Visualisation des protéines de réparation de lʼADN avec le microscope confocal FV3000
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Online Version Notes d'application mai 25 2022 Visualisation des protéines de réparation de lʼADN avec le microscope confocal FV3000 Imagerie de cellules U2OS vivantes après des lésions de lʼADN provoquées par un laser Les ruptures bicaténaires de lʼADN constituent lʼune des formes de dégâts causés à lʼADN les plus nocives. En réaction aux dégâts, les voies de réponse aux dommages de lʼADN (DDR, pour DNA Damage Response) dans la cellule se déclenchent et entraînent la mobilisation de facteurs DDR sur le site de rupture, ainsi que la signalisation des points de contrôle du cycle cellulaire et la régulation des activités de réparation de lʼADN. Une signalisation et une réparation immédiates et précises du site de rupture sont essentielles à la viabilité de la cellule et pour empêcher les mutations pouvant aboutir au développement dʼun cancer. Par conséquent, la compréhension des mécanismes intervenant dans le processus de réparation de lʼADN est dʼune importance vitale. Dans cette application, nous avons utilisé des cellules épithéliales cancéreuses dʼostéosarcome humain (U2OS) pour étudier le recrutement des protéines de réparation de lʼADN après des dégâts provoqués par un laser, notamment des ruptures bicaténaires de lʼADN, à lʼaide du microscope confocal FV3000. Les images ainsi obtenues nous ont permis (1) de déterminer les propriétés cinétiques et les niveaux dʼaccumulation des protéines de réparation sur les sites de rupture, et (2) de caractériser la colocalisation des régulateurs de transcription endogènes et les facteurs des voies DDR sur les sites de rupture dʼADN. Copyright 2022 EVIDENT, All rights reserved. Page 1 / 6
Figure 1 : Schéma du protocole expérimental LʼADNc de MRE11 a été cloné dans un vecteur dʼexpression marqué à la GFP, qui a ensuite transféré dans des cellules U2OS. Après une sensibilisation par bromodéoxyuridine (BrdU) ou Hoechst, on induit des lésions de lʼADN par un balayage linéaire de la région dʼintérêt dans le noyau à lʼaide du laser de 405 nm du microscope FV3000. On réalise alors une imagerie des cellules vivantes à lʼaide du laser de 488 nm afin de suivre la cinétique du recrutement de la protéine MRE11 pour répondre aux dégâts causés par le laser. Conditions dʼimagerie Objectif : objectif à immersion dans lʼhuile super-corrigé X60 (PLAPON60XOSC) Microscope : Microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW FV3000 Lasers : 405 nm (stimulation de la région dʼintérêt), 488 nm (GFP, vert) Copyright 2022 EVIDENT, All rights reserved. Page 2 / 6
Imagerie de cellules vivantes sûre pour les échantillons en vue de
réaliser des mesures
Lʼexposition répétée à la lumière dʼexcitation laser au cours dʼune imagerie par intervalles de temps
réguliers peut provoquer un photoblanchiment et la phototoxicité, ce qui a des conséquences sur la
capacité à obtenir des mesures de données quantitatives lors de lʼexpérience. Dans notre protocole,
nous avions besoin de trouver un compromis entre une stimulation laser puissante et une imagerie
de cellules vivantes sûre pour les échantillons, afin de capturer de manière quantifiable la dynamique
des protéines de réparation immédiatement après des dégâts causés à lʼADN par le laser. Pour cela,
nous avons utilisé le microscope confocal FV3000 qui, grâce à la technologie de détection
TruSpectral dʼOlympus et aux détecteurs GaAsp à sensibilité élevée, minimise la puissance laser
requise pour lʼimagerie continue des cellules vivantes. De plus, nous avons utilisé TruFocus pour
maintenir la mise au point tout au long de lʼexpérience dʼimagerie. Ensemble, ces technologies nous
ont permis dʼobtenir des données par intervalles de temps réguliers précises, que nous avons pu
quantifier pour déterminer lʼaccumulation du facteur DDR MRE11 sur les sites de rupture dʼADN à la
suite de lésions.
Video: appnote-movie_visualizing-
dna-repair-proteins.mp4
Figure 2 : Accumulation de MRE11 sur le site de rupture de lʼADN à la suite de lésions
Des cellules U2OS exprimant la protéine MRE11 marquée à la GFP ont été soumises à des lésions
de lʼADN causées par un laser de 405 nm. Une imagerie de la GFP par intervalles de temps réguliers
a ensuite été réalisée avec le laser de 488 nm. Les images des cellules ont été enregistrées pendant
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6 minutes à intervalles de 20 secondes afin de visualiser et de quantifier la localisation de MRE11
avant et après les lésions de lʼADN.
Lʼobjectif super-corrigé permet une analyse précise de la
colocalisation
En plus dʼétudier les paramètres cinétiques du recrutement de MRE11 sur les sites de rupture des
brins dʼADN, nous avons également examiné les réponses de la protéine γH2AX, une histone qui
est phosphorylée au niveau des ruptures bicaténaires de lʼADN et qui active les voies DDR, ainsi que
de CHD4, une protéine qui joue un rôle important dans la régulation transcriptionnelle épigénétique.
