué plus haut, les données in vitro suggèrent que le polynucléaire représente une étape clé dans la
physiopathologie des infections à S. aureus PVL+ [König et al. 1995]. Chez les souris présentant une
infection profonde à S. aureus, MIP-2 (Macrophage inflammatory protein produite par les macrophages et
recrutant les polynucléaires neutrophiles) et KC (équivalent murin de l’IL8, produite par les PMN et les
macrophages) sont détectées en quantités significativement plus importantes chez les souris infectées par les
S. aureus PVL+ par rapport aux PVL-. De plus, la comparaison de différentes lignées de souris quant à leur
susceptibilité à l’infection par les S. aureus PVL+ révèle une corrélation entre la sévérité clinique et la
production de KC (IL8), MIP-2, ainsi que l’activité myéloperoxidase tissulaire [Tseng et al. 2009]. Enfin,
cette même étude a comparé l’effet de l’âge des souris sur la susceptibilité à l’infection et a montré que par
rapport à des souris jeunes (10 semaines), les souris âgées (6 mois) font des infections moins sévères, avec
moins de production de KC et de MIP-2, et un recrutement plus faible des polynucléaires. Cette observation
est en accord avec le jeune âge des patients présentant une pneumonie nécrosante et suggère que la sévérité de
l’infection à S. aureus PVL+ pourrait être liée à une capacité accrue des sujets à établir une intense réaction
inflammatoire.
2.3. DESCRIPTION DE LA POPULATION D’ETUDE
Il s’agit d’une étude de cohorte comportant un volet observationnel et un volet interventionnel
immunogénétique. Le projet de recherche observationnelle sera réalisé en milieu hospitalier chez des enfants
et adultes hospitalisés pour une pneumopathie à S. aureus dans une unité de réanimation ou de surveillance
continue. L’étude comporte par ailleurs la constitution de deux collections :
- l’une au Centre de Biotechnologie Cellulaire du CBPE de Lyon : ADN et cellules à partir de
prélèvement sanguins
- l’autre au CNR des staphylocoques (CBPE, Lyon) : souches de S. aureus pour caractérisation
génétique des souches et sérum pour recherche d’anticorps anti-toxine.
La population de l’étude immunogénétique sera composée de 40 cas de pneumopathies nécrosantes à S.
aureus PVL + et les membres de leur famille.
Comme décrit plus haut, malgré la prévalence importante de souches PVL+, le nombre des pneumonies
nécrosantes associées à cette bactérie est très faible (estimé à environ 30 cas par an en France). Les patients
qui présentent ces infections extrêmement sévères pourraient donc avoir une susceptibilité particulière pour
cette bactérie. Le volet observationnel de ce projet nous permettra d’identifier les patients porteurs de souche
PVL+ et d’obtenir les informations cliniques nécessaires à la réalisation du volet génétique. Il est possible de
participer à l’étude observationnelle uniquement.
2.4. BENEFICES ET RISQUES PREVISIBLES
Il s'agit ainsi d'une étude sans bénéfice individuel direct pour le participant. La participation à cette étude
n’entraine aucun bénéfice.
La participation à l’étude observationnelle n’entraîne aucun risque supplémentaire pour le patient. Le
prélèvement de sang prévu dans le protocole sera effectué dans le cadre de la prise en charge habituelle du
patient. Pour la partie immunogénétique, le seul risque prévisible suite à l’inclusion des familles dans cette
Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 - 10 -étude est la survenue d’une ecchymose (un hématome) au niveau du point de ponction lors du prélèvement de sang. Un patch EMLA est envisagé pour les enfants. Les patients ayant déjà un accès veineux, il s’agira pour eux d’un prélèvement de sang supplémentaire. Il n’y aura aucune charge financière supplémentaire du fait de la participation à cette étude. Les frais liés à l’étude (visite, prise de sang) seront pris en charge par le promoteur. La recherche sera conduite conformément au protocole, aux bonnes pratiques cliniques et aux dispositions législatives réglementaires en vigueur 3. OBJECTIFS DE LA RECHERCHE 3.1. OBJECTIF PRINCIPAL Il s’agit de confirmer le rôle de la PVL comme facteur de gravité indépendant des pneumonies à S. aureus en comparant un groupe de patients hospitalisés en réanimation pour une pneumonie communautaire à S. aureus PVL+ avec un groupe de patients hospitalisés en réanimation pour une pneumonie communautaire à S. aureus ne produisant pas la PVL. 3.2. OBJECTIF SECONDAIRES - comparer les groupes de patients atteints de pneumopathies sévères à S. aureus PVL + avec évolution favorable et le groupe avec évolution défavorable (décès attribuable selon le médecin investigateur) afin d’identifier les facteurs associés au bon pronostic. Il s’agit d’étudier notamment les effets des différents traitements antibiotiques utilisés (antibiotiques à activité anti-toxinique versus sans activité anti-toxinique, délai d’administration) et des immunoglobulines polyvalentes. - étudier la proportion de SARM parmi les souches de S. aureus PVL + et étudier la distribution clonale des souches SARM et non SARM. - évaluer l'état immunitaire du patient vis à vis de la PVL au moment de la maladie : un prélèvement de sérum pour recherche d'anticorps anti-PVL sera réalisé à l'inclusion de tous les patients. Ces tests sont réalisés dans le cadre de la prise en charge habituelle des patients. - Grace au volet immunogénétique de ce projet de cohorte, nous allons rechercher une prédisposition génétique de type Mendélienne conduisant à une dysfonction de l’immunité innée. Ceci s'oppose aux prédispositions complexes détectées par des « single nucleotid polymorphisms » et nécessitant l'analyse de grandes séries de patients. La stratégie générale suivra celle qui a permis au laboratoire de Génétique Humaine des Maladies Infectieuses à la faculté Necker à Paris (GHMI-INSERM-U550) de découvrir les mutations impliquées dans la susceptibilité Mendélienne à développer des infections mycobactériennes disséminées, les infections invasives à pneumocoque, et plus récemment dans les encéphalites herpétiques [Bustamante et al. 2008 ; von Bernuth et al. 2008]. La pratique d'un bilan immunologique systématique face à une infection particulièrement inhabituelle et/ou sévère est de plus en plus recommandé par les réanimateurs qui s'intéressent à l'infectieux mais néanmoins, il n'y a pas de réel consensus permettant d'intégrer ce bilan a des examens "standard". Par conséquent, tous les patients de l’étude auront si possible un bilan immunologique standard comprenant un dosage pondéral des IgG, A et M ; un dosage des IgE et une exploration de la voie classique du complément. De plus, chez certains patients pédiatriques (âgés moins de 15 ans) et les patients issus de parents consanguins, une approche « circuit candidat » sera réalisée à la recherche de défauts fonctionnels dans certains circuits immunitaires impliqués dans la réponse à S. aureus, notamment les gènes impliqués dans l’immunité phagocytaire, les gènes impliqués dans la reconnaissance des bactéries et dans la réponse immunitaire innée. Ces défauts seront explorés sur les cellules sanguines +/- fibroblastes des patients suivant des méthodes dépendant des circuits à étudier. D’autres voies pourront être étudiées en fonction de l’évolution de projets de recherche actuellement en cours dans le laboratoire, notamment de la découverte de nouvelles voies de signalisation contrôlant l’immunité contre les bactéries pyogènes chez l’homme. Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 - 11 -