Pour réaliser des études de colocalisation précises, il est important de minimiser les aberrations
chromatiques qui peuvent provoquer un glissement latéral significatif des différents canaux
dʼacquisition. Pour minimiser les effets des aberrations chromatiques dans nos études de
colocalisation, nous avons utilisé lʼobjectif Olympus PLAPON60XOSC2 avec super-correction des
aberrations chromatiques afin dʼobtenir des images de colocalisation fiables présentant des
aberrations chromatiques latérales et axiales extrêmement faibles. Cela nous a permis de déterminer
que CHD4 et γH2AX colocalisent sur les sites de lésions de lʼADN dans le noyau.
Figure 3 : Recrutement de protéines endogènes de réparation des lésions de lʼADN lors des
ruptures des brins dʼADN
Détection des protéines endogènes CHD4 (vert, Alexa Fluor 488) et γH2AX (rouge, Alexa Fluor
594) dans des cellules épithéliales cancéreuses U2OS dʼostéosarcome humain après des lésions de
lʼADN causées par un laser. Lʼimage fusionnée représente la colocalisation des protéines CHD4 et
γH2AX.
Lʼapport du microscope confocal FV3000 pour notre expérience
Le système entièrement spectral avec détecteurs GaAsP haute efficacité offre la
grande sensibilité nécessaire à lʼimagerie des cellules vivantes
Le microscope FV3000 repose sur la technologie de détection TruSpectral dʼOlympus, qui diffracte
la lumière en la transmettant à travers une unité holographique de phase volumique. Cette
technologie permet dʼobtenir une luminosité largement supérieure par rapport aux unités de
détection spectrale conventionnelles équipées de réseaux de type à réflexion. Le détecteur haute
sensibilité (HSD) à deux canaux du microscope FV3000 utilise la technologie TruSpectral avec des
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photomultiplicateurs GaAsP refroidis par effet Peltier pour une efficacité quantique élevée (45 %) et
un rapport signal/bruit élevé. Lʼassociation de ces technologies de détection permet une détection
haute sensibilité et minimise la puissance laser requise pour lʼobservation de tissus vivants.
Objectif super-corrigé PLAPON60XOSC2 pour une analyse de colocalisation fiable
avec peu dʼaberrations chromatiques
Cet objectif à immersion dans lʼhuile minimise les aberrations chromatiques latérales et axiales sur le
spectre de 405 à 650 nm. Les images de colocalisation sont acquises de manière fiable, et les
images sont mesurées avec une précision de position supérieure. Lʼobjectif compense également les
aberrations chromatiques sur le proche-infrarouge jusquʼà 850 nm, ce qui le rend avantageux pour
lʼimagerie quantitative.
Objectif à faibles aberrations chromatiques
Grossissement : 60X
ON : 1,4 (immersion dans lʼhuile)
D.T. : 0,12 mm
Plage de compensation de lʼaberration chromatique : 405–650 nm
Maintien de la mise au point avec le système TruFocus dʼOlympus
Le module TruFocus utilise une lumière infrarouge à phototoxicité minimale (laser de classe 1) afin
dʼidentifier la position du plan de lʼéchantillon. Le mode de mise au point automatique (AF) one-shot
permet à lʼutilisateur de définir plusieurs positions de mise au point selon les besoins pour les
échantillons plus profonds, pour des acquisitions en focus stacking efficaces dans les expériences à
positions multiples.
Commentaire du Dr Kyle Miller
Fluorescence imaging is a widely used technique in DNA
damage signaling and repair studies to analyze the localization
and kinetics of DNA damage response factors to DNA damage
sites. Obtaining this information has been critical in identifying
how these factors detect and repair DNA lesions at single cell
resolution. The FV3000 microscope has allowed Dr. JaeJin Kim
and others in the Miller lab to generate DNA damage using
laser-microirradiation and study DNA damage response factor
behavior both in fixed and live cells. The availability of sensitive
Dr Kyle detectors, automatic focus capabilities, and super-corrected
Miller Dr JaeJin objectives has made the FV3000 microscope an effective
Kim instrument in conducting studies on DNA damage response
pathways in human cancer cells.
Remerciements
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Cette note dʼapplication a été rédigée avec lʼaide des chercheurs suivants :
Dr Kyle Miller et Dr JaeJin Kim, NMS, The University of Texas à Austin
Microscope confocal à balayage laser
FV3000
Disponible en configuration galvanomètre seul
(FV3000) ou hybride galvanomètre / résonant
(FV3000RS)
Nouvelle détection TruSpectral haute efficacité et
grande précision pour tous les canaux
Optimisé pour la prise dʼimages de cellules vivantes
avec une sensibilité élevée et une faible phototoxicité
Inverted and upright frame options to suit a variety of
applications and sample types
En appendre plus ▸ https://www.olympus-lifescience.com/laser-scanning/fv3000/
Dispositif de compensation de la dérive en Z
IX3-ZDC2
Toujours net
Conçu pour être facile à utiliser
Dédié à l'imagerie de cellules vivantes
Imagerie haute précision, multi-zones avec le logiciel
cellSens
En appendre plus ▸ https://www.olympus-
lifescience.com/microscopes/inverted/ix83/TruFocus/
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