Le second axe de cette stratégie est une approche par criblage complet du génome qui permet de détecter l’effet de gènes dont le rôle était a priori inconnu. Cette approche sera possible si l’étude des caractéristiques des familles recueillies lors de notre étude permet d’identifier certaines familles avec un mode particulier de transmission génétique (en particulier des familles consanguines). Nous calculerons les valeurs attendues de lod-score dans le cadre d’une analyse de liaison génétique sur les familles ainsi identifiées, et, si l’approche par criblage complet se révèle possible, nous proposerons le projet au Centre National de Génotypage. Il est à noter que dans un contexte de familles consanguines, les méthodes d’analyse de liaison génétique par ‘homozygosity mapping’ sont très puissantes et peuvent être envisagées avec un très petit nombre de familles (3 à 4 familles) [Lander et al. 1987]. Pour les patients n’appartenant pas à des familles informatives pour la liaison génétique, deux approches complémentaires explorant le génome entier seront développées. La première fait appel à une étude pan-génomique du transcriptome de patients sélectionnés ayant présenté une pneumonie nécrosante à S. aureus. Cette stratégie a déjà été appliquée avec succès chez des patients présentant des déficits de l’immunité innée identifiés sur le plan moléculaire (déficits en IRAK-4, MyD88, NEMO, TLR3 et Unc93B) qui pourront servir de contrôles [von Bernuth et al. 2008]. La deuxième approche sera d’explorer les patients par un séquençage complet de leur exome (ensemble des régions codantes du génome). Il s’agit d’une nouvelle technique qui sera très bientôt disponible à une large échelle et qui est très performante pour identifier des mutations rares dans les maladies mendéliennes [Ng et al. 2009]. Tous les outils et concepts d’épidémiologie génétique requis pour ce projet sont disponibles au laboratoire de GHMI et l’institut Baylor qui a une grande expérience et une expertise internationalement reconnue dans ce domaine. 4. CONCEPTION DE LA RECHERCHE 4.1. CRITERES D’EVALUATION On rappel que l’objectif principal est d’évaluer l’impact de la PVL+ sur le pronostic des pneumonies. Ainsi, le critère d’évaluation principal est la survie des patients en fonction du caractère PVL+ ou PVL- des souches de S. aureus isolées. Seront par ailleurs analysés, en fonction du caractère PVL, les critères d’évaluation secondaires comme, les scores de gravité (IGS2 et SOFA chez l’adulte, PIM2 et PLEOD chez l’enfant), et la durée (en jours) de séjour en réanimation et en hospitalisation. Pour le volet immunogénétique, le critère d’évaluation secondaire est la présence d’une prédisposition génétique de type Mendélien ou de caractère polymorphique, parmi les patients présentant une pneumonie nécrosante PVL+. 4.2. METHODOLOGIE DE LA RECHERCHE Ce projet de recherche comportera une étude prospective observationnelle en milieu hospitalier chez des enfants et adultes hospitalisés pour une pneumopathie à S. aureus dans une unité de réanimation ou de surveillance continue et une étude immunogénétique incluant tous les cas de pneumopathies nécrosantes à S. aureus PVL+ et leur famille. 4.3. DEROULEMENT DE LA RECHERCHE 4.3.1. Mode de recrutement des patients Il s’agira d’inclure des cas incidents ayant présenté une pneumopathie communautaire sévère à S. aureus entrainant une hospitalisation. Le recueil d’informations cliniques et biologiques ainsi que l’enquête à visée génétique débuteront pendant l’hospitalisation. Les cas sont définis par la présence de signes de pneumopathie (toux, expectoration, douleurs thoracique, infiltrat pulmonaire sur la radiographie) et l’isolement de S. aureus comme seul agent pathogène. Les souches de S. aureus seront adressées au CNR qui dispose des tests de diagnostique rapide (3h) et seront testées pour la recherche de production de toxine PVL. Si le centre dispose de ces méthodes de diagnostic, celles ci pourront être réalisées sur place. Dans tous les cas, ces tests sont réalisés dans le cadre de la prise en charge habituelle des patients. Si le proposant est diagnostiqué PVL+, il lui sera demandé de participer à l’étude immunogénétique de même que ses parents et sa fratrie. Les critères de participation à l’étude seront vérifiés par le médecin investigateur du centre où le patient est hospitalisé. Les parents des proposants mineurs seront prévenus par le médecin clinicien lors d’un entretien et par le formulaire d’information (Annexe 1) qui exposera la démarche de l’enquête. Lors de cet entretien le formulaire de consentement éclairé (Annexe 2) sera signé par les parents. Les sujets mineurs Pneumonies à S. Aureus, version du 30/12/2011 - 12 -
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